专利名称：用于生产干燥、稳定的止血组合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生产储存稳定形式的止血组合物的方法。
背景技术：
根据例如WO 98/008550A或WO 2003/007845A已知一种干燥、储存稳定形式的止血组合物,所述止血组合物含有生物相容的、可生物降解的、干燥稳定的颗粒状材料。这些产品已经被成功应用于止血用领域中。Floseal 是用于有效的、多功能的止血剂的例子，其含有溶胀于含凝血酶的溶液中的颗粒状明胶基质，以形成可流动的糊剂。因为这样的产品需用于人体，因此必需为最终产品及其成分的质量、储存稳定性以及灭菌提供最高安全标准。另一方面，生产和处理应当尽量简便有效。如果止血组合物需要使用凝血酶组分，则在最终产品中提供这种凝血酶组分具有挑战性。由于凝血酶及基质 材料通常具有不同的与性能相关的生产要求，因此它们必须单独生产和供应。例如，相对稳定的颗粒状(经常也是交联的)基质材料与蛋白质组分例如凝血酶之间的灭菌要求明显不同。这样的基质材料通常可通过有效的灭菌方法进行灭菌(例如高压灭菌法、Y辐射等)，而凝血酶(作为酶)必须更小心地处理。那些有效的灭菌方法通常不能用于凝血酶，因为这样粗糙的处理会导致酶活性丧失。出于稳定性的原因，这类产品(以及根据本发明的产品)通常以干燥的形式提供，并且在使用前立即配成“即用”形式(其通常处于(水)凝胶、悬浮剂或溶液的形式)，这需要添加润湿剂或溶解(悬浮)剂以及混合基质材料组分与凝血酶组分。凝血酶复原或凝血酶溶液与颗粒状基质材料的混合步骤是通常需要一些时间及处理的步骤，从而会在尤其是重症监护时引起问题。本发明的目的在于解决这些问题，并且提供适用于生产干燥、储存稳定的止血组合物的方法，所述止血组合物可方便地提供及使用。这些方法应提供一种产品剂型，其可便利地提供“即用型”止血组合物，尤其是在操作步骤数应尽可能少的重症监护药品中。
发明内容
因此，本发明提供一种用于生产干燥、稳定的止血组合物的方法，所述方法包括a)提供第一组分，其含有凝血诱导剂的干制剂，如干凝血酶制剂，b)提供第二组分，其含有适用于止血的生物相容性聚合物的干制剂，c)在可有效形成湿糊剂、同时本质上通过所述第一组分抑制第二组分降解的条件下，在最终容器中混合所述第一组分和所述第二组分，或将所述湿的糊剂转移至最终容器中，d)在所述容器中冷冻并冻干所述糊剂，由此获得干燥、稳定的冻干形式的止血组合物，所述止血组合物含有所述第一组分和所述第二组分，以及e)将在所述最终容器中的所述干燥、稳定的止血组合物最终转变成可储存的药物产品作为干燥、稳定的止血组合物，所述可储存的药物产品含有组合形式的所述第一组分和所述第二组分。
本方法提供一种根据本发明的简便形式的干燥、稳定的组合物，所述组合物可容易地被复原(reconstitute)用于医疗用途。本发明进一步涉及一种将止血组合物运输至患者身体靶位的方法，所述方法包括将通过本发明的方法制备的止血组合物运输至靶位。另一方面，本发明涉及通过本发明所述的方法获得的最终容器(finished finalcontainer)。本发明还涉及一种用于提供即用型止血组合物的方法，其包括使通过本发明的方法制备的止血组合物与药学上可接受的稀释剂接触，以及一种包括最终容器和其他用于提供所述组合物的装置(如稀释剂容器)的试剂盒。根据本发明的组合物特别适用于出血部位的止血，包括外科手术出血部位、外伤性出血部位等。所述组合物的示例性用途是封住为了进行血管导管插入术而形成的血管穿透之上的组织束。
具体实施例方式本发明提供对止血组合物的运输和处理的改进，主要通过提供简便的单一组合物剂型的双组分产品。根据本发明的止血组合物含有包含凝血诱导剂的干制剂比如干凝血酶制剂(“凝血诱导剂组分”或“凝血酶组分”)的第一组分以及包含适用于止血的生物相容性聚合物的干制剂(“止血的生物相容性聚合物组分”)的第二组分。该止血组合物还可进一 步存在其他组分。这种产品在本技术领域中实质上是已知的，然而其以不同的剂型存在通常，这些组分作为单独体(separate entities)以干燥的形式被供给。在混合这些组分对患者给药之前，通常将这些干燥的组分分别与适宜的稀释剂接触。然后通过混合分别复原的组分来进行这些组分的混合。例如，可以提供一种凝血诱导剂比如凝血酶组分的干制剂，其被药学上可接受的(含水)稀释剂复原。然后，复原后获得的凝血诱导剂溶液，如凝血酶溶液，通常以水凝胶的形式被用于润湿或溶解所述聚合物，然后其被应用于患者。由于在该产品“即用”之前，这至少是两步方法，故如果产品在即用之前仅需要一个步骤，那将变得更简便。然而，如上所述，主要因为稳定性和活性的丧失，所述两种组分的性质阻碍了所述组分之间在制备方法过程中的简单混合。通过本发明，提供了一种制备方法，所述制备方法可以使得两种组分以组合、干燥形式被提供从而可一起被复原。