专利名称：一种猪瘟疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种猪瘟疫苗及其制备方法，尤其涉及猪瘟疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。
背景技术：
猪瘟(hogcholera, HC)又称古典猪瘟(classical swine fever, CSF)，是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，死亡率高达90%以上。1984年世界动物卫生组织(OIE)将其列入A类传染病，也是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染
病之一。1908年匈牙利HutyraK-oves制成猪瘟高免血清后，人们一直用高免血清一血毒同时肌注来免疫猪群。但由于高免血清价格昂贵，获取困难，加之血毒有散毒的危险，因此各国学者在以后的60年间相继研制出许多灭活疫苗，其中福尔马林和结晶紫灭活疫苗曾被广泛应用。灭活疫苗虽然安全，但是保存期短。1955年，周泰冲等人将CSFV石门强毒株经兔体214次传代后成功制备出兔化弱毒株。继续传代480次，成为商品化的标准疫苗株。后来被命名为中国疫苗株(C-strain) 或猪瘟兔化弱毒(HCLV)株，很多商品化的疫苗株都由其衍生而来。1957年以来广泛用于世界许多国家，是目前世界上使用最广泛的弱毒苗，对控制CSF流行起到了关键作用。相比其它商品化的疫苗，它的安全性更高，菌毒在猪体内持续存在不超过3周，且不会引起仔猪和怀孕母猪发病；免疫效果更好，免疫一次就能产生完全的保护，保护时间长达一年甚至终生。常规弱毒疫苗尽管安全有效，但存在免疫抗体与感染抗体不能区分的问题，不能通过血清学方法来检测一个免疫猪群中的野毒感染，这对于猪瘟的防制与净化非常不利，也正因为这个原因，采取猪瘟免疫政策国家的猪及其制品的出口受到严格限制，这就使得开发能用血清学方法区分免疫猪与感染猪的新型疫苗成为当务之急。亚单位疫苗是一类能通过血清学方法方便的区分免疫动物与感染动物的疫苗。目前已有2种亚单位疫苗在欧盟获得了注册，这2种疫苗均是以杆状病毒表达的CSFV E2蛋白作为免疫原。但这种疫苗也存在一些缺陷，试验表明E2蛋白亚单位疫苗在免疫14d后才能产生对野毒感染的保护；同时，如果免疫时机体内有低水平母源抗体存在，至少要免疫两次才可诱导临床保护，即使如此，大多数已经产生临床保护的猪在攻毒时仍会有发热、白细胞减少和病毒血症的情况出现。另外，E2蛋白亚单位疫苗能否预防水平传播和垂直传播也有待证实。重组活载体疫苗是最先开始研究的标记疫苗，活载体疫苗能引起体液免疫和细胞免疫，且能在体内复制，能诱导长期和高效的免疫保护。用于猪瘟标记疫苗的病毒载体有痘病毒、伪狂犬病病毒(PRV)、猪腺病毒(PAV)等。但是它们都有明显的缺陷重组痘苗病毒可能对未接种过痘苗的人具有潜在的感染性；重组痘苗病毒传播到环境中可能与野生型痘苗病毒发生重组，出现毒力返强现象；痘苗病毒对猪的感染性较低，必须注射高剂量的重组痘苗病毒才能诱导有效的保护；基于PRV载体疫苗不适用于伪狂犬病流行地区，因为PRV抗体对于免疫及血清学检测有一定影响；而rPAV-E2和rPRV-E2虽然高效而且安全，但是没有得到具体的疫苗试验或者田间实验证实。DNA疫苗具备很多优势，发展非常迅速，但也存在潜在的安全隐患，如质粒DNA是否会整合到宿主基因组中、是否会引起免疫耐受等问题尚不清楚，且存在一定的安全隐患， 此外DNA疫苗免疫效力尚有待进一步提高。基于以上各种情况，研究新型、有效的猪瘟疫苗已为研究者的努力方向，而且E2、 EO蛋白是猪瘟病毒的主要抗原位点，是猪瘟疫苗研制的主要靶点。杆状病毒表面展示系统是近几年发展起来的一种新的真核展示系统，可弥补原核展示系统的不足，并保持表面展示系统的优点，通过筛选表达特异蛋白的重组杆状病毒粒子即便于外源蛋白的纯化，可用来展示需糖基化、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白，在高亲和力抗体及多肽药物的筛选、蛋白质抗原表位分析等方面具有广阔的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种克服上述缺陷的猪瘟疫苗。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将猪瘟病毒的主要抗原基因E2、 EO融合展示在家蚕杆状病毒囊膜表面，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为猪瘟疫苗原进行生产，相比于传统猪瘟疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下
