专利名称：一种间日疟红内期疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种间日疟红内期疫苗及其制备方法，尤其涉及间日疟红内期疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。
背景技术：
自1907年Laveran A发现疟疾的病原体和Ross R发现疟疾的传播媒介以来，人们与这种疾病的斗争已进行了一个多世纪。迄今为止，疟疾仍然是一种严重威胁人类健康和生命的寄生虫病。据世界卫生组织2008年全球疟疾报告报道，2008年全球有2. 43亿临床病例，86. 3万人因疟疾死亡。由于疟原虫及蚊煤抗药性的产生和迅速扩散，疟疾的药物防治面临困境，因此，研制新型、高效、安全的疟疾疫苗成为当前的迫切需要。目前疟疾疫苗主要有红内期疫苗、红外期疫苗和传播阻断疫苗三种。在红内期疟原虫中，由于裂殖子存在于细胞外，与宿主免疫系统直接接触，因此这一时期原虫已成为红内期疫苗的主要靶点。裂殖子入侵宿主细胞是个相当复杂的过程，并由受体和配体介导。推测有多个疟原虫蛋白质参与该入侵过程，这些蛋白包括位于裂殖子表面的蛋白质、培养上清中可溶性蛋白质以及位于棒状体或微线体中的蛋白质，目前研究认为MSI^s是疟疾疫苗研究靶点。长期以来，人们都把研究重点放在恶性疟的研究上，极少有人关注间日疟的研究。虽然在全球范围内恶性疟原虫引起的死亡人数比较多，但是间日疟原虫也是不容忽视的影响人们生活质量和经济生产力的原因之一。研究表明，间日疟裂殖子表面蛋白 4(PvMSP4)在195个病毒株中的序列只有很少的不同，而且这些不同仅存在于两个重复序列结构中[Chaturong Putaporntip, Somchai Jongwutiwes, Liwang Cui. Limited Global Diversity of the Plasmodium vivax Merozoite Surface Protein 4 Gene. Infect Genet Evo 1. 2009 September ； 9(5) : 821 - 826·]。杆状病毒表面展示系统是近几年发展起来的一种新的真核展示系统，通过在杆状病毒囊膜糖蛋白gp64插入外源蛋白，二者融合表达或与特异性的锚定部位结合，将外源蛋白展示在重组杆状病毒的表面，通过筛选表达特异蛋白的重组杆状病毒粒子得到外源蛋白，可用来展示需糖基化、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白及构建多肽文库、抗体库等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种间日疟疾红内期疫苗，能够对间日疟原虫的攻击感染提供免疫保护。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种家蚕重组杆状病毒angp64-PvMSP4，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5605。
上述重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4的制备方法，包括以下步骤
(1)基因PvMSP4(间日疟裂殖子表面蛋白4的编码基因)的获得为了去除基因中的内含子，根据NCBI上PvMSP4基因序列(基因登录号GQ912373. 1)设计两对引物，所述PvMSP4基因序列由中间的一个内含子将其分成外显子1和外显子2，利用外显子1的下游引物和外显子2的上游引物引入相同的I酶切位点，基因序列由GGTAGC转变成 GGATCC，但是编码的氨基酸序列不变；以间日疟原虫IV159病毒株的基因组DNA为模板，通过PCR扩增两段基因后分别进行双酶切，并用连接酶连接后作为模板，利用外显子1的上游引物和外显子2的下游引物PCR扩增获得基因PvMSP4，其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
(2)重组供体质粒pFastBaCI-gp64-PVMSP4的构建将步骤(1)经PCR所得完整的 PvMSP4基因(全基因)插入杆状病毒表面展示载体pFastBaCI-gp64中，转化大肠杆菌TGl 感受态细胞，挑斑提取重组供体质粒pFaStBacI-gp64-PvMSP4，并用PCR和双酶切进行鉴定；
(3)重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4的获得与鉴定将步骤O)鉴定成功的重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，通过转座方式进行蓝白斑筛选，抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物PCR进行鉴定；将鉴定成功的重组杆状病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，待细胞发病后收集第一代重组病毒悬液 0-4°C保存，提取病毒基因组并用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒 Bmgp64-PvMSP4。进一步地，上述步骤(1)中外显子1的上游引物含feoR I，外显子2的下游引物 isxho I ；且外显子1、外显子2、外显子1的上游引物、外显子1的下游引物、外显子2的上游引物、外显子2的下游引物的序列分别如SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 所示。进一步地，所述步骤( 中杆状病毒表面展示载体pFaStBaCI-gp64由PCR扩增得到的杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列、杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列克隆至转移载体PFastBacI中获得。本发明还提供上述重组杆状病毒angp64-PvMSP4表达的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 11 所示。上述蛋白的制备方法，包括以下步骤