根据本发明的方法不仅可应用于实验室内的科学实验，还适用于药品的大批量工业化生产。通过本发明，可以在没有不希望的降解或酶活性丧失的风险下提供这种已经混合的止血组合物。因为通过本发明可获得的产品在医学给药之前不再需要进行分别的复原和混合，故与以往已知的产品相比，所得的组合物具有储存稳定性、并且更便于处理。仅通过在最终容器中向组合物添加适宜的药学上可接受的稀释剂，就可以一步方法提供止血组合物的即用型水凝胶、悬浮剂或溶液。最终容器优选设计为接触稀释剂后直接将复原的止血组合物给药的注射器。凝血诱导剂是选自于包含凝血酶、蛇毒、血小板活化剂、凝血酶受体激活肽及纤维蛋白原沉淀剂的组中的物质，优选其为凝血酶。所述“凝血酶溶液”可以由任意的适用于人体(即药学上可接受的)的凝血酶制剂制得。适宜的凝血酶的来源包括人或牛血、血浆或血清(如果预期无免疫不良反应，则可应用其他动物来源的凝血酶)以及重组来源的凝血酶(如人的重组凝血酶);在某些应用上可优选自体人凝血酶。提供于第一组分中的凝血酶溶液的浓度通常被调整为复原的止血组合物中的设计的凝血酶浓度。优选止血组合物含有1(Γ100.000国际单位(I. U.)的凝血酶，更优选为10(Tl0. 0001. U.，尤其优选为50(Γ5. 0001. U.。优选“即用型”组合物中的凝血酶浓度处于10 10· 0001. U.的范围内，更优选为50 5· 0001. U.，尤其优选为100 1· 0001. U.。稀
释剂的用量为凝血酶达到在“即用型”组合物中所希望的终浓度。例如，根据WO 98/08550Α已知根据本发明的“生物相容性聚合物的干制剂”。优选所述聚合物为生物相容的、可生物降解的干燥稳定的颗粒状材料。根据本发明的“干燥的”聚合物通常以O. Γ5. 000 μ m的粒径被提供。通常，聚合物粒子具有1(Γ1000 μ m的平均粒径(“平均粒径”是通过激光衍射测得的中值粒径；“中值粒径”(或质量中值粒径)是将频率分布平分为二的粒径；给定制剂的颗粒的50%具有更大的直径，50%的颗粒具有更小的直径)，尤其优选为5(Γ500μπι (中值粒径)。是否应用更大的颗粒主要取决于医疗需求；在制备过程中平均粒径更小的颗粒通常更难处理。因此干燥的聚合物以颗粒状形式被提供。虽然术语“粉末”和“颗粒状”(或颗粒)有时被用来区分不同种类的材料，但此处粉末被定义 为颗粒状材料的一种特殊的子类。特别地，粉末指那些具有更细粒径的颗粒状材料，因此在流动时其具有更大的形成团块的倾向。颗粒包括除了润湿时以外不倾向于形成团块的更粗的颗粒状材料。根据本发明的“干燥的”止血组合物仅有残余量的水分，其近似相当于可比较的已有产品比如Floseal 中的水分含量(例如，Floseal，作为干燥产品时含有约12%的水分)。通常，根据本发明的干燥的组合物含有的残余水分含量低于这些产品，优选水分低于10%，更优选水分低于5%，特别优选水分低于1%。根据本发明的止血组合物也可含有更低的水分含量，如O. 1%或者甚至更低。优选根据本发明的干燥的止血组合物的水分含量为O. f 10%，尤其为O. 5 5%。根据本发明，止血组合物在最终容器中以干燥的形式被提供。通过使其为干燥形式，显著并适当地降低了组分的降解或失活的过程，使稳定的储存成为可能。适宜的储存稳定性可基于凝血酶的活性来确定。因此，如果其复原后以干燥形式在室温下(25° C)储存24个月后仍然存在不少于4001. U. /ml (相对于5001. U. /ml的产品)(即与冻干之前的初始活性相比，80%或更多的凝血酶活性得到保持)，则这种干燥的止血组合物是储存稳定的。优选根据本发明的组合物具有更高的储存稳定性，即24个月储存后至少90%的凝血酶的活性得到保持，尤其优选至少95%的凝血酶活性得到保持。然而，因为混合及冻干必须以可抑制聚合物和/或凝血诱导剂比如凝血酶的相关降解的方式进行，故将凝血诱导剂的溶液比如凝血酶溶液与生物相容性聚合物混合制成湿的糊剂，由此提供湿的糊剂，再将其冻干是很重要的。通过在最终容器中在本质上抑制降解的条件下实施混合步骤以及冷冻由混合工序制得的湿的糊剂，本发明可确保上述要求。然后组合物可以在没有进一步降解过程的风险下适当冻干。对本发明来说重要的是，使混合过程中以及冻干之前在糊剂中湿状态下的接触时间尽可能短(所述接触时间是凝血诱导剂溶液比如凝血酶溶液与聚合物之间的接触时间)。根据本发明的湿的状态期间的最大接触时间由各种参数决定，其是基于本领域的技术人员根据此处公开的信息能够容易地调整用于本发明方法的合适的接触时间。最重要的用于限定合适的接触时间的参数是温度、水分含量以及凝血酶浓度。例如，对于具有4ml凝血酶溶液与O. 8g聚合物的糊剂中的5001. E. /ml凝血酶溶液(例如含有水及相应的O. 