专利名称：结合助效剂的光刺激方法及光刺激套组的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种光刺激方法及光刺激套组，尤指一种结合光助剂的光刺激方法及光刺激套组，其可促进胶原蛋白合成、加强抑制细菌生长或抑制黑色素形成。
背景技术：
在皮肤科诊断中，常以药物治疗患者皮肤疾病，如青春痘等，但长期以来，药物治疗的结果多伴随着副作用，长期服用会造成身体代谢上的负担，且治疗效果不尽理想，常有复发之虞，无法有效改善患者的皮肤问题。近年来，医疗美容产业日益兴盛，研究指出:波长介于400nm至475nm的蓝光常用于于青春痘治疗，由于痤疮杆菌(Propionibacterium acnes)或组织细胞中的内紫质(Coproporphyrin)为一种光感物质,其会与蓝光作用产生有毒性的单相氧与自由基,进而破坏细菌及部份皮脂腺组织细胞，改善青春痘的红肿发炎。再者，波长介于600nm至750nm的红光、波长介于550nm至600nm的黄光、及波长介于500nm至570nm的绿光，能够刺激真皮层的纤维母细胞，进而促进胶原蛋白合成，防止皮肤老化。此外，目前除了使用激光或脉冲光进行光疗，更已积极发展一般光源或发光二极管(LED)光源来取代上述高强度光源，以避免造成细胞损伤。但由于发光二极管光源的能量较弱，需找到适当的光照度才足以达到效果；光线照度过低会无法发挥疗效，光线照度过高会造成细胞受损，亦会使装置体积提升，无法发展体积小且重量轻的可携式光疗装置。因此，目前亟需发展一种结合助效剂的光刺激方法及光刺激套组，以提升胶原蛋白合成、加强抑制细菌生长或抑制黑色素形成，并可节省人力与时间成本，使患者能快速拥有美丽的肌肤。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种结合助效剂的光刺激方法，能提升胶原蛋白合成、加强抑制细菌生长或抑制黑色素形成。本发明的一种结合助效剂的光刺激方法，包括以下步骤:提供一发光二极管、一助效剂，该光源为一黄光发光二极管、一红光发光二极管、一绿光发光二极管、一蓝光发光二极管或其组合，该助效剂包含0.5至2%钙离子；以及将该助效剂添加于一主体，再将该发光二极管照射于该主体，以促进胶原蛋白合成、抑制细菌生长或抑制黑色素形成，其中，该黄光发光二极管的照度为1000至3500勒克司(lux，lx)，该红光发光二极管的照度为6000至9500勒克司，该绿光发光二极管的照度为1000至5000勒克司，该蓝光发光二极管的照度为3000至7000勒克司。于本发明的光刺激方法中，该助效剂包含0.5至2%钙离子，较佳为I至2%钙离子，更佳为1.5至2%钙离子。于助效剂中，钙离子浓度过低或过高皆无法有效发挥功效。此外，该助效剂可包含任何其他已 知作为缓冲剂、载剂等成份，且其对于细胞型态、细胞生长、细胞代谢等不会造成影响；并且，该助效剂的形态不限，可为粉状、液态、胶状、固态等，及添加方式亦不受限，使该助效剂接触该主体即可。由此，将该助效剂添加于该主体再以该光源照射后，可将该助效剂移除；若将进行第二次以上的光源照射，而每次照射的间隔时间内，可因需求添加该助效剂于该主体，于再次光源照射时，需将旧的助效剂移除，再重新添加该助效剂，以进行再次光源照射。根据本发明的结合助效剂的光刺激方法，可提供一种结合助效剂的二极管光源刺激方法，于具体实施例中，该主体较佳为一纤维母细胞、一巨噬细胞或其组合。其中，该光源较佳为该黄光发光二极管、该红光发光二极管、或该绿光发光二极管，但不在此限。再者，该黄光发光二极管的波长范围可介于550nm至600nm之间，该红光发光二极管的波长范围可介于600nm至750nm，该绿光发光二极管的波长范围可介于500nm至570nm。此外，该黄光发光二极管的照度介于1000至3500勒克司，较佳为2000至2500勒克司；该红光发光二极管的照度介于6000至9500勒克司，较佳为7500至8500勒克司；该绿光发光二极管的照度介于1000至5000勒克司，较佳为2000至3500勒克司。