专利名称：生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及培养细胞生产疫苗的方法，特别是涉及一种生物反应器微载体培养动 物细胞生产猪瘟疫苗的方法。
背景技术：
猪瘟(HC)是由猪瘟病毒(Hog cholera virus, HCV)引起的猪的一种高度传染性 疾病，它流行广泛，发病率、死亡率高，给养猪业造成了严重的经济损失。现有预防和控制猪 瘟的最有效的方法是接种猪瘟疫苗现用于猪瘟病毒培养的细胞载体主要有牛睾丸原代细胞(BT细胞)、猪肾细胞(PK 细胞)、猪睾丸细胞(ST细胞)等。由于我国牛群较普遍存在BVD/MBV病，用牛睾丸细胞原 代细胞制苗，易造成细胞外源病毒污染，且产毒滴度不高，批间差异大，给疫苗产量、效力的 提高带来困难。而且牛睾丸细胞为原代细胞，细胞的寿命有限，每次制苗需重新获得细胞。 而猪肾细胞、猪睾丸细胞为连续传代细胞系，取材容易易于放大进行规模化培养，有逐渐取 代牛睾丸细胞生产猪瘟疫苗的趋势。非专利文献1表明PK、ST、MPK细胞对猪瘟病毒敏感， 多种猪瘟病毒疫苗株在猪肾细胞或猪睾丸细胞上适应而得到疫苗株。现有的猪肾细胞、猪睾丸细胞规模化生产工艺为转瓶(roller bottle)培养，细胞 扩增较为缓慢，且过程条件不均一，批间差较大，同样也存在产毒滴度较低的问题。生产规 模放大的方式为增加转瓶数量、扩建厂房、添购重复设备等，而且培养过程对PH、溶氧、营养 物补加等不可定量监控，过程较粗放。同时由于所需转瓶较多，存在易污染的机会。另外由于转瓶的特性，使其培养方式只能为批培养，单位体积细胞数量较少，单次 培养细胞产物较少。专利文献1公开了一种细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，但是其所用生 产方法为传统的转瓶培养，对生产疫苗的产量和质量仍有一定的限制。将生物反应器技术 结合微载体技术应用到宿主细胞培养上，通过接种猪瘟病毒毒株进行病毒培养和收获，并 用于制备疫苗的生产工艺还未见报道。专利文献1 :CN 101181637A非专利文献1 猪瘟病毒及其疫苗研究进展，中国病毒学，第11卷第3期第201 207页，1996年9月
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用大规模生物反应器培养动物细胞生产猪瘟疫苗 方法。该方法可解决现工业大规模转瓶培养效率低下，规模放大粗放，单位体积动物细胞数 量较少的问题，进行集约生产。同时由于生物反应器各连接管路均为密闭管道，可减少污染 的发生，易于控制产品的批间质量，还可优化培养方式，使用特殊的培养策略-灌注培养模 式进行细胞培养，使细胞时刻处于最佳生长状态。本发明提供一种大规模生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法，其 包括以下步骤
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1)用转瓶或小规模反应器微载体扩增培养动物细胞并制成细胞悬液；2)在大规模反应器的微载体上接种由步骤1)生产的细胞悬液并进行培养；3)将猪瘟疫病毒接种于上述步骤2)的大规模反应器微载体上的细胞并进行繁 殖；
4)收获病毒液，生产猪瘟疫苗。 其中，所述小规模反应器的体积为IOL以下，所述大规模反应器的体积为100 IOOOLo本发明具有如下有益效果1.细胞培养、病毒复制采用的设备为生物反应器，可对培养过程进行监控及定量 控制，生产工艺稳定，同时结合细胞的贴附载体_微载体，并采用优化的灌注培养系统及方 法，可实现细胞的悬浮培养，提高单位体积细胞的数量，从而提高病毒的产毒量。2.采用本发明培养的猪瘟细胞毒液病毒含量高，提高单位生产效率，并且使用高 滴度抗原制造的猪瘟疫苗可大大提高疫苗的免疫效力。产品效力及安全性与转瓶培养相当 或优于转瓶培养。
图1是表示反应器微载体培养猪睾丸细胞生长曲线的图；图2是反应器微载体培养猪睾丸细胞的细胞照片。
