本发明一般涉及用于促进止血的试剂和装置，并且更具体地涉及基于植物的“中药”产物的提取物和掺入此类基于提取植物的试剂的用于将其递送到出血伤口的装置的用途。
背景技术：
血液是液体组织，包括分散于液相中的红细胞、白细胞、触觉小体和血小板。液相是血浆，其包括酸、脂质、溶解的电解质和蛋白质。悬浮于液相中的一种特定蛋白是纤维蛋白原。当出血发生时，纤维蛋白原与水和凝血酶(酶)反应以形成纤维蛋白，所述纤维蛋白不溶于血液中并聚合以形成凝块。
在广泛多样的情况下，动物包括人可遭受由于伤口或外科手术期间的出血。在一些情况下，出血是相对少量的，并且除施加简单急救之外的正常血液凝固功能是所需要的全部。在其它情况下，可发生大量出血。这些情况通常需要专门的设备和材料以及受过训练的施用适当援助的人员。
在解决上述问题的努力中，已开发了用于控制过量出血的材料。
先前已知的材料例如明胶、胶原、氧化纤维素、凝血酶、纤维蛋白原和其它材料已被使用，但这些组合物中的每一个具有其局限性。例如，一类现有技术的血液凝固材料是血液衍生的蛋白质或酶，包括纤维蛋白原和/或凝血酶，其是昂贵的，需要专门的贮存条件，并且需要广泛纯化，以便消除关于血源性感染传播的可能性。
基于中药(TCM)的化合物通常是基于草或植物的制剂，其已使用数百年，并且在许多情况下基于传统的用途，尽管不一定被现代控释研究所支持。
止血中药是用于停止内部或外部出血的中药。这些药中的一些已分别请求保护“通过收缩性质、通过除去障碍和通过加温通道来冷却血液和停止出血”的作用，并且暗示用于来自身体所有部分的出血，例如咯血、吐血、鼻出血、尿血、血便、子宫出血和子宫渗血、紫癜和创伤性出血。已证实具有止血能力的中草药的例子例如大蓟(Daji Radix Cirsii Japonici)、小蓟(Xiaoji Herba Cephalanoploris)和槐花(Heuihua Flos Sophorae)。
一些TCM制剂通过静置在基于植物的TCM材料之上的醇溶液的长期环境温度注入的方法制备。此类注入通常在环境温度执行并用作乙醇溶液。
金苔纤维(Golden Moss)被视为基于植物的中药(TCM)，其已用于治疗风湿病、腰痛、坐骨神经痛和排尿困难。金毛狗脊(Cibotium barometz)(也称为金苔纤维、金毛狗(Fern Lamb of Tartary)或狗脊(Gou-Ji))已传统上用作抗炎剂和止痛药[Q.Wu&X.-W.Yang，J.Ethnopharm 2009，125，417-422]。其根茎的地上泛黄毛发已以泥敷剂用于伤口上，由于其广泛的接触表面而使出血停止。然而，没有公开金毛狗脊的提取物可被用于止血和抗微生物两种应用的教导。
已公布的专利申请No.CN 101317916A公开了用于治愈子宫出血的药，其含有具有下列重量份的组分：3至7份的金毛狗脊、7至12份的当归、5至8份的黄芩、8至12份的制备的地黄、4至8份的龙眼肉、4至8份的血余炭、4至7份的延胡索、6至10份的羌活和7至12份的白芍。制备方法包括煎煮原材料，然后将其碾磨以用于填充药袋。然而，该制剂被置于液体中用于口服，而不是作为局部止血处理。
技术实现要素：
本发明涉及优选用于局部用途的止血制剂，其包含金苔纤维的根茎的提取物、明胶组分和盐水溶液。明胶组分优选是可吸收的止血粉末基质，还更优选其中明胶和提取物与作为液相的盐水溶液的组合可以是基本上均质混合的。
在一个实施例中，金苔纤维的根茎的提取物是乙醇提取的止血产物。止血制剂可以含有约1％至约2.5％的止血有效的金苔纤维的乙醇提取物。
在另一个实施例中，金苔纤维的根茎的提取物是水提取的止血产物。止血制剂可以含有约0.25％至约2.5％的止血有效的金苔纤维的水提取物。