于此，该发光二极管的照射时间无限制，只要能够达到上述功效而且不会对该主体造成伤害即可，可以根据该红光发光二极管与该黄光发光二极管所发出光线的预定照度而有所调整，当照度较高时，便能用较短的照射时间就达到相同效果；反之，当照度较高时，则可用较长的照射时间达到相同的效果。于本发明一较佳具体实例中，发光二极管的照射时间较佳为5分钟至30分钟。再者，将该发光二极管照射于该主体的次数较佳为2次以上，但不受限于此；而每次照射的间隔时间可为I至36小时，较佳为12小时至24小时，更佳为24小时。由二极管光源照射可刺激该纤维母细胞，使胶原蛋白合成量增加，其是由于巨噬细胞(macrophage)的细胞因子(cytokine)释放,细胞因子再刺激纤维母细胞分裂；或者，部份二极管光源如红光、绿光，能够直接刺激纤维母细胞的DNA合成、或增加激纤维母细胞的生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)分泌。然而，这三者皆与纤维母细胞内的钙离子浓度成正相关，因此，使用二极管光源刺激该纤维母细胞时，添加助效剂能够有效提升胶原蛋白合成，亦不会对于该纤维母细胞造成伤害。此外，若该主体为体外细胞，则可先经过上述处理后，再将经处理的细胞植回生物体达到上述功效。由此可知，本发明所述的主体，指受光照刺激的物体。根据本发明的另一具体实施例，该主体较佳为一痤疮杆菌或一黑色素细胞，其中，该发光二极管较佳为该蓝光发光二极管，且该蓝光发光二极管的波长范围可介于400nm至475nm之间，但不受限于此。再者，该蓝光发光二极管的照度介于3000至7000勒克司，较佳为5000至5800勒克司。于此，该发光二极管的照射时间无限制，较佳为15分钟至90分钟；照射次数不限。使用二极管蓝光光源照射该痤疮杆菌时，添加助效剂能够有效抑制该痤疮杆菌生长，于本发明的实施例中，以二极管蓝光光源伴随助效剂照射该痤疮杆菌时，照射时间达60分钟即可100%完全抑制痤疮杆菌。此外，黑色素细胞在合成黑色素时，需要有酪氨酸酶(Tyrosinase)才可进而形成黑色素。除了蓝光能有效抑制黑 色素合成，钙离子可直接抑制酪氨酸酶的活性，因此，使用二极管蓝光光源照射该黑色素细胞时，添加助效剂能够有效达到减少黑色素形成、沉淀，亦不会对于该黑色素细胞造成伤害。再者，若该主体为皮肤，对于皮肤表面的青春痘或痤疮细胞，结合助效剂照射则可有效调节皮肤细胞的分裂、分化，减少皮脂分泌，及控制毛囊导管部位的表皮细胞增生，达到杀菌及治疗的效果；或者对于皮肤表面的黑色素细胞，助效剂照射则可更抑制其合成黑色素，避免皮肤色度增加而达到美白效果。本发明的另一目的在于提供一种光刺激套组，包括:一光刺激装置；以及一助效剂。使用本发明的光刺激套组，照射前先将该助效剂添加于一主体，再使用该光刺激装置，其采用发出特定照度范围的红光发光二极管、黄光发光二极管、或绿光发光二极管，以期达到刺激纤维母细胞，增加胶原蛋白合成，同时促进血液循环、加快老废细胞代谢；或者发出特定照度范围的蓝光发光二极管，以期抑制、毒杀痤疮杆菌，或降低及抑制黑色素细胞内黑色素的合成。为达成上述目的，本发明的具体实施是提供一种光刺激装置，包括:一壳体，形成一容置空间且具有一顶面以及一侧缘，该顶面设有一出光口 ；一散光片，覆盖该壳体的该出光口 ；一第一光源模块，其设置于该壳体的该容置空间内且具有一第一发光二极管，该第一发光二极管设于该散光片下方，且该第一发光二极管选自由红光发光二极管、黄光发光二极管、以及蓝光发光二极管所组群组的其中一者，其中，该黄光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为1000至3500勒克司(Iux)，该红光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为6000至9500勒克司，该绿光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为1000至5000勒克司，且该蓝光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为3000至7000勒克司；以及一控制模块，其是电性连接该第一光源模块与一电源模块。