具体实施例方式本发明提供一种大规模生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法，其 包括以下步骤1)用转瓶或小规模反应器微载体扩增培养动物细胞并制成细胞悬液；2)在大规模反应器的微载体上接种由步骤1)生产的细胞悬液并进行培养；3)将猪瘟疫病毒接种于上述步骤2)的大规模反应器微载体上的细胞并进行繁 殖；4)收获病毒液，生产猪瘟疫苗。其中，所述小规模反应器的体积为IOL以下，所述大规模反应器的体积为100 IOOOLo就本发明而言，首先，从细胞工作种子液氮库中复苏ST或PK细胞，先在方瓶中传 代扩增，再培养到转瓶，进而消化转瓶细胞转移到小规模反应器中进行培养，在转瓶或小规 模反应器中放大动物细胞数量，挑选形态健康、生长良好的细胞作为下一级反应器的种子 细胞。接着，连接反应器气路管、进液管、出液管等管路，水化微载体，然后将微载体置反 应器罐体中同时进行高压湿热灭菌，通过反应器的微载体/细胞截留装置将高压液体排 出，然后打入新鲜的细胞培养液，进行预培养备用。微载体水化过程称取一定量微载体置一干净容器，使用无Ca2+、Mg2+的 PBS(50-100mL/g)在室温下水化过夜并不时温和搅拌。弃去上清，加入新鲜的无Ca2+， Mg2+的PBS(30-50mL/g)，温和搅拌几分钟洗涤2次，弃去洗涤的PBS，加入无Ca2+、Mg2+的PBS(30-50mL/g)。高压湿热过程连接反应器个管路，121°C高压湿热灭菌30min微载体商品化的微载体如与GE生产的Cyt0deXl、Cyt0deX3等类似的微载体均可 使用。微载体的加入量3_20g/L，优先选用5-10/L。然后，将挑选形态健康、生长良好的转瓶生产细胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化， 制成细胞悬液，按一定细胞密度(2X 105-6X 105个/ml)接种反应器，调节反应器的温度、培 养液PH、溶氧等参数，使细胞生长于最适宜环境进行细胞培养。同时采用灌注培养模式进行 培养。溶氧是细胞代谢中的重要养分。它可以影响细胞的产率，且间接或直接地影响细胞 的代谢。在低氧压下，细胞往往生长缓慢。而氧压过高，使培养液会变得对细胞具有毒性。细胞生物反应器有相应的通气系统。可通过微机有序地定量地控制加入动物细胞 培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的比例来控制细胞 培养液中的PH值和溶氧水平，使系统始终处于最佳状态。可根据需要选择传统培养基添加 8-10 %新生牛血清或特殊低血清培养基添加3-5 %新生牛血清进行细胞培养扩增。胰蛋白酶/EDTA消化液浓度0. 25%胰蛋白酶0. 02% EDTA细胞接种密度2X 105_6X 105个/ml反应器温度37 士 0.2 °C培养液pH 6. 8-7. 4，优选于 7. 0-7. 2培养液溶氧30-50%灌注过程细胞接种第2天，根据细胞的生长汇合情况判断是否需进行灌注培养 及灌注体积。一般初始灌注体积为反应器1个工作体积，以后逐渐增加日灌注量。细胞长满时间及密度培养5天左右细胞密度可达4X 106_7X 106个/ml。另外，待接种细胞还可以是由小规模反应器微载体培养的传代细胞，其特殊之处 在于用胰蛋白酶/EDTA消化液消化的过程和条件停止小规模反应器的搅拌，使微载体自 然沉降，泵出上清培养液，用PH7. 6的含有0. 02% (w/v) EDTA的无Ca2+，Mg2+离子的PBS洗涤 2-3遍，EDTA-PBS溶液使用量为反应器1个工作体积，然后用消化液(0. 25%胰酶-0. 02% EDTA)作用。条件如下温度37°CpH 7. 4-8. 0,优选 7. 6-7. 8转速30-80rpm,优选60-70rpm时间10min-30min，优选 15_20min反应结束后加入消化时工作体积的1-2倍的细胞培养液终止胰酶的作用，即得到 微载体与细胞分离开来的混合液。然后通过一个大约lOOum的对于动物细胞无毒性的筛网 无菌过滤，得到细胞悬液。接着，用细胞维持液将新鲜毒种制成病毒悬液接种反应器微载体良好单层细胞， 细胞沉降后更换为维持培养液，pH值在7. 1-7. 5的范围之间，优选于7. 3-7. 4，温度37°C左 右。每隔2-3日沉降微载体细胞，收获1次，从第2次起的第2收、第3收的病毒液作为工 作毒种。其它收次检测合格的毒液作为制苗毒液使用，并将病毒液置_15°C -20°C保存， 留样检测，检测方法及要求按照《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行。
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维持液:MEM低血清培养基(MD 611北京清大天一生物技术有限公司)新生 牛血清毒种接种量5体积％实施例