704g干明胶粉的明胶颗粒)，在湿状态下(B卩，以糊剂形式)与所述聚合物的最大接触时间在约4°C、15°C及室温(25°C )下为25h、6h及2h。尤其用于本发明中的温度为约2V 约25°C，优选为约2V 15°C，尤其优选为约4°C。更高浓度的凝血诱导剂比如凝血酶，或更高的水分含量意味着湿状态期间更短的最大接触时间。因此，优选在湿状态下的接触时间为5mirT6h的范围，甚至更优选5mirT2h，尤其为5 30min。优选混合步骤在如f 10°C尤其优选2飞。C的低温下实施。也很重要的是根据本发明的混合步骤得到的湿的糊剂不含大量的液相，即根据本发明的糊剂几乎没有游离液体。根据本发明的湿的糊剂是可流动的(有一定程度的流动性)，但其也是足够粘稠的，以作为糊剂进行操作(例如，优选粘性为约KTlOOPa · s及以上)。这对于在冻干之前的混合过程中 抑制降解过程很重要。以溶解(悬浮)形式(不是根据本发明的糊剂形式)混合这些组分然后开始进行干燥工序会导致无法接受的材料的降解。例如，即使于4°C保存凝血酶及明胶，24h后也能观察到明显的降解。在这方面的另一个重要参数是混合步骤中的凝血诱导剂比如凝血酶组分的量。其必须足够高以形成湿糊剂，但又不能太高而形成大量的液相。因此，超过85% w/w的凝血诱导剂比如凝血酶溶液的添加量会导致在湿的糊剂中毫无意义的过剩的液体凝血诱导剂比如凝血酶，因此应当优选避免超过85% w/w。优选的混合比例从约80% w/w开始下降(SP80ml凝血酶溶液/20g干燥的聚合物)。通过测定最终的湿的糊剂的处理性能，可容易地调整更低含量的凝血诱导剂比如凝血酶含量用于特定聚合物。通常，接近于6(Γ80 %的凝血诱导剂溶液比如凝血酶溶液含量的糊剂更易处理；对于挤出混合物来说，较低含量的凝血诱导剂比如凝血酶含量也不会引起处理中的主要障碍。由于可能的流动性损失可导致处理它们时很棘手(例如在注射器中)，故以少于50%的凝血诱导剂溶液比如凝血酶溶液形成的湿糊剂可能变得棘手。因此，为了达到该目的，本发明原则上采用两种实施方式。第一原则包括在最终容器中混合两种组分，然后冻干所述混合物；另一种选择是在所述容器外混合这些组分以形成湿糊剂，然后例如通过挤出的方式将其转移至最终容器中。可以通过例如在两个连接的容器(如注射器)之间“倾倒”(Swoosh)或通过将两种组分加入挤出机中并将挤出产品挤进到最终容器中，来完成混合。优选将获得的混合物(即湿的浆料)冷冻及冻干。优选根据本发明的方法在无菌环境下实施，尤其是混合步骤应当无菌操作。也优选以已经适当灭菌的组分启动所述方法然后在无菌条件下进行后续所有的步骤。所述方法的最后步骤是完成步骤。在该步骤中，最终容器被适当密封并被制作成即存和/或即售。完成步骤包括给最终容器贴标签、包装及实施(进一步)灭菌工序(例如在最终容器上或在包含最终容器的包装产品或试剂盒上进行)。优选完成步骤包括EO (环氧乙烷)灭菌步骤。EO灭菌是本技术领域中所常见的。环氧乙烷气体杀灭细菌(及它们的芽孢)、霉菌及真菌。EO灭菌被用来对可被高温技术比如巴氏灭菌法或高压灭菌法破坏的物质进行灭菌。灭菌的其它优选实施方式是应用电离辐射比如β或Y辐射或使用过氧化氢蒸汽。根据优选实施方式，所述最终容器进一步含有一定量的可有效抑制聚合物因暴露于灭菌射线而变性的稳定剂，其优选为抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸的其他盐、或抗氧化剂。所述最终容器可以是任意的适于存放(及储存)药学上可给药的化合物的容器。可使用注射器、小瓶、管子等；然而，特别优选用注射器提供根据本发明的止血组合物。现有技术中也公开了注射器是优选的用于止血组合物的给药装置，原因在于注射器在医学应用上的操作优势。然后，可优选地通过特定的注射器的针管或通过适宜的导管应用所述组合物(复原之后)。还可通过许多其他装置，比如通过软膏刀、刷子、喷雾器、手动压力或任何其他的传统技术来应用复原的止血组合物(其优选被复原以形成水凝胶)。通常，根据本发明的复原的止血组合物的应用是通过使用注射器或类似的可通过开口(Orifice)、孔(Aperture)、针、管或其他通道将复原的组合物挤出以形成材料珠、层或类似的部分。通过经由注射器或其他点药器的孔的挤出，可以进行组合物的机械粉碎，所述孔典型地具有O. 01mnT5. Omm范围内的尺寸,优选为O. 5mnT2. 5mm。然而,优选所述止血组合物从具有预期粒径的干燥形式开始制备(尤其在通过水合作用进行复原时，干燥形式获得所需粒径的亚单元(如水凝胶亚单元))或在最终挤出或其他应用步骤之前被部分或全部机械粉碎至所需粒径。当然显而易见的是，为了满足人体使用的安全要求，这些机械组件必须以无菌形式被提供(内部及外部)。最终容器的设计优选适于最终容器中的冻干过程。