止血制剂还可含有有效量的选自下列的一种或多种添加剂或化合物：抗微生物剂、表面活性剂、抗氧化剂、湿润剂、润湿剂、润滑剂、增稠剂、稀释剂、照射稳定剂例如自由基清除剂、增塑剂和稳定剂，更具体地包含挤出增强量的甘油，并且优选地，其中以总体止血制剂的液相的重量计，甘油以按重量计约1％至约20％的量存在。
本发明还涉及向出血部位提供止血处理的方法，包括下列步骤：形成上述止血制剂，以及将该止血制剂施加于出血部位。
本发明还涉及制备半液体止血制剂的方法，包括下列步骤：将金苔纤维的根茎在溶剂中煮至少一个小时，优选至少48个小时，通过在真空下蒸发除去基本上所有溶剂，以形成金苔纤维的提取物，以及将金苔纤维的止血提取产物与盐水溶液和明胶粉末混合。溶剂可以是低分子量醇，例如乙醇或基于水的溶剂。明胶粉末可以是可吸收的止血粉末基质的形式，并且优选地，其中明胶和止血提取产物与作为液相的盐水溶液的组合是基本上均质混合的。止血提取产物优选是基本上不含乙醇的。
附图说明
图1示出体内止血功效研究A的结果，其中含有止血剂的多个测试制品和对照物的止血时间以分钟标绘。
图2示出体内止血功效研究B的结果，其中含有止血剂的几种测试制品和对照物的止血时间以分钟标绘。
具体实施方式
本发明涉及由基于植物的TCM产物的提取物(优选通常称为金苔纤维的植物的提取物)和可吸收的明胶基质制成的止血药，所述止血药具有止血和抗微生物性质。
在一个实施例中，本发明人发现，金苔纤维的乙醇提取物，中药(TCM)的组分，也称为中药金毛狗脊，也称为金毛狗或狗脊，可与明胶糊剂例如SURGIFLOTM组合，以产生相当于人凝血酶和SURGIFLOTM的组合的具有高功效的止血材料。
有利地是，所发现的止血剂具有抗微生物性质。有利地是，所发现的止血剂具有改善的稳定性，并且与常规血液衍生的止血剂相比是高性价比的。
GM提取物的制备：可使干燥碾磨的金毛狗脊(中国锦州(Jinzhou，China))的根茎经历使用去离子(DI)水或优选的95％乙醇溶液的提取方法，所述95％乙醇溶液在回流条件下保持至少48个小时。为了本专利申请的目的，根茎是金毛狗脊植物特有的水平茎，所述金毛狗脊植物通常在地下发现，经常从其结节长出根和枝条。金毛狗脊有时被称为金狗毛蕨、绵毛蕨，是蕨类蚌壳蕨科(Dicksoniaceae)中的桫椤物种。金毛狗脊是中国的部分和马来半岛的西部本土的。
在一种方法中，将含有干燥碾磨的金苔纤维根茎(D-GM)的玻璃烧瓶置于热水浴中，所述热水浴维持在85C和100C之间的温度下，更优选约100C。冷却水在回流管的冷却夹套中在约4C的温度下循环，使得溶剂以常规方式冷凝并返回到玻璃烧瓶。
在执行提取后，溶剂提取材料通过本领域已知的标准冻干方法进行冻干，冻干产物在下文指定为GM-W。提取物可在高温例如大于50℃，优选约60℃和在减压下浓缩，以消除基本上所有溶剂，无论是乙醇还是水，并且获得具有6.8％收率的提取物(以初始干燥碾磨根茎的重量计)，产物在下文指定为TCM-GM-E。将提取物制成10％和1％的工作溶液以用于体外和体内测试。超声波破碎仪可被用于制备均质溶液。
明胶载体的具体实施方式。
本发明的明胶材料优选是基于液体可渗透的、水不溶性明胶的海绵或糊剂。明胶是蛋白质胶原的变性形式，已被用于多种伤口敷料中。因为明胶凝胶具有相对低的熔点，所以它们在体温下不是非常稳定的。因此，通过建立蛋白质链之间的交联来稳定这些凝胶是必要的。在实践中，这通常通过用戊二醛或甲醛处理明胶来获得。因此交联的明胶可被加工成干燥海绵或碾磨成微粒形式，所述干燥海绵对于诱导出血伤口中的止血是有用的。
术语“明胶”在本文中用于代表膨胀、水合的聚合物网络，该聚合物网络遍及其体积是基本上连续的。蛋白质凝胶由所连接的蛋白质分子的基本上连续的网络和液体(通常含水)溶剂组成，所述液体溶剂填充蛋白质基质内的空间。蛋白质基质对溶剂分子发挥强粘稠阻力，从而阻止它们自由流动。构成凝胶网络的组分分子可通过离子键、疏水键、金属键或共价键连接。共价键是这些键中最热稳定的。