一种家蚕重组杆状病毒angp64-E2-2A-E0，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 Qiombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5604。上述家蚕重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤
(a)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列SP和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列TM，通过I/ EcoR I和炀ο I/Hind III双酶切插入 PFastBacI载体多克隆位点上下游两端，构建表面展示系统转移载体pFaStBaCI-gp64 ；
(b)采用pvL1393-E2-2A-E0 重组质粒为模板，以 SEQ ID: NO. 6 和 SEQ ID: NO. 7 为引物进行PCR扩增，构建融合基因E2-2A-E0 ；
(c)将步骤(b)所得的融合基因E2-2A-E0双酶切产物克隆至步骤(a)所得表面展示系统转移载体pFaStBacI-gp64上，并筛选阳性克隆，获得转移重组质粒 pFastBacI-gp64-E2-2A-E0；
(d)将步骤(c)所得转移重组质粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0转化大肠杆菌DHlOBac 感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-4 后挑取白斑，培养16-20h后菌液稀释IO6重新涂板做筛选，挑取白斑至LB培养基摇菌培养16-20h后，用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定；
(e)取步骤(d)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得零代病毒悬液0-4°C保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0。上述重组杆状病毒angp64-E2-2A-E0表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID: NO. 11 所示。
上述蛋白的制备方法，包括以下步骤
(a)将上述重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；
(b)以穿刺接种法接种家蚕五龄幼虫、蛹；
(c)收集表达的上述蛋白。本发明进一步提供上述家蚕重组杆状病毒aiigp64-E2-2A-E0在猪瘟疫苗制备中的应用。本发明还提供上述蛋白在猪瘟疫苗制备中的应用。本发明具有以下有益效果
本发明利用家蚕蛹、五龄幼虫为生物反应器，高效表达猪瘟病毒主要抗原蛋白E2和 E0，通过将杆状病毒gp64蛋白的N端信号肽和C端跨膜区与E2-2A-E0基因融合，使猪瘟病毒主要抗原重组融合蛋白展示于杆状病毒囊膜表面形成一个带有外源病毒主要抗原的杆状病毒伪病毒，该伪病毒具有外源病毒的免疫原性，可以作为重组基因工程疫苗，而且家蚕杆状病毒表达系统属于真核表达系统，具有翻译后的加工修饰功能，是表达的外源蛋白具有更接近于天然的生物活性。由于家蚕蛹中蛋白对人畜无毒无害，所以本发明以蚕蛹为生物反应器生产的基因工程疫苗对人畜产生的副作用小，而且适用于大规模生产，生产成本低。此外，本发明使用家蚕杆状病毒表面展示技术表达猪瘟病毒重组融合蛋白E2-2A-E0用于猪瘟疫苗的研制也尚属首例。
图1是本发明中构建的杆状病毒表面展示系统转移载体pFaStBaCI-gp64的图谱；
图2是本发明构建的重组转移质粒pFastBaCI-gp64-E2-2A-E0的图谱示意图； 图3是本发明构建的重组杆状病毒angp64-E2-2A-E0的模式图。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合实施例详细说明本发明的具体内容。实施例1 融合基因E2-2A-E0的获得
根据NCBI上猪瘟病毒E2、EO基因的序列(基因登录号E0为EF015^2. 1，E2为 DQ907718. 1)设计E2基因的上游引物SEQ ID: NO. 6和EO基因的下游引物SEQ ID: NO. 7， 上游引物引入I酶切位点，下游引物引入损ο I酶切位点以中国农业科学院张志芳老师赠送的pvL1393-E2-2A-E0重组质粒为模板，进行PCR扩增，获取融合基因E2-2A-E0，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID: NO. 10。具体程序和反应体系如下反应程序
IJI