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根据本发明的干燥的止血组合物在使用之前，通常通过使干燥的组合物与适宜的稀释剂接触而被复原(复水)。根据本发明的稀释剂可以是任何对干燥的止血组合物适宜的复原介质，其允许干燥组合物适当的润湿。优选干燥的止血组合物被复原成水凝胶作为“即用”形式。适宜的稀释剂是药学上可接受的含水液体，例如药用级去离子水(若所有的离子组分或缓冲组分已经被提供于干燥的组合物中，则为“注射用水”)或含有特定的离子及/或缓冲剂的药用级水溶液。这些水溶液还可进一步含有其它成分，如赋形剂。“赋形剂”是一种被添加到溶液中的惰性物质，例如以确保例如凝血酶在储存(或灭菌(例如通过辐射))时保持其化学稳定性和生物活性，或出于美观的原因，例如颜色。优选的赋形剂包括人血白蛋白、甘露糖醇及乙酸钠。在复原的产品中优选的人血白蛋白的浓度为O. ri00mg/ml，优选为l^lOmg/mL·优选的甘露糖醇的浓度可以在0. 5、00mg/ml的浓度范围内，尤其是l(T50mg/ml ο优选的乙酸钠的浓度为l"10mg/ml的范围,尤其为2 5mg/ml。例如，适宜的稀释剂包括注射用水；以及彼此独立的NaCl (优选为5(Tl50mM，尤其是110mM)、CaCl2 (优选为10 80禮，尤其为40mM)、人血白蛋白(优选最多2% w/w，尤其为O. 5% w/w)、乙酸钠(优选为(T50mM，尤其为20mM)和甘露糖醇(优选最多10% w/w，尤其为2% w/w)0稀释剂也可优选包含缓冲剂或缓冲体系以缓冲复原的干燥组合物的pH，优选pH为 6. Cl. 5，尤其为 pH 6. 9 7. I。在优选实施方式中，稀释剂被置于单独的容器中。优选其为注射器。然后，在注射器中的稀释剂便可容易地被添加至最终容器中以复原根据本发明的干燥的止血组合物。如果最终容器也是注射器，则两个注射器可一起打包制得。因此，优选将根据本发明的干燥的止血组合物提供于注射器中，所述注射器由含有用于复原所述干燥、稳定的止血组合物的药学上可接受的稀释剂的注射器最终完成。本发明的适用于止血的生物相容性聚合物(“干燥的止血聚合物”)的干制剂可以由生物和非生物聚合物形成。适宜的生物聚合物包括蛋白质，如明胶、可溶性胶原蛋白、白蛋白、血红蛋白、酪蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白、角蛋白、以及层粘连蛋白；或它们的衍生物或组合。特别优选使用明胶或可溶性非原纤维胶原蛋白，更优选为明胶，示例性的明胶配方展示如下。其它适宜的生物聚合物包括多糖，比如糖胺聚糖、淀粉衍生物、木聚糖、纤维素衍生物、半纤维素衍生物、琼脂糖、藻酸盐、以及壳聚糖；或它们的衍生物或组合。适宜的非生物聚合物通过如下两种机制中的任一种被选定为可降解的，即 (I)聚合物骨架的崩解，或(2)导致水溶性的侧链的降解。示例性的形成非生物水凝胶的聚合物包括合成材料，如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯基树脂、聚丙交酯-乙交酯、聚己内酯以及聚氧乙烯；或它们的衍生物或组合。也可以是不同种类的聚合物的组合(如蛋白质与多糖、蛋白质与形成非生物水凝胶的聚合物等)。非交联的聚合物与适宜的复水助剂一起可以以任意适于复原的方式例如以形成适宜的水凝胶基质的方式进行交联。例如，聚合物分子可以使用双官能或多官能交联剂进行交联，所述交联剂可共价结合于两个以上聚合物分子链上。示例性的双官能交联剂包括醛、环氧化物、琥珀酰亚胺、碳化二酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、碳酸酯、异氰酸酯、二乙烯基砜、醇、胺、酰亚胺酯、酸酐、卤化物、硅烷、重氮基乙酸酯，氮杂环丙烷等。可选地，交联可以通过使用氧化剂和其他试剂，如高碘酸盐进行，氧化剂和其他试剂激活聚合物上的侧链或部分以便它们可以与其他侧链或部分反应，从而形成交联键。另一个交联方法包括使聚合物暴露于辐射，例如Y辐射，从而激活聚合物链以使交联反应进行。脱水热交联法也是适用的。用于交联明胶分子的优选方法如下所述。因此，根据优选实施方式，适用于止血的生物相容性聚合物含有交联多糖、交联蛋白、或交联非生物聚合物；或它们的混合物。优选适用于止血的生物相容性聚合物为颗粒状材料。所述颗粒状材料在暴露于液体(如稀释剂)时可以迅速溶胀，这种溶胀形式有助于形成可流动的糊剂，其可应用于出血部位。生物相容性聚合物，如明胶，可以以薄膜形式提供，然后其可被研磨成颗粒状材料。包含在这种颗粒状材料中的大部分颗粒的粒径优选为10(Tl. 000 μ m，特别是30(Γ500 μ m。根据优选实施方式，适用于止血的生物相容性聚合物是一种交联明胶。干交联明胶粉可被制备成接触适宜的稀释剂便可迅速复水。