于本发明上述光刺激装置中，该电源模块可为一外部电源或设置于该壳体的该容置空间内。若该电源模块设置于该壳体的该容置空间内，其可包含可充式电池或者可容纳一般的干电池或者微型电池，达到供应电源的效果。另一方面，若电源模块为一外部电源或者为设置于该壳体的该容置空间内的可充式电池，该控制模块可具有选择性地包括:一充电孔，以供该电源模块电性连接该控制模块。除此之外，于本发明上述光刺激装置中，该控制模块也可具选择性地包括:一电源开关，设置于该壳体表面，以控制该电源模块供应电源。此外，该壳体较佳是由透光率低的材料所构成，如反射性高或密度高的材料，以减少光刺激装置的漏光现象。此外，本领域人士亦可通过各种结构设计，增加光刺激装置整体结构的密合度，以降低光刺激装置的漏光现象。另一方面，于本发明上述光刺激装置中，该壳体的该侧缘可选择性设有一出光孔。此情况下，光刺激装置可以还包括:一透光片，覆盖该出光孔；以及一第二光源模块，其是对应透光片设置并发出光线穿过该透光片。此情况下，该控制模块亦可再包括:一模式切换开关，皆设置于该壳体表面，以启动该第一光源模块或该第二光源模块，换言之，即切换第一光源模块与第二光源模块之间的作动。于本发明上述光刺激装置中，设于该出光口的该散光片，可以有利于均勻出光，避免诊疗光直接照射使用者眼睛 ，并提高装置光刺激效果的均匀性，换言之即将原本属于点光源的发光二极管，经过散光作用后，在出光口处形成面光源；另外，设于该出光孔的该透光片，则不一定需为散光片，若为散光片则可以达到上述效果，若非为散光片，则可以直接传递点光源所提供的光线。于本发明上述光刺激装置中，该第一光源模块与该第二光源模块可以设计成可替换式，换言之使用红光发光二极管、黄光发光二极管或蓝光发光二极管组成该第一光源模块与该第二光源模块。若需要红光照射时，则替换成由红光发光二极管构成的光源模块；而需要蓝光照射时，贝1J替换成由蓝光发光二极管构成的光源模块。除此之外，亦可以将该第一光源模块与该第二光源模块中所使用的发光二极管设计成可替换式，换言之若需要红光照射时，则将光源模块上的发光二极管拆换成红光发光二极管。现有技术通常使用不同波长的激光或脉冲光达到青春痘治疗、刺激真皮层的纤维母细胞提升胶原蛋白合成，不过因激光或脉冲光强度极高且设备庞大，一般消费者难以拥有。近来，虽有使用发光二极管做为光源，期望可以达到上述治疗青春痘与提升胶原蛋白的效果，但由于现有未有研究针对发光二极管发光的照度对于细胞或菌体的影响，因在未设定特定照度的前提下，现有方法是否可以达到上述效果实属未知。而本发明所述方法，除了利用发出蓝光、绿光、黄光或红光的发光二极管做为光源，并将其限定于不同照度范围。照射过程中，还使用含钙离子成份的助效剂，因此可以确保有效达到刺激纤维母细胞提升胶原蛋白合成、更加抑制或毒杀痤疮杆菌、有效降低及抑制黑色素细胞内黑色素的合成，进而达到治疗青春痘及美白或者抗老化的功效。
图1为本发明实施例一光刺激装置的结构示意2为本发明实施例一光刺激装置的侧面3为本发明实施例一光刺激装置的系统方块图。图4A-图4C分别是本发明实施例1-3的胶原蛋白生成率。图5A-图5C分别是本发明实施例4-6的纤维母细胞存活率。图6是本发明实施例7的黑色素生成率。图7是本发明实施例8的黑色素细胞存活率。图8是本发明实施例9的抑菌百分比。