反应体系
10XPCR Buffer5 μ 1
25mM MgCl24 μ 1
2.5mM dNTPs4 μ 1
SEQ ID: NO. 61 μ 1
SEQ ID: NO. 71 μ 1
模板1 μ 1
KOD Plus DNA 聚合酶(Τ0Υ0Β0 公司)1 μ
加无菌ddH20至50 μ 1
将PCR产物用feoR l,Xho I (均购自^witrogen公司)进行双酶切后，割胶回收以备后用。 实施例2 杆状病毒表面展示系统转移载体pFaStBaCI-gp64的构建
根据NCBI上获得的杆状病毒gp64基因序列(基因登陆号为L33180. 1)，设计引物SEQ ID: NO. 2、SEQ ID: NO. 3通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)特异扩增出其信号肽(SP)序列，以SEQ ID: N0.4、SEQ ID: NO. 5为引物，提取的野生杆状病毒基因组为模板特异扩增出跨膜区域(TM)序列，如SEQ ID: N0.9，并以NCBI上获取的SP序列为模板设计鉴定上游引物SEQ ID: NO. 1，各步具体反应程序如下 (1) SP序列的合成 反应程序
反应体系 10XPCR Buffer 25mM MgCl2 2. 5mM dNTPs SEQ ID: NO. 2
5 μ 1 4 μ 1 4 μ 1 1 μ 1SEQ ID: NO. 31 μ 1
KOD Plus DNA 聚合酶(TOYOBO 公司)1 μ
加无菌ddH20至50 μ 1
将PCR产物用I,EcoR I (均购自Fermentas公司)进行双酶切后，割胶回收以备后用。 ⑵TM序列的合成
反应程序
反应体系
10XPCR Buffer5 μ 1
25mM MgCl24 μ 1
2.5mM dNTPs4 μ 1
SEQ ID: NO. 41 μ 1
SEQ ID: NO. 51 μ 1
基因组模板ι μ
KOD Plus DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司)1 μ
加无菌ddH20至50 μ 1
将PCR产物用ZAo l.Hind III进行双酶切后，割胶回收以备后用。将(1)、⑵两组双酶切后的PCR产物，依次分别克隆到pFastBacI空载质粒(购自 Invitrogen公司)上，转化大肠杆菌TGl感受态细胞(购自^witrogen公司)，挑取单菌落， 利用上述的PCR鉴定引物SEQ ID: NO. 1和SEQ ID: NO. 5进行PCR鉴定，并进行双酶切和测序鉴定，筛选取阳性克隆的质粒即为杆状病毒表面展示系统转移载体pFaStBacI-gp64， 如图1所示。实施例3 杆状病毒表面展示系统转移质粒pFaStBaCI-gp64-E2-2A-E0的构建将实施例1中回收的融合基因E2-2A-E0双酶切产物克隆至转移载体pFastBaCI-gp64
上，筛选阳性克隆即为杆状病毒表面展示系统转移质粒pFastBaCI-gp64-E2-2A-E0，如图2 所示。实施例4 重组杆状病毒angp64-E2-2A-E0的获取与鉴定
将实施例3中所获得的重组转移质粒pFastBaCI-gp64-E2-2A-E0转化大肠杆菌 DHlOBac感受态细胞(购自hvitrogen公司)，在含有购自Bio Basic Inc公司的卡那霉素、 庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG(异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)的LB固体培养板(常规方法制备)上进行蓝白斑筛选，避光培养4 后挑取单菌落白斑，培养1 后菌液稀释IO6 重新涂板做筛选，挑取白斑至LB培养基摇菌培养1 后，用异丙醇在超净台中抽提重组杆状病毒基因组，用M13通用引物PCR鉴定是否转座成功。
M13 上游引物5，-GTTTTCCCAGTCACGAC-3， Ml3 下游引物5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，
将鉴定成功的重组杆状病毒基因组参照^witrogen公司脂质体转染试剂 Cellfectin II Reagent说明书的方法，经脂质体介导法转染家蚕BmN细胞(为一代杂交种菁松X皓月，由上海生化所赠送)，待该家蚕BmN细胞发病(显微镜下观察)后收集第一代重组病毒悬液并于4°C保存，用Viral DNA Kit (200)(购自OMEGA公司)提取病毒基因组，然后用M13通用引物进行PCR鉴定。将所得鉴定成功的重组杆状病毒命名为 Bmgp64-E2-2A-E0，如图 3 所示。实施例5 重组杆状病毒&iigp64-E2-2A-E0在家蚕BmN细胞中的表达(扩增)和鉴
定