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。实施例1 (反应器微载体培养从转瓶培养的种子猪睾丸细胞)转瓶培养ST细胞(来自于武汉大学中国典型培养物保藏中心)，当细胞长成致密 单层时，细胞密度约达到IXio6个/ml以上时，挑选形态健康、生长良好的单层细胞作为工 作细胞，所述密度是通过将同批转瓶生产的细胞抽取一瓶制成细胞悬液来检测细胞密度， 以此作为该批次的密度。连接反应器气路管、进液管、出液管等管路，水化CytodeXTMl微载体(GE Healthcare)，然后将微载体置反应器罐体中同时进行121°C高压湿热灭菌，通过反应器的 微载体/细胞截留装置将高压液体排出，然后打入新制备的细胞培养液，进行预培养备用。将30个15L转瓶生产细胞使用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，制成细胞悬液，按 5父105个/!111的细胞密度接种到0^￥0冊5 100L反应器(北京天和瑞生物科技公司)，采 用灌注培养模式进行细胞培养。培养条件细胞接种密度5X IO5个/ml，工作体积70L，微 载体浓度8g/L，反应器温度36-37°C，培养液pH 7. 0-7. 2，培养液溶氧30_50%。灌注过 程细胞接种第2天，根据细胞的生长汇合情况(一般细胞大约汇合90%时)和检测培养液 中的葡萄糖含量，判断是否需进行灌注培养及灌注体积。一般初始灌注体积为反应器1个 工作体积，以后逐渐增加日灌注量，以保证反应器中的葡萄糖浓度不低于0. 1-0. 5g/L。图1 是表示反应器微载体培养猪睾丸细胞生长曲线的图，细胞长满时间及密度培养5天，密度 达 5. 4X IO6 个/ml。实施例2 (反应器微载体培养从转瓶培养的种子猪肾细胞(PK-15))将实施例1的培养细胞改为猪肾细胞(PK-15)(来自于武汉大学中国典型培养物 保藏中心)，除此之外，按照与实施例1相同的方法进行操作。细胞长满时间及密度培养4 天，密度达4. 3X IO6个/ml。实施例3 (100L反应器微载体培养5L反应器微载体培养的猪睾丸细胞)用CLAVORUS 5L反应器传代扩增ST细胞，当细胞密度达到5 X IO5个/ml以上时， 挑选形态良好无污染的单层细胞作为工作细胞及生产细胞，所述密度是通过将同批小规模 反应器生产的细胞抽取一个制成细胞悬液来检测其细胞密度，以此作为该批次的密度。连接CLAVORUS 100L反应器气路管、进液管、出液管等管路，水化Cytodexl 微载 体，然后将微载体置反应器罐体中同时进行121°C高压湿热灭菌，通过反应器的微载体/细 胞截留装置将高压液体排出，然后打入新鲜的细胞培养液，进行预培养备用。按下述过程用胰蛋白酶/EDTA消化液消化挑选好的CLAVORUS 5L反应器生产的 细胞，制成细胞悬液。消化过程停止小型反应器的搅拌，使微载体自然沉降，泵出上清培 养液，用 PH7. 6 的含有 0. 02% (w/v)EDTA 的无 Ca2+，Mg2+ 离子的 PBS 洗涤 2-3 遍，EDTA-PBS 溶液使用量为反应器1个工作体积，1个工作体积是指反应器总体积的70%，然后用消化液 (0. 25%胰酶-0. 02% EDTA)作用。作用条件如下温度:37°C，PH 7. 6，转速60rpm，时间 20min。反应结束后加入消化时工作体积的1-2倍的细胞培养液终止胰酶的作用，即得到微载体与细胞分离开来的混合液。然后通过一个大约lOOum的对于动物细胞无毒性的筛网无 菌过滤，得到细胞悬液。将所得细胞悬液按5 X 105个/ml的细胞密度接种到CLAVORUS 100L反应器，采 用灌注培养模式进行细胞培养。培养条件细胞接种密度5X 105个/ml，工作体积70L，微 载体浓度10g/L，反应器温度36-37°C，培养液pH:7. 0-7. 2，培养液溶氧30-50 %。灌注 过程细胞接种第2天，根据细胞的生长汇合情况(一般细胞大约汇合90%时)和检测培 养液中的葡萄糖含量，判断是否需进行灌注培养及灌注体积。一般初始灌注体积为反应器 1个工作体积，以后逐渐增加日灌注量，以保证反应器中的葡萄糖浓度不低于0. 1-0. 5g/L。 细胞长满时间及密度培养5天，密度达6 X 106个/ml。实施例4 (1000L反应器微载体培养10L反应器微载体培养的猪睾丸细胞)将5L的反应器换成10L的反应器，将100L的反应器换成1000L的反应器，除此之 外，按照与实施例3相同的方法操作，细胞长满时间及密度培养5天，密度达5. 8X 106个 /ml。实施例5 (猪睾丸细胞(ST)毒种的繁殖及制苗毒液的繁殖)猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)维持液:MEM低血清培养基(MD 611北京清大天一生物技术有限公司)新生 牛血清毒种接种量5体积％繁殖过程用细胞维持液将新鲜毒种制成病毒悬液接种于100L反应器微载体良 好生长的单层细胞，细胞沉降后更换为维持培养液，维持PH7. 