优选明胶粉包含相对较大的颗粒，也称作碎片或亚单元，如在WO 98/08550A及WO 2003/007845A. A中所述。其优选(中值)粒径为2(Γ ·000μπι的范围，优选为10(Γ750μπι，尤其为150 500 μ m，但该优选范围之外的粒径也可以在许多情况下使用。干燥的组合物在暴露于含水的复水介质(=稀释剂)时，也将表现出显著的“平衡溶胀度”。优选所述溶胀度在400% 1000%的范围内。“平衡溶胀度”可通过将明胶水凝胶粉完全水化从而完全溶胀时的重量减去其干重的值获得。然后将该差值除以干重再乘以100，以进行溶胀度的测定。应当将材料暴露于高温下足够长的时间以除去全部的残余水分之后，例如在120°C下2个小时之后，再测定干重。可以通过在室温下将干燥的材料浸溃在合适的稀释剂比如盐水中足够长的时间，典型地18 24h，以使水分含量恒定，来实现材料的平衡水化。非交联明胶与复水助剂一起可以以任意适于形成合适水凝胶基质的方式进行交联。根据本优选实施方式的干燥的交联明胶粉优选通过在特定的复水助剂的存在下制备粉末而获得。这样的复水助剂将会存在于制备粉末的过程中，但通常会从最终产品中移除。例如，以约20%的总固体含量存在的复水助剂典型地被减少至低于最终产品的1%，通常低于O. 5% (以重量计)。示例性的复水助剂包括聚乙二醇(PEG)，优选其具有约1000的分子量；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，优选其具有约50，OOO的平均分子量；以及葡聚糖，其典型地具有约40，000的平均分子量。优选在制备本发明的组合物时采用上述复水助剂的至少两种，尤其更优选采用所有的三种。用于制备交联明胶的示例性的方法如下。明胶在水溶液中获得并被悬浮以形成非交联水凝胶，其典型地具有I % 70% (以重量计)的固体含量，通常为3% 10% (以重量计)。典型地通过暴露于戊二醛(例如，O. 01% O. 05% w/w，在含水缓冲液中、在0°C 15°C处过夜)、高碘酸钠(例如，O. 05M,于(TC 15°C处保持48小时)、或I-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(“EDC”)(例如，O. 5% I. 5% w/w，在室温下过夜)，或通过暴露于约
0.3 3兆拉德的Y射线或电子束辐射，来使明胶交联。可选地，明胶颗粒可以以I % 70%(以重量计)、通常3% 10% (以重量计)的固体含量悬浮于醇优选甲醇或乙醇中，并通过暴露于交联剂而交联，所述交联剂典型地为戊二醛(例如，O. 01%^0. 1% w/w,在室温下过夜)。醛类的情况下，PH值应保持在约6 11，优选疒10。当用戊二醛进行交联 时，交联通过希夫碱(Schiff bases)形成，所述希夫碱通过随后的还原，比如通过用硼氢化钠处 理可被稳定。交联后，将所得颗粒在水中洗涤，并可选地用醇冲洗，然后干燥。接着，将制得的干粉末提供于此处所述的最终容器中。交联后，至少50% (w/w)复水助剂将从所得水凝胶中移除。通常，通过过滤水凝胶、洗涤所得的滤饼而移除复水助剂。这样的过滤/洗涤步骤可以重复一次或多次，以便将产品清洗至满意的级别，并除去至少50%的复水助剂，优选除去初始存在的复水助剂的至少90% (w/w)0过滤后，典型地通过干燥最终得到的滤饼来干燥明胶。然后将干燥的滤饼破碎或研磨，以制备具有上述所陈述的理想粒径范围的交联粉末。根据另一个方面，本发明还提供用于将止血组合物运输至患者身体靶位的方法，所述方法包括将通过根据本发明的方法制备的止血组合物运输至靶位。虽然在某些实施方式中，也可将干燥的组合物直接应用于靶位(且必要时，可选地使其与稀释剂接触，然后用于靶位)，优选在对靶位给药前使干燥的止血组合物与药学上可接受的稀释剂接触，以便获得湿的形式尤其是水凝胶形式的止血组合物。本发明还涉及通过根据本发明的方法获得的最终容器。所述最终容器包含无菌的、储存稳定的及可出售形式的组合组分。本发明的另一个方面涉及一种用于提供即用型止血组合物的方法，所述方法包括使根据本发明的方法制备的止血组合物与药学上可接受的稀释剂接触。本发明还涉及一种试剂盒，其包含根据本发明的成品形式的干燥、稳定的止血组合物及含有适宜的稀释剂的容器。所述试剂盒的其他组件可以是使用说明、给药装置，比如注射器，导管，刷子等(如果组合物尚未通过给药装置提供)、或其他医疗(外科手术)操作中需要使用的组件，比如替代针管或导管、额外的小瓶或进一步覆盖伤口的装置。优选根据本发明的试剂盒包含装有干燥、稳定的止血组合物的注射器及含有稀释剂的注射器(或被提供用以采集来自另一稀释剂容器的稀释剂)。优选这两种注射器以适于彼此的形式被提供，以便稀释剂可通过用于给药复原组合物的出口之外的另一入口被运输至干燥的止血组合物。在下面的实施例中进一步描述本发明，但本发明不限制于此。实施例