将实施例4中获取的重组杆状病毒angp64-E2-2A-E0以MOI=O. lpfu/cell的剂量感染家蚕BmN细胞对数生长期家蚕BmN细胞中，在含有10%胎牛血清的1 X Sf-900 II SFM培养基(购自hvitrogen公司)中27°C培养3 4 d，收集培养上清；4°C，500 X g离心10 min， 上清液贮于4°C或分装冻存于_70°C。将扩增后的重组杆状病毒以MOI=IO pfu/cell剂量感染家蚕BmN细胞(为一代杂交种菁松X皓月，由上海生化所赠送)，在27°C培养72 h，4°C， 2000g离心IOmin收集细胞沉淀；将该细胞沉淀用pH 7.4的PBS洗涤重悬，样品分别与 2X SDS上样缓冲液混合，60°C加热30 min，进行SDS-PAGE蛋白电泳，Western blotting分析，结果表明，融合蛋白E2-2A-E0已在家蚕BmN细胞中成功表达。实施例6 重组杆状病毒&iigp64-E2-2A-E0在家蚕五龄幼虫及蚕蛹中的表达和鉴定
将实施例5扩增后的重组杆状病毒angp64-E2-2A-E0以MOI=IO pfu/cell的剂量腹部倒数第二节处穿刺接种眠起后的家蚕五龄幼虫和化蛹两天的蚕蛹(为一代杂交种菁松X 皓月，浙江中奇生物药业股份有限公司)，第五天大部分幼虫和蚕蛹出现典型病毒感染症状，剪幼虫腹足收集蚕血淋巴，加0.5% (w/v)抗氧化剂八羟基喹啉，12000rpm离心lOmin， 取上清；将蚕蛹_80°C储存。取12000rpm离心后的蚕血淋巴上清和发病蚕蛹的勻浆液分别加入等体积的2X蛋白质上样缓冲液(IOOMm Tris-HCl,4% SDS，0. 1%溴酚蓝，10%甘油)， 60°C加热30min，取20 μ 1进行SDS-PAGE蛋白电泳，并进行^festern blotting分析。结果表明，融合蛋白E2-2A-E0已在家蚕幼虫和家蚕蛹中获得了成功表达。实施例7 新型猪瘟疫苗的获得
(1)从蚕蛹中分离纯化重组病毒&iigp64-E2-2A-E0
a.取300g经angp64-E2-2A-E0感染的蚕蛹样品，在4°C下解冻后，与4°C放置1h的 ddH20 300ml混合，置于勻浆机中，勻浆2min，冰上放置2min，重复9次；
b.将勻浆液加入一个IL离心杯中，配平，6000rpm离心60min，取上清，小心弃去油
脂；
c.将6000rpm离心上清液倒入另一个IL离心杯中，配平，6000rpm离心60min，取上
清，弃油脂；
d.重复c一次；
e.6000rpm离心的上清液倒入50ml离心管，配平，12000rpm离心30min，取上清，弃油
脂(重复此步骤三次)；f.取12000rpm离心后的上清300ml，用300kD中空纤维膜膜包超滤系统4°C(购自 Sartorius公司)进行超滤，按照上清液与PBS为1:1的体积比上样超滤，如此重复10次， 最终截留液100ml，再用200ml PBS清洗膜包，并与截流液合并；
g.超滤后的样品在超净台上分装于灭菌的超离管中，平衡，40000rpm超高速离心 40min ；
h.40000rpm离心后，取所有上清，及沉淀重悬液(所有沉淀用50ml PBS重悬)分别进行区带离心，上样顺序如下PBS 250ml，样品300ml，30%蔗糖溶液400ml，55%蔗糖溶液充满， 进样结束后加上盖帽，关闭仓门，开启真空泵开始离心，离心结束后用56%蔗糖溶液下样， 用核酸蛋白检测仪监测，收集流出样品，共150mL;
i.区带离心后样品用千分之二甲醛37°C静置灭活Mh;
j.超滤脱糖灭活后样品用300kD中空纤维膜膜包超滤至50mL，再用无菌水稀释至 IOOmL,再超滤至50mL，如此重复10次，最终截留体积为50mL，再用300mL无菌水分3次，每次IOOmL，循环冲洗超滤系统，最终浓缩至50mL，合并两次超滤截流液；
(2)冻干超滤脱糖后样品，用间接ELISA法检测生物活性，有活性的样品进行分装， 于-40°C冷冻干燥；
(3)保存及检测
无菌分装经_40°C冷冻干燥，制成新型猪瘟疫苗冻干粉。同时，再用ELISA鉴定冻干粉中融合蛋白E2-2A-E0的生物活性。12%SDS-PAGE电泳，检测样品，在95kD处有目的蛋白的表达。(4)取纯化鉴定后的重组病毒粒子免疫4周龄的Balb/c小鼠制备多克隆抗体，做血清中和试验，中和效价可达1:32，表明具有良好的免疫原性。血清中和试验步骤如下
将制备的Balb/c小鼠多克隆抗体于56 °C水浴中处理30 min，然后用无血清 Sf-900TMSFM (IX)培养基(购自hvitrogen公司)分别倍比连续稀释至2-8 ；
取50 μ L预先制备的重组杆状病毒&iigp64-E2-2A-E0悬液与相同体积不同稀释度的血清混合均勻，37°C孵育lh，以重组杆状病毒angp64-E2-2A-E0免疫的Balb/c小鼠血清试验组，以PBS免疫的Balb/c小鼠血清阴性对照组，进行血清中和实验；