在一个实施例中，本发明的灭菌组合物可含有适用于止血中的生物相容性聚合物的固体、多孔或无孔颗粒，生物相容性液体和如上所述的止血提取物作为其三种主要组分。在有效提供基本上均质的止血组合物的条件下，将颗粒、液体和止血提取物组合并混合，所述止血组合物包含连续液相并且具有均质分散于其中的固体聚合物颗粒，所述连续液相包含止血提取物。组合物中含有的颗粒的量和平均直径以及固体、液体和止血提取物的相对量能够有效地提供具有止血和物理性质的组合物，如下文所述。
如本文所用，“连续的”和“不连续的”以那些词在用于定义和描述分散的标准命名法的上下文中的通常含义使用。
如本文所用，“基本上均质的”代表组合物或糊剂的物理状态，其中固体颗粒是遍及连续液相均匀分散的，使得固体：液体的比率和组合物或糊剂的任何部分或横截面的密度是基本上相同的。
如本文所用，“灭菌的”意指基本上不含活病菌和/或微生物，并且由关于本文描述并请求保护的组合物和医疗装置的政府标准进一步公认并描述。
如本文所用，“止血的”或“止血性质”意指停止或使出血最小化的能力，如止血领域技术人员将会理解的这些术语所意指，如说明书的实例中所进一步举例说明。
多种生物相容性天然、半合成或合成聚合物可被用于制备在本发明的组合物中使用的固体颗粒。所选择的聚合物必须在选择用于特定组合物的液体中是基本上不溶的。优选地，使用水不溶性的生物可降解的聚合物，其提供机械、化学和/或生物止血活性。可使用的聚合物包括但不限于蛋白质和多糖。可使用的多糖包括氧化纤维素、脱乙酰壳多糖、甲壳质、藻酸盐、氧化藻酸盐和氧化淀粉。用于制备颗粒的生物相容性聚合物优选是交联或变性蛋白质，例如明胶、胶原、纤维蛋白原或纤连蛋白。优选的明胶粉末是通过将明胶海绵研磨成颗粒制备的部分交联的明胶粉末，所述颗粒具有约40微米至约1200微米、更优选约100微米至约1000微米的平均直径，如通过激光衍射所测定。
本发明的灭菌组合物优选包含止血提取物和基于固体明胶的颗粒分散于其中的连续液相。取决于具体医疗装置及其用途，液体可以是含水的或非含水的。优选地，液相是含水的。含水液体可包括但不限于生物相容性含水溶液，例如氯化钙和盐水。更优选地，液相包含盐水。液相和固体微粒相以有效提供组合物的相对量存在，所述组合物为例如适用于提供止血中的糊剂或浆料。在某些实施例中，固体颗粒与液体的重量比一般为约1∶1至约1∶12，或约1∶3至约1∶8或甚至约1∶5。
本发明的组合物包括灭菌的本文所述的组合物，因为它们已用例如离子照射水平进行照射。此类照射可包括电子束或γ照射。照射水平和灭菌条件，包括组合物被照射的时间，是提供如本文所定义的灭菌组合物的那些。当具有本公开内容的有益效果时，本领域技术人员将能够容易地测定提供灭菌组合物所需的照射水平。
止血组合物还可包含有效量的一种或多种添加剂或化合物，包括但不限于抗微生物剂、表面活性剂、抗氧化剂、湿润剂、润湿剂、润滑剂、增稠剂、稀释剂、照射稳定剂例如自由基清除剂、增塑剂和稳定剂。例如，可添加甘油以增强组合物的可挤出性或可注射性。当利用时，以液相的重量计，甘油可以按重量计约0％至约20％存在于组合物中。优选地，以液相的重量计，组合物可包含按重量计约1％至约10％的甘油。更优选地，以液相的重量计，组合物可包含按重量计约1％至约5％的甘油。
此外，季胺可用于向组合物提供增强的性质。例如，以液相的重量计，苯扎氯铵、聚凝胺或Onamer M可以按重量计至多约1百分比的水平使用。优选地，以液相的重量计，苯扎氯铵以按重量计约0.001％至约0.01％的水平使用。更优选地，以液相的重量计，组合物可包含按重量计约0.002至约0.006％的苯扎氯铵。据信季胺可起到多重作用，充当抗微生物剂、发泡剂、自由基清除剂和作为肝素中和剂。
