专利名称：猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗，特别是指一种猪传染性胸膜肺炎多价灭活疫苗，属于兽药疫苗领域。
背景技术：
猪传染性胸膜肺炎(Pocrinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病。该病发生于各年龄段猪只，发病率和死亡率在20%以上，以肺损伤、出血坏死、纤维化为特点，临床特征可见于急性和慢性感染。慢性感染可致日增重下降，生长缓慢，饲料利用率低。该病于1957年由Pattiosn等首次报道，此后逐渐扩散，目前已遍布世界各地。给世界养猪业造成了严重的经济损失。猪场内胸膜肺炎的综合防制必须结合免疫接种、治疗及饲养管理等多方面的措施。对感染猪群使用抗菌药物治疗可以减少死亡率。全群预防可采用持续或“脉冲式用药”(间歇性地集中短时间大剂量用药)的方法，但随着耐药性问题越来越突出，预防和控制本病最有效的措施仍然是疫苗免疫接种。目前预防本病的商品化疫苗主要是灭活疫苗。目前国内外上市的灭活疫苗均由油佐剂制备成油包水(W/0)型疫苗，而油相为矿物油。矿物油是各种饱和烃的混合物，各种矿物油的性能各有差异。造成这种差异的原因是不同矿物油中所含的烃类各不相同，这些烃类的理化性质对佐剂的活性以及副作用有重要的影响。矿物油不能被代谢，因此会产生一系列的副作用，包括溃疡、肉芽肿、发热等，易形成残留。此外，矿物油以及其中的组分如姥鲛烷、正十六烷等会引起佐剂性关节炎等自身免疫反应。我国于1987年首次报道本病的临床病例，目前我国20多个省市都已报道有此病的发生，可见猪传染性胸膜肺炎在我国已广泛存在并流行。但在我国流行的APP血清型较多，其中以1、2、3、5和7型最多。由于本病可以经空气和接触传染，所以集约化养殖程度越高的国家和地区发病越严重。目前对于该疫病的预防和控制最有效的措施仍然是疫苗免疫接种。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗及其制备方法，以有效地预防和控制猪传染性胸膜肺炎在养殖场中发生；本发明另一目的在于还提供一种使用水性佐剂的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，最大程度地减少了应激反应，并持续地提高免疫保护作用。技术方案一种预防和治疗猪传染性胸膜肺炎的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，所述猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗包括猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株抗原。优选地，本发明所述 的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗，包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1、7型菌株抗原与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2、3、5菌株抗原的一种或任意二种，形成猪传染性胸膜肺炎三价或四价灭活疫苗。优选地，发明人通过仔细调研流行病源地的发病情况，严格筛选出了三株猪胸膜肺炎放线杆菌。即本发明的三价灭活疫苗中抗原为配合良好，免疫原性优良的灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型抗原；所述猪胸膜肺炎放线杆菌分别为猪胸膜肺炎放线杆菌血清 I 型 LC 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype I strainLC)，保藏号CCTCC M 2011458 ;猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(ActinobacillusP leuropneumoniae serotype 5 strain YC),保藏号 CCTCC M 2011459 和猪胸膜肺炎放线杆菌血清 7型 YS 株(Actinobacillus p leuropneumoniae serotype 7 strain YS),保藏号CCTCC M 2011460 ;上述三株菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期为2011年12月13日，保藏地址为中国武汉市武汉大学。优选地，本发明所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型抗原含量为灭活前大于lX109CFU/ml。优选地，本发明所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗中，灭活的方法为使用甲醛灭活；更优选地，为使用0.1% -0.3% W/V的甲醛水溶液灭活，灭活条件为37°C，48h。优选地，本发明所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗中，还包括最终浓度为
0.01%的硫柳汞溶液本发明的另一主要目的在于提供一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，含有的佐剂为水性免疫佐剂。优选地，本发明猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗中，所述水性免疫佐剂为水包油型免疫佐剂或水包油包水型免疫佐剂；更优选地，为水包油型免疫佐剂；最优选地，所述水包油型免疫佐剂中的油相为不使用矿物油。优选地，所述水包油型免疫佐剂的油相为维生素E、左旋米唑、植物油、角鲨烯和角鲨烷的一种或几种；更优选地，所述水包油型免疫佐剂为Tween80 0.25 0.5% W/V、Span85 0.25 0.5% W/V、角鲨烯 2.5 5% W/V。本发明还提供了上述猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗及猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:I)将猪胸膜肺炎放线杆菌，培养至活菌数应不低于4 X 109CFU/ml，灭活并浓缩不少于6X 109CFU/ml的浓度；2)混合灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌，并与水性佐剂混合均匀，3000-5000rpm搅拌混匀即可。优选地，本发明所述的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗制备方法中，所述步骤I)猪胸膜肺炎放线杆菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株；所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株分别为猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株(保藏号CCTCC M 2011458)、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(保藏号CCTCC M 2011459)和猪胸膜肺炎放线杆菌血清7 型 YS 株(保藏号 CCTCC M 2011460)。优选地，本发明所述的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗制备方法中，所述步骤2)还包括在终止搅拌前加入1% V/V硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01% V/V的步骤。