I.根据本发明的干燥的止血组合物的制备材料及方法所有的实施例都采用同样的组合，即提供试剂盒，其具有一个包含稳定形式的Floseal明胶基质和凝血酶的注射器、以及一个含有适宜的液体复原介质(例如O. 9 %NaCl，或40mMCaCl2)的注射器。两个注射器的内部和外部都是无菌的，所以整个复原都可由手术室(Operation theater)的洗手护士进行。通过以熟悉的方式连通两个注射器并通过“倾倒”混合两个注射器中的成分(即在两个注射器之间来回重复地转移成分)，来完成复原。“在注射器Lyo中”根据本发明的组合物是通过将明胶和凝血酶溶液混合成湿的糊剂并在单独的注射器中冻干所述糊剂制得的。可以通过辐射预先对明胶基质进行整体灭菌。Y或β辐射 适用于对明胶杀菌。使用灭菌的凝血酶溶液对无菌明胶进行整体水化。由此产生湿的糊剂，即没有游离液相的糊剂。优选此步骤通过下述方法整体进行逐渐将明胶颗粒滴入不断搅拌的凝血酶溶液中并混合直至形成均匀的糊剂或通过同时将颗粒及凝血酶溶液加入适当配置的挤出机中，在所述挤出机中两种组分被亲密地混合成可流动的糊剂，然后其被直接挤出至注射器中以便进一步加工。然后所述糊剂可被填充至注射器中以便在注射器中冻干。接下来冷冻被填充的注射器，采用适宜的冻干程序冻干浆料。通过按住初始设置在注射器中的活塞，使注射器在冻干机中闭合。在同一步骤中将冻干的基质压缩至接近一定的体积，所述体积被明胶颗粒单独占据，以使复原时混入产品的气体量减至最少。现在，所述产品可随时与稀释剂注射器、EO灭菌袋包装在一起，然后储存。稀释剂注射器稀释剂注射器包含用于水化产品的合适的复原介质。其可与Floseal注射器直接连通或通过连接器连通。稀释剂被转移至Floseal注射器中，并且水化产品在连通的注射器之间反复来回地转移，以形成可流动的糊剂。例如，所述稀释剂注射器可通过如下方法准备将介质无菌过滤，填充于适宜的注射器中(如Toppac注射器、Clearshot等)，并在必要时通过辐射进行最终灭菌。明胶颗粒根据已建立的方法(WO 98/08550Α ；W0 2003/00785A ;等)进行明胶颗粒块体生产。所述颗粒(“Floseal”颗粒”;“Floseal”基质)通过Y-辐射灭菌。将Floseal基质填充到适当大小的肖特玻璃瓶中以进行临床前灭菌。在目前最大的生物负荷水平下(IOOOcfu/样品)，最终容器中的产品的所需辐射剂量是25 40kGy。然后,在_20°C下储存块体材料(bulk material)用于进一步的制造。“在注射器Lyo中”的Floseal称取O. 81g Floseal明胶(包含水及相对应的O. 704克干明胶粉)，添加入冻干注射器中。然后，注射器活塞从背面设置于明胶颗粒的正上面。在另一侧，Floseal凝血酶注射器填充有4. Oml 500IE/ml的凝血酶。然后连接注射器，倾倒至少21次。最后一次之后，产品必须置于冻干注射器中。使用Floseal鲁尔接头关闭该注射器的鲁尔接口。将产品在该注射器内冻干。对于冻干来说，用于500IU/ml凝血酶STM5的冻干过程被使用。注射器被置于由不锈钢制成的定制机架(Custom built racks)。建造机架使得注射器的鲁尔接头置于机架的底层，而注射器的指状支托(Finger rests)停留在上层。这确保了注射器在冻干饼压实步骤中的稳定性最大。通过降低冻干机的液压止动板借此将活塞推过冻干孔至注射器内，使干燥产品在真空下被压实。这样关闭了注射器并压缩了冻干饼，使得冻干步骤后其占有尽可能少的体积。止动板(Stoppering plates)能够被降低的程度受限于金属垫片，所述金属垫片确保了注射器被压缩至合适的程度从而不对产品/设备造成过度的压力。2.在猪肝损伤模型中的有效性本研究的目的在于比较根据本发明的干燥的止血组合物与已经出品的标准产品(FlosealVH S/D ;巴克斯特保健公司)在猪肝损伤模型中的有效性。Floseal VH S/D是一种明胶基质，其可在应用2分钟之内运输凝血酶以停止活化。这种产品需要2步制备，S卩(I)复原凝血酶以及(2)用复原的凝血酶使明胶颗粒水化。根据本发明的产品被设计为通过一·个步骤使干燥的止血组合物复原，这相对于2步制备具有显著的进步，所述2步制备在需要迅速或大量使用产品时是不利的。猪肝脏损伤模型进行外科手术时,称量六头从Oak Hill Genetics公司(Ewing,伊利诺伊州)获得的平均体重为55. Okg (在52. 4 58. 4kg的范围)的雌性家猪。抵达后，将动物隔离观察6天。手术时，所有的六头猪皆未表现出临床疾病。使用耳标以识别动物并且分配识别编号使它们互相参照。将动物群饲于围栏内。猪自由进水，每日进食一次标准猪粮。猪类是被广为接受的心血管模型并且其适于进行这类研究。