4左右，温度37°C左右。每隔 2-3日沉降微载体细胞，收获1次，从第2次起的第2收、第3收的病毒液作为工作毒种。其 它收次检测合格的毒液作为制苗毒液使用，并将病毒液置_15°C -20°C保存，留样检测， 检测方法及要求按照《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行，冻融1次，过滤、灭活、乳 化后制备疫苗。比较例1 (转瓶培养ST细胞生产猪瘟病毒)转瓶规格为15L反应温度37°C培养液pH: 7.1培养液溶氧30-50%转瓶常规培养ST细胞后按照与实施例5相同的方法进行ST毒种的繁殖及制苗毒 液的繁殖，按照中华人民共和国兽药典)》(2005年版)的方法检测收获毒液，结果列于下表。表1转瓶间歇换液收毒与100L反应器微载体灌注培养ST细胞收获毒液比较
7毒液收获形式接毒后收获天 数收获体 积病毒平均毒价15L转瓶培养间歇收获3015L>5 x 105家兔感染 量100L反应器微载体培养连续 收获302500L>5 x 105家兔感染 量由表1可以看出，1个100L反应器微载体灌注培养ST细胞收获猪瘟病毒液的量相 当于160多个15L转瓶的产量。工业上的应用性利用本发明的方法生产的猪瘟疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低等特点， 是目前工业化大生产放大的最佳策略之一，具有很好的经济效益和应用前景。
权利要求
一种大规模生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法，其包括以下步骤1)用转瓶或小规模反应器微载体扩增培养动物细胞并制成细胞悬液；2)在大规模反应器的微载体上接种由步骤1)生产的细胞悬液并进行培养；3)将猪瘟疫病毒接种于上述步骤2)的大规模反应器微载体上的细胞并进行繁殖；4)收获病毒液，生产猪瘟疫苗。其中，所述小规模反应器的体积为10L以下，所述大规模反应器的体积为100～1000L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)用微载体培养细胞是按以 下过程进行的将微载体经水化和121°C高温灭菌之后，接种所述动物细胞，微载体的 加入量为3-20g/L，接种密度为2X 105-6X 105cells/ml，接着培养细胞到细胞密度为 4X 106-7X 106cells/ml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养细胞采用灌注培养方式。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述动物细胞为猪睾丸细 胞即ST细胞或猪肾细胞即PK15细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)的细胞培养阶段的培养液的pH值 维持在6. 8-7. 4的范围内，步骤3)的病毒繁殖的pH值维持在7. 1-7. 5的范围内。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)细胞培养的培养液和步骤3)病毒 繁殖的培养液的PH值维持在7. 1-7. 4的范围内。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中的细胞悬液用0.25%胰 酶-0. 02% EDTA消化液消化，其pH值维持在7. 4-8. 0。
全文摘要
本发明提供一种大规模生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法，其包括以下步骤1)用转瓶或小规模反应器微载体扩增培养动物细胞；2)在反应器的微载体上接种步骤1)生产的细胞悬液并进行培养；3)将猪瘟疫病毒接种于反应器微载体上的细胞并进行繁殖；4)收获病毒液，生产猪瘟疫苗。利用本发明的方法生产的猪瘟疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低。
文档编号C12N7/00GK101875917SQ20091008276
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者刘俊生, 张韧, 王建超, 陈文庆 申请人:北京清大天一科技有限公司