此类止血组合物还可包含肝素中和剂、附加的促凝血剂或止血剂，例如纤维蛋白原、纤维蛋白、因子Xa、或因子Vila。“有效量”意指向组合物提供那些性质所需的量，为了所述性质而添加添加剂。有效量还受可添加而不导致有害生物效应的最大量的限制。
用于将提取物掺入明胶载体上的方法。
在用于制备本发明的组合物的一个实施例中，通过将颗粒与液体混合以形成均匀糊剂来制备基本上均质的糊剂。液体包括止血提取物材料，并且可包括有效量的如上所述溶解于其中的其它添加剂。可通过挤出或通过在有效提供固体颗粒在液相中的均匀分散体的条件下在有限空间中混合来实现混合。
作为另外一种选择，混合器例如双行星式混合器，可用于制备本发明的组合物中。将含有止血提取物材料的液体添加到混合器中。在颗粒添加到溶液之前，液体可包括有效量的溶解于其中的添加剂。例如，可制备含有止血提取物材料、甘油和苯扎氯铵的盐水溶液，然后添加到混合器中。随着时间流逝伴随连续混合，将固体颗粒添加到混合器中，直至所有成分已被添加。继续混合直至形成基本上均质的组合物的该时间，所述基本上均质的组合物含有遍及连续液相均匀分散的固体颗粒。
在可供选择的实施例中，通过喷涂或印刷在基本上干燥的海绵的主表面上施加止血提取物。
如上制备的止血组合物可进行灭菌，以提供包含止血提取物的灭菌组合物。在一些实施例中，将组合物转移到如上所述的医疗装置中，并且优选通过离子辐射将含有止血提取物的装置灭菌。更优选地，灭菌是通过如本文所举例说明的γ照射进行的。
在其中可利用本发明的止血组合物的医疗装置包括目前用于将可流动或可注射的止血糊剂或浆料施加于需要止血的部位或伤口的任何装置。海绵可通过手或其它装置以常规方式施加。需要止血的部位可以是损伤或外科手术的结果。装置或涂敷器的例子包括注射器，例如Becton Dickinson或Monoject luer注射器。其它装置详细公开于美国专利No.6,045,570中，其内容全文以引用方式并入。
虽然下列实例展示了本发明的某些实施例，但它们不应被理解为限制本发明的范围，而应理解为有助于完善本发明的描述。
实例1：体外血液凝固研究。本发明人执行体外血液凝固测试，其中将200μL的每种测试溶液添加到含有200μL新鲜猪血的干净玻璃小瓶中。测试制品包括：
生理盐水
10％TCM-GM-E乙醇提取物
10％TCM-GM-W水提取物
1％TCM-GM-E乙醇提取物
1％TCM-GM-W水提取物。
小瓶在室温下放置4分钟后，将小瓶倒置。与其它测试制品相比，在含有10％TCM-GM-E乙醇提取物的小瓶中观察到显著的血块。因此，10％TCM-GM-E乙醇提取物在体外定性测试中显示良好的功效。
实例2：体内止血功效研究A。使用猪脾脏活检穿孔模型执行止血活性研究，其中在脾脏上制备6mm宽×3mm深的穿孔伤口开口，并且将测试制品施加于新鲜产生的伤口部位，随后进行闭合指压(填塞)。施加初始压力30秒，并且使用电子定时器定时。在30秒填塞之后，中止指压；立即除去制品上的纱布垫。执行30秒止血评估期。如果在30秒内未观察到自由流动的出血，则以分秒格式记录止血时间，并且对于该制品得出测试结论。如果观察到自由流动的出血，则再施加压力和纱布附加的30秒进行第二次填塞，并且直至获得止血或直至测试期的观察期达到十分钟。通过在小于十分钟内中止自由流动的出血来测定止血。
现在参见图1，对于含有止血剂的几种测试制品和对照物以分钟标绘止血时间。测试制品包括基于明胶的糊剂(SFL)6mL与下列物质的混合物：
2mL的生理盐水
在生理盐水溶液中的2mL的1-10％TCM-GM提取物(乙醇、水)