主要元件符号说明壳体10出光口 111散光片14出光孔121透光片13第二发光二极管51第一光源模块40第一发光二极管41第二光源模块50电源模块20控制模块30 充电孔33顶面11电源开关31侧缘12模式切换开关3具体实施例方式以下是通过特定的 具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技艺的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明亦可通过其他不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。本发明的实施例中该等图式均为简化的示意图。但所述图标仅显示与本发明有关的元件，其所显示的元件非为实际实施时的态样，其实际实施时的元件数目、形状等比例为一选择性的设计，且其元件布局型态可能更复杂。[实施例1-光刺激装置]参考图1至图3，其中图1为本发明光刺激装置的结构示意图，图2为本发明光刺激装置的侧面图，图3为本发明光刺激装置的系统方块图。如图1至图3所示，本发明的光刺激装置包括:一壳体10、一散光片14、一透光片
13、一第一光源模块40、一第二光源模块50以及一控制模块30。该壳体10形成一容置空间，可以容纳各个模块。此外，该壳体10具有一顶面11以及一侧缘12，该顶面11设有一出光口 111，该侧缘12设有一出光孔121。位于该顶面11的该出光口 111处，使用该散光片14覆盖；位于该侧缘12的该出光孔121，使用该透光片13覆盖。此外，该第二光源模块50对应透光片13设置于该壳体10的该容置空间，并发出光线穿过该透光片13，且具有至少一第二发光二极管51。于此，若该透光片13仅单纯用于透光而非用于散光，则第二光源模块50则成为点光源。该第一光源模块40设置于该壳体10的该容置空间内且具有阵列排列的多个第一发光二极管41,该第一发光二极管41设于该散光片14下方,且该第一发光二极管41选自由红光发光二极管、黄光发光二极管、以及蓝光发光二极管所组群组的其中一者，其中，该黄光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为1，000至3，500勒克司(Iux)，该红光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为6，000至9，500勒克司，且该蓝光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为3，000至7，000勒克司。该控制模块30电性连接该第一光源模块40与一电源模块20，且该控制模块30包括:一充电孔33,以供该电源模块20电性连接该控制模块30 ;—电源开关31,设置于该壳体10表面，以控制该电源模块20供应电源；以及一模式切换开关32,皆设置于该壳体10表面，以启动该第一光源模块40或该第二光源模块50。该电源模块20可为一外部电源或设置于该壳体10的该容置空间内。当该电源模块20设置于该壳体10的该容置空间内，该电源模块20可含可充式电池或者可容纳一般的干电池或者微型电池，达到供应电源的效果。因此，上述光刺激装置采用发出特定照度范围的红光发光二极管、黄光发光二极管、或绿光发光二极管，在添加助效剂下，便可有效达到刺激纤维母细胞，增加胶原蛋白合成，同时促进血液循环、加快老废细胞代谢；若采用发出特定照度范围的蓝光发光二极管，在添加助效剂下，便可有效抑制、毒杀痤疮杆菌，或加强降低及抑制黑色素细胞内黑色素的合成。于本发明的下述实施例中，皆使用实施例1的发光二极管装置照射，其可以发出不同照度的发光二极管黄光、红光、绿光、蓝光。以及，下述实施例所使用的助效剂为晶化生医公司提供的「钙-T复合物」，于实验例中，将「钙-T复合物」与ddH20调配成0.25% (V/V)的「钙-T复合物」 。