取生长状态良好的家蚕BmN细胞，稀释细胞密度至1 X 105个/mL，500 μ L/孔，加入M 孔板中；
将病毒-血清混合物以100 μ L/孔接种BmN细胞，不同稀释度血清做三个重复，细胞培养箱中27°C培养；
观察细胞病变情况，计算抗体中和效价。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明精神的范围内，所作的任何修改、等效变化与修饰等，均仍属于本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种家蚕重组杆状病毒aiigp64-E2-2A-E0，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5604。
2.—种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0的制备方法，其特征在于， 所述方法包括以下步骤(a)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列SP和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列TM，通过I/ EcoR I和炀ol/历III双酶切插入 PFastBacI载体多克隆位点上下游两端，构建表面展示系统转移载体pFaStBaCI-gp64 ；(b)采用pvL1393-E2-2A-E0 重组质粒为模板，以 SEQ ID: NO. 6 和 SEQ ID: NO. 7 为引物进行PCR扩增，构建融合基因E2-2A-E0 ；(c)将步骤(b)所得的融合基因E2-2A-E0双酶切产物克隆至步骤(a)所得表面展示系统转移载体pFaStBacI-gp64上，并筛选阳性克隆，获得转移重组质粒 pFastBacI-gp64-E2-2A-E0 ；(d)将步骤(c)所得转移重组质粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0转化大肠杆菌DHlOBac 感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-4 后挑取白斑，培养16-20h后菌液稀释IO6重新涂板做筛选，挑取白斑至LB培养基摇菌培养16-20h后，用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定；(e)取步骤(d)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞， 发病后获得零代病毒悬液0-4°C保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0。
3.—种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0表达的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID: NO. 11所示。
4.一种权利要求3所述蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(a)将权利要求3所述的重组杆状病毒Bmgp64-E2-2A-E0感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；(b)以穿刺接种法接种家蚕五龄幼虫、蛹；(c)收集表达的权利3所述蛋白。
5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒&iigp64-E2-2A-E0在猪瘟疫苗制备中的应用。
6.一种权利要求3所述蛋白在猪瘟疫苗制备中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种猪瘟疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明通过构建一种重组杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将将猪瘟病毒的主要抗原基因E2、E0融合展示在家蚕杆状病毒囊膜表面，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为猪瘟疫苗原进行生产。相比于传统猪瘟疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K39/187GK102559614SQ201210005619
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者张学赛, 张耀洲, 舒特俊, 陈剑清 申请人:天津耀宇生物技术有限公司