主要含有人凝血酶的2mL EVITHROMTM溶液(的完全组成含有人凝血酶(800-1200IU/mL)、氯化钙、人白蛋白、甘露糖醇、乙酸钠和注射用水)。
在所述测试中，通过下列步骤将与止血材料充分混合：1.将2mL的止血材料溶液抽取到空注射器中；2.通过将鲁尔连接器(luer connector)附接到预填充的注射器并将含止血材料溶液的注射器附接到鲁尔适配器的另一端，然后将止血材料溶液注射到预填充的基质中，混合2种组分；3.通过来回推动混合的材料继续混合组分，直至稠度平均，并且施加于伤口，其中如上所示执行测量。
如图1中可见，SFL/10％TCM-GM-E乙醇提取物在体内测试中显示与SFL/EVITHROM相似的功效，其中止血时间正好在1分钟以下。
用生理盐水作为对照物的结果显示长达4.8分钟的止血时间。SFL/1％TCM-GM-E以及SFL/1％TCM-GM-W和SFL/10％TCM-GM-W显示大约2.3-2.6分钟的止血时间。
实例3：体内止血功效研究B。使用猪脾脏活检穿孔模型伴随类似于实例4中所述这些的测试参数执行止血活性研究，其中穿孔伤口开口为6mm宽×3mm深并且填塞时间：30秒；观察时间：30秒。
现在参见图2，对于含有止血剂的几种测试制品和对照物以分钟标绘止血时间。测试制品包括
基于明胶的糊剂(SFL)6mL与下列物质的混合物：
2mL的生理盐水
在生理盐水中的2mL的1-10％TCM-GM提取物(乙醇、水)
主要含有人凝血酶的2mL EVITHROMTM溶液(的完全组成含有人凝血酶(800-1200IU/mL)、氯化钙、人白蛋白、甘露糖醇、乙酸钠和注射用水)。
2mL的1-10％YNBY(云南白药)，由TCM手册特别指定用作止血药的熟知的TCM制剂
测试制品还包括基于氧化再生纤维素(ORC)粉末的混合物，所述氧化再生纤维素粉末是已知并广泛使用的止血药，所述粉末通过ORC纤维的球磨制得。
基于ORC的测试制品通过将下列物质混合进行制备：
0.983克的ORC粉末与
2mL的生理盐水
在生理盐水中的2mL的10％TCM-GM提取物(乙醇)
2mL的10％YNBY
在该测试中，将或ORC粉末与止血材料充分混合，并且施加于伤口，其中如上所示执行测量。
如由图2中呈现的数据可见，基于ORC的组合物显示范围是8-10分钟的更长的止血时间。用生理盐水作为对照物的SFL的结果显示长达4.5分钟的止血时间。
SFL/4％-10％TCM-GM-E显示大约2.8-3.4分钟的止血时间，其中关于SFL/6％-10％TCM-GM-E的时间特别快，为2.8-3.1分钟，一般相当于用含有人凝血酶的EVITHROM获得的数据，所述EVITHROM显示2.6分钟的止血时间。
含有YNBY和低浓度的1％-2％TCM-GM-E的测试制品显示范围是5.2-6.7分钟的长止血时间。
基于实例4和5中呈现的结果，基于明胶的糊剂与2mL6％-10％TCM-GM-E在盐水中的混合物证实止血时间一般相当于与人凝血酶溶液的混合物，并且显著优于与盐水的混合物。
基于实例4中呈现的结果，基于明胶的糊剂与2mL的1％-10％TCM-GM-W在盐水中的混合物或与2mL的1％TCM-GM-E在盐水中的混合物证实了止血时间一般优于与盐水的混合物。
实例4：现在参见表1，用以约6log CFU/mL种菌在含TCM-GM-E的TSB(胰蛋白酶大豆肉汤)培养基中受攻击的细菌测试体外抗菌功效。通过在37℃下温育24小时后计数活细菌来评估功效。*对照是在TSB培养基中的450ppm乙醇的空白溶液。本发明人已意外地发现对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)在450ppm水平下的3-5对数杀灭，指示G+和G-两种细菌在约450ppm处达到的功效。
表1：体外抗菌功效