[实验例1-助效剂+发光二极管红光(Lux8480)的胶原蛋白生成率]首先，将人类纤维母细胞悬浮于DMEM培养液，取2 X 104个细胞接种于48孔盘中，每孔体积为0.5ml，置于细胞培养箱内培养24小时。其中，细胞培养箱设定为37°C、5% C02。接着，移除DMEM培养液，分别加入500 μ I的含0.25%助效剂的PBS缓冲液，并使用发光二极管红光(Lux 8480)分别照射5、10、15、及30分钟，然后，移除PBS缓冲液，再分别加入500 μ I的含0.25%助效剂的DMEM培养液，置于培养箱内培养24小时。接着，重复前一段落步骤，再次给予细胞发光二极管红光照射并于培养箱内培养24小时。然后，取出DMEM培养液至离心管，并加入500 μ I的PBS缓冲液轻轻冲洗培养盘，取出PBS缓冲液至另一离心管，两管分别加入500 μ I的0.5Μ的醋酸，静置I小时，其中醋酸的温度为4°C。I小时后，使用微量吸管(pipet)取出500μ I至1.5ml离心管，分别在1.5ml 离心管中加入 50 μ I 酸中和剂(Acid Neutralizing reagent, Biocolor)及 100 μ I萃取 & 浓度试剂(Isolation & Concentration Reagent, Biocolor),置入 4°C冰箱静置一晚。之后，以12000rpm离心10分钟，移除上清液，再分别加入Iml Sircol染剂(Biocolor)，于(TC的温度下以震荡器摇晃45分钟。反应后以12000rpm离心10分钟，移除上清液，再分别加入750 μ I酸性-盐类洗漆试剂(Acid-Salt Wash Reagent, Biocolor),并以12000rpm离心10分钟。最后，移除上清液，加入250 μ I碱性试剂(Alkali Reagent, Biocolor),分别自
1.5ml离心管取出200 μ I至96孔盘，以酵素免疫分析仪(ELISA Reader SpectraMax M2)测量555nm波长下的吸光值。胶原蛋白生成率(％ )=(实验组的吸光值/控制组的吸光值)X 100%。其中实验组分别照射发光二极管红光5、10、15、30分钟的组别，控制组是以相同实验方法及材料处理，差别仅在于未给予助效剂；即给予实验组助效剂时，给予控制组的PBS缓冲液和DMEM培养液中皆无添加助效剂。实验结果如图4A所示，经过发光二极管红光(Lux 8480)照射30分钟后，胶原蛋白生成量提升至112%，显示助效剂能有效提升纤维母细胞的胶原蛋白生成量。[实验例2-助效剂+发光二极管黄光(Lux2290)的胶原蛋白生成率]实验方法、步骤、及条件如实验例I所述，除了使用发光二极管黄光(Lux 2290)取代发光二极管红光(Lux 8480)照射细胞，实验结果如图4B所示。结果显示:经过发光二极管黄光(Lux 2290)，照射15分钟后，胶原蛋白生成量提升至115%，显示助效剂能有效提升纤维母细胞的胶原蛋白生成量。[实验例3-助效剂+发光二极管绿光(Lux2700)的胶原蛋白生成率]实验方法、步骤、及条件如实验例I所述，除了使用发光二极管绿光(Lux 2700)取代发光二极管红光(Lux 8480)照射细胞，实验结果如图4C所示。结果显示:经过发光二极管绿光(Lux 2700)，照射5分钟后，胶原蛋白生成量提升至160%，显示助效剂能有效提升纤维母细胞的胶原蛋白生成量。[实验例4-助效剂+发光二极管红光(Lux8480)的人类纤维母细胞存活率]首先，将人类纤维母细胞悬浮于DMEM培养液，取2 X 104个细胞接种于48孔盘中，每孔体积为0.5ml,置于细胞培 养箱内培养24小时。