(1)将上述重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；
(2)针刺接种法接入家蚕五龄幼虫和蚕蛹；
(3)收集表达的上述蛋白。本发明进一步提供上述家蚕重组杆状病毒angp64-PvMSP4在制备间日疟红内期疫苗中的应用。本发明还提供一种多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤
(1)基因PvMSP4(间日疟裂殖子表面蛋白4的编码基因)的获得为了去除基因中的内含子，根据NCBI上PvMSP4基因序列(基因登录号GQ912373. 1)设计两对引物，所述 PvMSP4基因序列由中间的一个内含子将其分成两个外显子1和外显子2，利用外显子1 (SEQ ID NO 1)的下游引物(SEQ ID NO 4)和外显子2(SEQ ID NO 2)的上游引物(SEQ ID NO 5)引入相同的BmM I酶切位点，基因序列由GGTAGC转变成GGATCC，但是编码的氨基酸序列不变；以间日疟原虫IV159病毒株基因组DNA为模板，通过PCR扩增两段基因后分别进行双酶切，并用连接酶连接后作为模板，利用外显子1的上游引物(含I)和外显子2 的下游引物(含损ο I)PCR扩增获得基因PvMSP4，其核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示；
(2)重组质粒pGEX-4T-l-PvMSP4，的构建为了保证目的蛋白表达，设计引物 R' (exon2) (SEQ ID NO. 7)，去掉基因序列上的GPI序列，以步骤(1)得到的基因PvMSP4为模板，以序列号为SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 7的引物为上下游引物，经PCR扩增得到无GPI 的PvMSP4基因(以下简称为PvMSP4，)，将其与pGEX-4T-l载体同时经^boRI/IAoI双酶切， 将酶切回收的片段用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取重组质粒pGEX-4T-l-PvMSP4，，利用PCR和双酶切进行鉴定；
(3)大肠杆菌中表达蛋白PvMSP4’的诱导表达、纯化与多克隆抗体制备将步骤(2)鉴定成功的重组质粒pGEX-4T-l-PvMSP4，转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，加IPTG诱导表达，利用GST亲和层析纯化目的蛋白，纯化出的蛋白免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体。本发明还提供上述多克隆抗体在重组杆状病毒angp64-PvMSP4表达和鉴定中的应用。本发明实现的技术效果如下
利用家蚕幼虫、蛹作为生物反应器，家蚕杆状病毒表达系统高效表达具有极高临床应用价值间日疟疾疫苗的方法，通过将gp64蛋白的N端信号肽和近C端跨膜区与PvMSP4基因融合表达并展示在杆状病毒囊膜表面，形成一个带外源病毒抗原的伪病毒，该伪病毒具有外源病毒的抗原性，可以作为基因工程疫苗，间日疟疾疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产，且家蚕杆状病毒表达系统是真核表达，具有翻译后修饰功能。由于家蚕蛹中蛋白对人体无毒性，以蚕蛹为生物反应器生产的基因工程疫苗对人体产生副作用小，且本方法适用于大规模生产，生产成本低。
图1是本发明中提供的PvMSP4基因的结构，图中显示该基因由两个外显子和一个内含子组成，上面标示出了 GPI的位置；
图2是本发明重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4的构建示意图。
具体实施例方式以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。实施例1 基因PvMSP4的获得
为了去除基因中的内含子，根据NCBI上PvMSP4的序列(基因登录号GQ912373. 1)设计两对引物，所述PvMSP4基因序列由中间的一个内含子将其分成外显子1和外显子2(如图1所示)，利用在外显子子1的下游和外显子2的上游引入相同的I酶切位点，基因序列由GGTAGC转变成GGATCC，但是编码的氨基酸序列不变；分别以引物F(exonl) ,R(exon 1)和F(exon 2)、R(exon 2)[即，F(外显子1)、R(外显子1)、F(外显子2)、R(外显子2)]， 以间日疟基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如下F(exonl) 5，-ATAGAATTCGCCTTCGCGGGCATT-3，{EcoR I 酶切位点) R(exon 1): 5' -CGCGGATCCTGGAGTGCTATTCTGC-3 {Bam H I 酶切位点) F(exon2) : 5，-ATAGGATCCGGAGGCCAAACGGGT-3，{Bam H I 酶切位点) R(exon 2) : 5' -CCGCTCGAGATTTATGGAAGCCAAAAC-3' {Xhol 酶切位点) 具体程序和反应体系如下 反应程序
权利要求
1.一种家蚕重组杆状病毒angp64-PvMSP4，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5605。