其肝脏的多个大的叶片允许多个用于直接比较不同测试项目的损伤。。麻醉及输液疗法用咪达唑仑(O. 3mg/kg, IM)医治猪并用氮气与氧气2:1的载体携带的异氟醚对其进行口罩诱导(masked induced)。对猪插管，以10 15次呼吸/min进行通气。用氧气载体携带的异氟醚对猪进行持续麻醉。用温热的乳酸林格氏液对猪进行持续比率的输液肝损伤方法将猪肝损伤模型用于本项研究。准备6头猪，目标在于评价120个损伤(每治疗组40个)并用α =0.05、功率=90%足以检测80%对40%的比率差。每组都依赖于中间、左侧或右侧叶片。每个损伤组包含使用配设了砂纸的手摇钻制造出的3个直径为1cm、深3 4_的肝损伤。评价出血，并用参照对象或试验对象对损伤进行随机、无偏见地处理。参照对象和试验对象使用随机数产生器进行随机化。将各个对象置于损伤的上面，用湿纱布按住2分钟，对治疗2、5和10分钟后的止血情况进行无偏见评价。5分钟评价后对剩下的参照对象或试验对象进行灌洗。肝素化协议设置基准全血激活凝血时间(ACT)并且对每头猪给予负荷剂量200IU/kg的肝素。每10分钟测定一次ACT直至ACT为至少2倍基准值。如果测得的ACT小于或约等于2倍基准值，则对猪给予75IU/kg的单次剂量的肝素。一旦大于2倍基准值，每20分钟测定一次ACT。若测得的ACT小于或约等于作为目标的2倍基准值，则给予猪单次剂量40IU/kg的肝素。若测得ACT大于作为目标的2倍基准值，则对猪不作处理、或给予维持剂量的肝素，其不得超过2，000IU/ho所有肝素都通过外周静脉导管给药。所有的血液样本都从颈静脉导管取得。血压及心率的参考值在测定ACT时记录。止血评价建立及治疗损伤组后，在0、2、5及10分钟时评价止血情况，其中，O分钟指预处理阶段。将0、1、2、3、4及5的分数分别指定为不出血、渗出、非常温和、温和、中等及严重。所有的三个损伤都在几乎相同的时间下处理，以避免位置及凝血因各自独立处理而产生差异。根据需要，各次评价后吸去来自损伤的血液。测量及记录通过标准方法评价ACT、止血、血压及心率。 统计分析本研究的采样单元为对于总计120个损伤来说，每个治疗组中具有40个损伤的肝损伤位。采用多元回归分析，根据治疗2、5及10分钟后的出血分数评价治疗效果(0=不出血、1=渗出、2=非常轻微，3=轻微、4=中度及5=严重)。独立的变量包括治疗组、猪、肝叶(中间、右侧或左侧)及初始出血分数。在治疗后的各个时间点处计算FB/FS、Lyo/FS、FB/Lyo、以及它们的置信区间(confidence intervals)的机会比率(odds ratios)。损伤部位不均匀地分布于三枚叶片及猪上。发现叶片的影响不显着，因此去除该影响再次进行分析。下述结果是对没有叶片影响的模型的分析。结果根据本发明的干燥的止血组合物的性能并不在所有的时间点处均显著不同于Floseal VHS/D。这表明，根据本发明的制备方法以及I步复原方式没有对所述组合物的性能产生负面影响，但却给实际处理带来了预期优势，据此证明本发明的目的得以解决。进一步的动物实验在非常严格的模型中(高度抗凝血)，进行临床前评价以比较“在注射器Lyo中”的Floseal与Floseal VH的体内活性。所述模型包括具有以十字交叉的方式从穿刺病灶处发散的4个追加切口的总厚度5mm的肝穿刺。每个实验组使用6只动物，这些动物被给予
4.0001. U. /kg肝素。在损伤被放置之后，应用复原的Floseal，并用湿纱布以轻微的压力按住2分钟。在此时间后，评价初期止血。若未实现初期止血，重新应用产品直至实现止血，或产品以(5ml) /时间(15min)被耗尽。主要的终点是初期止血的实现(是/否)及止血时间(min)。若初期止血被实现，则缝合动物，并在24小时后评价动物的再出血。结果显示，在这种特殊的临床前实验阶段，就止血时间来说，本发明的组合物相当于或优于标准Floseal。
权利要求
1.一种用于生产干燥、稳定的止血组合物的方法，所述方法包括 a)提供第一组分，其含有凝血诱导剂的干制剂， b)提供第二组分，其含有适用于止血的生物相容性聚合物的干制剂， c)在可有效形成湿糊剂、同时通过所述第一组分本质上抑制第二组分降解的条件下，在最终容器中混合所述第一组分和所述第二组分，或将所述湿的糊剂转移至最终容器中， d)在所述容器中冷冻并冻干所述糊剂，由此获得干燥、稳定的冻干形式的止血组合物，所述止血组合物含有所述第一组分和所述第二组分，以及 e)将在所述最终容器中的所述干燥、稳定的止血组合物最终转变为可储存的药物制品，其作为干燥、稳定的止血组合物含有组合形式的所述第一组分和所述第二组分。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤c)在无菌条件下进行。.