接着，移除DMEM培养液，分别加入500 μ I的含0.25%助效剂的PBS缓冲液，并使用发光二极管红光(Lux 8480)分别照射5、10、15、及30分钟，然后，移除PBS缓冲液，再分别加入500 μ I的含0.25%助效剂的DMEM培养液，置于培养箱内培养24小时。接着，重复前一段落步骤，再次给予细胞发光二极管红光照射并于培养箱内培养24小时。然后，更换新的DMEM培养液，并加入0.125ml的MTT试剂(Sigma)，放置细胞培养箱反应4小时，之后移除孔内液体，再加入0.5ml的DMSO试剂，均匀混合后取0.2ml至96孔盘内，以酵素免疫分析仪(ELISA Reader SpectraMax M2)测量570nm波长下的吸光值。细胞存活率(％)=(实验组的吸光值/控制组的吸光值)X 100%，其中实验组与控制组的定义如实验例I所述。实验结果如图5A所示，伴随助效剂并通过发光二极管红光(Lux 8480)照射的5 30分钟内，结果显示细胞存活率增加至120 140%，大于人为误差的± 10%，因此，助效剂能有效提升发光二极管红光(Lux 8480)刺激人类纤维母细胞的细胞分裂数目。[实验例5-助效剂+发光二极管黄光(Lux2290)的人类纤维母细胞存活率]实验方法、步骤、及条件如实验例4所述，除了使用发光二极管黄光(Lux 2290)取代发光二极管红光(Lux 8480)照射细胞，实验结果如图5B所示。结果显示:伴随助效剂并通过发光二极管黄光(Lux 2290)照射的30分钟内，结果显示细胞存活率皆于人为误差±10%内，人类纤维母细胞的存活情形皆无显著改变。[实验例6-助效剂+发光二极管绿光(Lux2700)的人类纤维母细胞存活率]实验方法、步骤、及条件如实验例4所述，除了使用发光二极管绿光(Lux 2700)取代发光二极管红光(Lux 8480)照射细胞，实验结果如图5C所示。结果显示:伴随助效剂并通过发光二极管绿光(Lux 2700)照射的5 30分钟内，结果显示细胞存活率增加至170 200%，大于人为误差的±10%，因此，助效剂能有效提升发光二极管绿光(Lux 2700)刺激人类纤维母细胞的细胞分裂数目。由实验例4至实验例6结果显示，在助效剂存在下，发光二极管红光(Lux 8480)、发光二极管黄光(Lux 2290)、及发光二极管绿光(Lux 2700)对于人类纤维母细胞皆无毒杀现象，其中发光二极管红光(Lux 8480)及发光二极管绿光(Lux 2700)还可以有效提升LED光刺激人类纤维母细胞的细胞分裂数目。再者，与实验例I至3的胶原蛋白生成量对照，经由助效剂处理后，以发光二极管红光(Lux 8480)照射30分钟，人类纤维母细胞数目增加并且生成较多的胶原蛋白；以发光二极管黄光(Lux 2290)照射15 30分钟，人类纤维母细胞数目无显著改变，但胶原蛋白生成量显著增加；以发光二极管绿光(Lux 2700)照射5 30分钟，人类纤维母细胞数目显著增加并且大幅提升胶原蛋白的生成量。有此，透过助效剂，可以有效提升由LED红光、黄光、及绿光刺激人类纤维母细胞产生的胶原蛋白生成量。[实验例7-助效剂+发光二极管蓝光(Lux5330)的黑色素生成量]首先，将人类黑色素细胞悬浮于含10% FBS(Hyclone)的DMEM培养液，取I X 105个细胞接种于24孔盘中，每孔体积为0.5ml，置于细胞培养箱内培养24小时。接着，移除DMEM培养液，分别加入500 μ I的含0.25%助效剂的PBS缓冲液，并使用发光二极管蓝光(Lux 5330 )分别照射15、30、45、60、及90分钟，然后，移除PBS缓冲液，再分别加入500μ I含0.25%助效剂的DMEM培养液，置于培养箱内培养24小时。然后，移除DMEM培养液，使用胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA试剂使细胞与培养盘分离，取至离心管中并以IOOOrpm离心10分钟，移除上清液，再加入200 μ I的IM NaOH并置于沸水浴10分钟，以酵素免疫分析仪(ELISA Reader SpectraMax M2)测量490nm波长下的吸光值。黑色素生成率(％)=(实验组的吸光值/控制组的吸光值)X 100%，其中实验组与控制组的定义如实验例I所述。实验结果如图6所示，伴随助效剂并以发光二极管蓝光(Lux 5330)照射90分钟后，人类黑色素细胞内的黑色素量降至90%，因此，助效剂加上发光二极管蓝光(Lux5330)能有效抑制酪氨酸酶的活性，进而减少黑色素形成。