2.—种权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)PvMSP4基因的获得根据NCBI上基因登录号为GQ912373. 1的PvMSP4基因序列设计两对引物，所述PvMSP4基因序列由中间的一个内含子将其分成外显子1和外显子2， 利用外显子1的下游引物和外显子2的上游引物引入相同的I酶切位点，基因序列由GGTAGC转变成GGATCC，但是编码的氨基酸序列不变；以间日疟原虫IV159病毒株的基因组DNA为模板，通过PCR扩增两段基因后分别进行双酶切，并用连接酶连接后作为模板，利用外显子1的上游引物和外显子2的下游引物PCR扩增获得基因PvMSP4，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 8 所示；(2)重组供体质粒pFastBaCI-gp64-PVMSP4的构建将步骤(1)经PCR所得完整的 PvMSP4基因插入杆状病毒表面展示载体pFastBaCI-gp64中，转化大肠杆菌TGl感受态细胞，挑斑提取重组供体质粒pFastBaCI-gp64-PVMSP4，并用PCR和双酶切进行鉴定；(3)重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4的获得与鉴定将步骤O)鉴定成功的重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，通过转座方式进行蓝白斑筛选，抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物PCR进行鉴定；将鉴定成功的重组杆状病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，待细胞发病后收集第一代重组病毒悬液 0-4°C保存，提取病毒基因组并用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒 Bmgp64-PvMSP4。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中外显子1的上游引物含feoR I，外显子2的下游引物含I ；且外显子1、外显子2、外显子1的上游引物、外显子1的下游引物、外显子2的上游引物、外显子2的下游引物的序列分别如SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 所示。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤O)中杆状病毒表面展示载体 pFastBacI-gp64由PCR扩增得到的杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列、杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列克隆至转移载体PFastBacI中获得。
5.一种权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4表达的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 11 所示。
6.一种权利要求5所述蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)将权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；(2)针刺接种法接入家蚕五龄幼虫和蚕蛹；(3)收集表达的权利5所述蛋白。
7.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-PvMSP4在间日疟红内期疫苗制备中的应用。
8.—种权利要求5所述蛋白在间日疟红内期疫苗制备中的应用。
9.一种多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)重组质粒pGEX-4T-l-PvMSP4，的构建为了保证目的蛋白表达，设计引物R' (eXon2)，去掉基因序列上的GPI序列，以权利要求2步骤(1)所得到的基因PvMSP4 为模板，以SEQ ID NO. 3、R' (exon2)为上下游引物，经PCR扩增得到PvMSP4，基因，将其与PGEX-4T-1载体同时经&01 1/损01双酶切，将酶切回收的片段用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化TGl感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取重组质粒 pGEX-4T-l-PvMSP4，，利用PCR和双酶切进行鉴定；其中PvMSP4，为无GPI的PvMSP4基因， 引物R’ (exon2)的序列如SEQ ID NO. 7所示；(2)大肠杆菌中表达蛋白PvMSP4’的诱导表达、纯化与多克隆抗体制备将步骤(1)鉴定成功的重组质粒pGEX-4T-l-PvMSP4，转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，加IPTG诱导表达，利用GST亲和层析纯化目的蛋白，纯化出的蛋白免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体。
10. 一种权利要求9所述的多克隆抗体在家蚕重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4表达和鉴定中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种间日疟红内期疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明利用基因重组技术将间日疟裂殖子表面蛋白4的编码基因PvMSP4与杆状病毒gp64的信号肽和跨膜区融合得到重组杆状病毒，通过家蚕生物反应器生产该重组病毒后，接种家蚕五龄幼虫和蚕蛹，进行高效表达PvMSP4蛋白，结果显示该蛋白进行了翻译后修饰，经过离心分离纯化获得具有生物活性的病毒粒子疫苗。本发明所提供的疫苗制备方法简单，操作简便，成本低，并且具有良好的生物活性。
文档编号A61K39/015GK102533678SQ20121000560
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者单茜茜, 张耀洲, 舒特俊, 陈剑清 申请人:特菲(天津)生物医药科技有限公司