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步骤c)通过挤出进行。
4.如权利要求f3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤d)包含环氧乙烷灭菌步骤或电离辐射。
5.如权利要求广4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一组分包含在CaCl2溶液中的凝血酶。
6.如权利要求广5中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一组分中的凝血酶的浓度为 I (Γιο. 0001. U. /ml，优选为 50 5· 0001. U. /ml，尤其优选为 100 1· 0001. U. /ml。
7.如权利要求Γ6中任一项所述的方法，其特征在于，在进行所述步骤c)后，所述糊剂在所述最终容器中被冷冻。
8.如权利要求Γ7中任一项所述的方法，其特征在于，注射器用作所述最终容器。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述注射器是组合稀释剂注射器和药学上可接受的稀释剂而得到的注射器，所述稀释剂用于复原所述干燥、稳定的止血组合物。
10.如权利要求I、中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一组分含有人凝血酶。.
11.如权利要求广10中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一组分含有重组人凝血酶。
12.如权利要求f11中任一项所述的方法，其特征在于，所述适用于止血的生物相容性聚合物含有选自于由明胶、可溶性胶原蛋白、白蛋白、血红蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、酪蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白、角蛋白及层粘连蛋白构成的组中的蛋白质；或它们的衍生物或组合。
13.如权利要求f12中任一项所述的方法，其特征在于，所述适用于止血的生物相容性聚合物含有选自于由糖胺聚糖、淀粉衍生物、纤维素衍生物、半纤维素衍生物、木聚糖、琼脂糖、藻酸盐及壳聚糖构成的组中的多糖；或它们的衍生物或组合。
14.如权利要求f13中任一项所述的方法，其特征在于，所述适用于止血的生物相容性聚合物含有选自于由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯树脂、聚丙交酯-乙交酯、聚己内酯及聚氧乙烯构成的组中的聚合物；以及它们的衍生物和组合。
15.如权利要求f14中任一项所述的方法，其特征在于，所述适用于止血的生物相容性聚合物含有交联多糖、交联蛋白、或交联非生物聚合物；或它们的混合物。
16.如权利要求f15中任一项所述的方法，其特征在于，所述适用于止血的生物相容性聚合物为颗粒状材料。
17.如权利要求f16中任一项所述的方法，其特征在于，所述适用于止血的生物相容性聚合物为交联明胶。
18.如权利要求I 17中任一项所述的方法，其特征在于，所述最终容器进一步含有一定量的可有效抑制聚合物因暴露于灭菌射线时的变性的稳定剂，所述稳定剂优选为抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸的其他盐、或抗氧化剂。
19.一种用于将止血组合物运输至患者身体的靶位的方法，所述方法包括将通过如权利要求f 18中任一项所述的方法制备的止血组合物运输至靶位。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包含使所述止血组合物与药学上可接受的稀释剂接触的步骤，以获得水凝胶形式的止血组合物。
21.—种最终容器，其通过如权利要求f 18中任一项所述的方法获得。
22.一种用于提供即用型止血组合物的方法，其包括使通过如权利要求f 18中任一项所述的方法制备的止血组合物与药学上可接受的稀释剂接触。
23.一种用于给药止血组合物的试剂盒，其包含权利要求21所述的最终容器和含有药学上可接受的稀释剂的容器。
全文摘要
本发明描述的是一种用于生产干燥、稳定的止血组合物的方法，所述方法包括a)提供第一组分，其含有凝血诱导剂的干制剂，b)提供第二组分，其含有适用于止血的生物相容性聚合物的干制剂，c)在可有效形成湿糊剂、同时本质上通过所述第一组分抑制第二组分降解的条件下，在最终容器中混合所述第一组分和所述第二组分，或将所述湿的糊剂转移至最终容器中，d)在所述容器中冷冻并冻干所述糊剂，由此获得干燥、稳定的冻干形式的止血组合物，所述止血组合物含有所述第一组分和所述第二组分，以及e)将在所述最终容器中的所述干燥、稳定的止血组合物最终转变为可储存的药物制品作为干燥、稳定的止血组合物，所述可储存的药物制品含有组合形式的所述第一组分和所述第二组分。
文档编号A61K9/16GK102917691SQ201180027072
公开日2013年2月6日 申请日期2011年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者A·格斯尔, A·E·奥萨瓦, C·J·赖布 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特保健股份有限公司