[实验例8-助效剂+发光二极管蓝光(Lux5330)的黑色素细胞存活率]首先，将人类黑色素细胞悬浮于含10% FBS(Hyclone)的DMEM培养液，取7 X 104个细胞接种于24孔盘中，每孔体积为0.5ml，置于细胞培养箱内培养24小时。接着，移除DMEM培养液，分别加入500 μ I的含0.25%助效剂的PBS缓冲液，并使用发光二极管蓝光(Lux 5330)分别照射5、10、15、30、45、60、及90分钟，然后，移除PBS缓冲液，再分别加入500 μ I的DMEM培养液，置于培养箱内培养24小时。然后，更换新的DMEM培养液，并加入0.125ml的MTT试剂(Sigma)，放置细胞培养箱反应4小时，之后移除孔内液体，再加入0.5ml的DMSO试剂，均匀混合后取0.2ml至96孔盘内，以酵素免疫分析仪(ELISA Reader SpectraMax M2)测量570nm波长下的吸光值。细胞存活率(％)=(实验组的吸光值/控制组的吸光值)X 100%，其中实验组与控制组的定义如实验例I所述。实验结果如图7所示，伴随助效剂并通过发光二极管蓝光(Lux 5330)照射的90分钟内，结果显示细胞存活率皆于人为误差±10%内，人类黑色素细胞的存活情形皆无显著改变。由此，由实验例7及实验例8结果显示，在助效剂存在下，发光二极管蓝光(Lux5330)并不会杀伤人类黑色素细胞，而是通过抑制酪氨酸酶的活性，使黑色素细胞减少黑色素形成。[实验例9-助效剂+发光二极管蓝光(Lux5090)的痤疮杆菌抑制率]首先，进行菌数的测定。将冷冻保存菌液拿出，做三区划线培养，以无菌接种环挑选单一菌落，涂布于平板培养基上。48小时后从平板培养基上刮下菌体溶于无菌水中，以无菌水调OD值(0D600 = 0.1)，并加入光促效剂(Calcium)0.25 %，再以无菌水稀释两倍，得到106的菌液。接着，进行光照条件评估。将上述培养48小时后的106的菌液置入6cm的dish中，每盘菌液体积分别为5ml。以蓝光(Lux 5090)照射0、5、10、15、20、30、45、60、90分钟做测试。然后，将光照后的菌液以10倍稀释为浓度:10-3、10-4、10-5，取各浓度的菌液
0.1ml涂抹于RCM(BD biosciences)培养盘上，另取各浓度的菌液0.1ml培养于5ml液态RCM培养基，一并置入37°C厌氧环境中培养48小时。最后，取出培养盘计算菌数，每盘菌落数以30 300个为有效菌落数，再取液态RCM培养基以0D600观察光照 后痤疮杆菌的生长变化。
实验结果如图8所示，伴随助效剂并通过发光二极管蓝光(Lux 5090)照射的60分钟后，痤疮杆菌的抑制效果可高达100 %，故本发明具有显著的抑菌效果。上述实施例仅是为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述 实施例。
权利要求
1.一种结合助效剂的光刺激方法，包括以下步骤: 提供一发光二极管光源、一助效剂，该光源为一黄光发光二极管、一红光发光二极管、一绿光发光二极管、一蓝光发光二极管或其组合，该助效剂包含0.5至2%钙离子；以及 将该助效剂添加于一主体，再将该发光二极管照射于该主体，以促进胶原蛋白合成、抑制细菌生长或抑制黑色素形成， 其中，该黄光发光二极管的照度为1000至3500勒克司(lux，Ix)，该红光发光二极管的照度为6000至9500勒克司，该绿光发光二极管的照度为1000至5000勒克司，该蓝光发光二极管的照度为3000至7000勒克司。
2.如权利要求书I所述的光刺激方法，其特征在于，该发光二极管光源为该黄光发光二极管、该红光发光二极管、或该绿光发光二极管。
3.如权利要求书2所述的光刺激方法，其特征在于，该主体为一纤维母细胞、一巨噬细胞或其组合。
4.如权利要求书3所述的光刺激方法，其特征在于，该黄光发光二极管的波长范围为介于550nm至600nm之间，该红光发光二极管的波长范围介于600nm至750nm,该绿光发光二极管的波长范围介于500nm至570nm。
5.如权利要求书3所述的光刺激方法，其特征在于中，该发光二极管的照射时间为5分钟至30分钟。
6.如权利要 求书I所述的光刺激方法，其特征在于，该发光二极管光源为该蓝光发光二极管。
7.如权利要求书6所述的光刺激方法，其特征在于，该主体一痤疮杆菌、一黑色素细胞或其组合。
8.如权利要求书7所述的光刺激方法，其特征在于，该蓝光发光二极管的波长范围介于400nm至475nm之间。
9.如权利要求书7所述的光刺激方法，其特征在于，该蓝光发光二极管照射时间介于15分钟至90分钟。
10.一种光刺激套组，其特征在于包括: 一光刺激装置；以及 一助效剂。
11.如权利要求书10所述的光刺激套组，其特征在于，该光刺激装置包括: 一壳体，形成一容置空间且具有一顶面以及一侧缘，该顶面设有一出光口 ； 一散光片，覆盖该壳体的该出光口 ； 一第一光源模块，其设置于该壳体的该容置空间内且具有一第一发光二极管，该第一发光二极管设于该散光片下方，且该第一发光二极管选自由红光发光二极管、黄光发光二极管、绿光发光二极管、以及蓝光发光二极管所组群组的其中一者，其中，该黄光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为1000至3500勒克司(lux，lx)，该红光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为6000至9500勒克司，该绿光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为1000至5000勒克司，且该蓝光发光二极管经过该散光片发出的光线照度为3000至7000勒克司；以及 一控制模块，其是电性连接该第一光源模块与一电源模块。
12.如权利要求书11所述的光刺激装置，其特征在于，该电源模块为一外部电源或设置于该壳体的该容置空间内。
13.如权利要求书12所述的光刺激装置，其特征在于，该控制模块还包括:一充电孔，以供该电源模块电性连接该控制模块。
14.如权利要求书11所述的光刺激装置，其特征在于，该控制模块还包括:一电源开关，设置于该壳体表面，以控制该电源模块供应电源。
15.如权利要求书11所述的光刺激装置，其特征在于，该壳体的该侧缘设有一出光孔。
16.如权利要求书15所述的光刺激装置，其特征在于，还包括:一透光片，覆盖该出光孔；以及一第二光源模块，其对应透光片设置并发出光线穿过该透光片。
17.如权 利要求书15所述的光刺激装置，其特征在于，该控制模块还包括:一模式切换开关，皆设置于该壳体表面，以启动该第一光源模块或该第二光源模块。
18.如权利要求书10所述的光刺激套组，其特征在于，该助效剂包含0.5至2%钙离子。
全文摘要
本发明是关于一种结合助效剂的光刺激方法及光刺激套组，该方法包括以下步骤提供一发光二极管光源、一助效剂，该光源为一黄光发光二极管、一红光发光二极管、一绿光发光二极管、一蓝光发光二极管或其组合，该助效剂包含0.5至2％钙离子；以及将该助效剂添加于一主体，再将该发光二极管照射于该主体，以促进胶原蛋白合成、抑制细菌生长或抑制黑色素形成，其中，该黄光发光二极管的照度为1000至3500勒克司(lux)，该红光发光二极管的照度为6000至9500勒克司，该绿光发光二极管的照度为1000至5000勒克司，该蓝光发光二极管的照度为3000至7000勒克司。
文档编号A61N5/067GK103212163SQ201210016330
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者杜明杰, 萧翊玮, 李钟沛, 张荣监, 黄新凡, 曹育嘉 申请人:福华电子股份有限公司