优选地，本发明所述 的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗制备方法中，获得的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗为猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，三种抗原的含量灭活前大于lX109CFU/ml。因此，本发明提供了三株猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株；分别为猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株(保藏号CCTCC M2011458)、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(保藏号CCTCC M2011459)和猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株(保藏号CCTCCM2011460)。由三株猪胸膜肺炎放线杆菌灭活制备获得的上述猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗；和通过合适的水包油型或水包油包水型免疫佐剂获得水性猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗。以及该三价灭活疫苗在预防或治疗猪传染性胸膜肺炎方面的用途。技术效果发明人在掌握了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌病流行病学的基础上，经过血清学鉴定，严格筛选出了本发明的猪传染性胸膜灭活疫苗中使用的猪胸膜肺炎放线杆菌。即本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌是通过仔细调研流行病源地的发病情况，选择典型性的发病养殖场和病原体进行菌株的分离纯化、APP 16 sRNA基因的PCR检测及测序、生化实验、动物试验以及血清学等一系列的实验。在对已有的1、2、3、5、7型菌株进行免疫原性检测，成功筛选出免疫原性良好的优势血清型菌株3株作为疫苗候选株，分别为猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株(保藏号CCTCC M 2011458)、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(保藏号CCTCC M 2011459)和猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株(保藏号CCTCC M 2011460);经实践证明上述三株菌株相互配合良好，免疫原性优良，对国内养殖场中复杂的感染有良好的控制发病、减少感染的效果，并对同源血清型感染的猪传染性胸膜肺炎有明显的预防和治疗的效果。其次，本发明的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗是用免疫原性良好的猪传染性胸膜肺炎1、5、7型作为种子菌接种于适宜培养基培养，经甲醛溶液灭活后，与水包油佐剂乳化制成。特别是本发明的灭活疫苗使用了水性佐剂，具体地说使用了水包油佐剂，特别是不使用矿油油，从而减少了油性佐剂的应激性、白油残留等问题。但意外地，发明人发现本发明的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗还具有提供持续地发挥抗原免疫能力。即在仔猪35 40曰龄进行第I次免疫接种，首免后3周加强免疫I次；母猪在产前6周和2周各注射I次，之后每6个月免疫I次；按此免疫程序即可达到有效预防和控制猪传染性胸膜肺炎的发生。因此，本发明的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗可以持续、稳定地发挥预防和治疗猪传染性胸膜肺炎的免疫效力，有效地控制了猪传染性胸膜肺炎的发生和流行。此外，本发明疫苗的制备方法简单方便，产品效果稳定，安全性好，而且在制备过程中使用了超滤浓缩技术，制备的疫苗能有效预防猪传染性胸膜肺炎，保护率达90% 100% ;佐剂选择了水包油佐剂对猪的免疫应激小，佐剂能被降解吸收，避免了目前猪传染性胸膜肺炎油佐残留问题，特别适合在国内养殖场的大规模应用。
图1为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因610bp片段PCR检验结果图。菌种保藏本发明实施案例中所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株，分类命名及拉丁学名为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称:CCTCC，保藏编号:猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株CCTCC M 2011458 ;猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株CCTCC M2011459 ;猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株CCTCC M2011460，保藏单位地址:中国武汉市武汉大学，邮编:430072，保藏日期为2011年12月13日。
具体实施例方式本发明实施例中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为发明人通过仔细调研流行病源地的发病情况，进行菌株的分离纯化、APP 16 sRNA基因PCR检测及测序、生化实验、动物试验以及血清学等一系列的实验，严格筛选出的5株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。其中，上述猪胸膜肺炎放线杆菌株以1、7血清型为主，与2、3、5血清型之一或之二组合形成三价或四价灭活苗。本发明实施例中选择了其中配合良好、免疫效果特别好的三株猪胸膜肺炎放线杆菌(LC株、YC株和YS株)，作为猪传染性胸膜炎三价灭活疫苗的免疫抗原，而通过上述的筛选方法，使用其他组合方式获得的猪传染性胸膜炎三价或四价灭活苗也应在本发明的保护范围之内。发明人通过进一步试验发现，与上述三株菌株(LC、YC、YS)基因型相似度在70%以上的菌株(即基因序列发生30%以下的变异)，其并不会改变其免疫性能，因此，本发明的疫苗用菌株也可以使用基因型相似度在70%以上的菌株，更优选使用基因型相似度在80 %以上的菌株，更优选使用基因型相似度在90 %以上的菌株，最优选使用上述三株猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株。因此，使用上述三株菌株(LC、YC、YS)基因型相似度在70%以上的菌株(即基因序列发生30%以下的变异)及其获得的猪传染性胸膜炎三价或四价灭活苗也应在本发明的保护范围之内。本发明实施例的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗中，使用了水性免疫佐剂；其中，水性免疫佐剂是指水包油型免疫佐剂或水包油包水型免疫佐剂。其中，油相试验了维生素E、左旋米唑、植物油、角鲨烯和角鲨烷的一种或几种；更具体地，优选水包油型免疫佐剂为Tween800.25 0.5% W/V、Span85 0.25 0.5% W/V、角鲨烯 2.5 5% W/V ;即发明人通过大量实验并对佐剂进行认真地筛选后，获得了一种不使用矿物油的水性佐剂的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗，因此，可以减少应激反应，并意外地发现还具有延长疫苗保护时间的效果，可以在仔猪35 40日龄进行第I次免疫接种，首免后3周加强免疫I次；母猪在产前6周和2周各注射I次，之后每6个月免疫I次；按此免疫程序即可达到有效预防和控制猪传染性胸膜肺炎的发生。而现有技术中只有油性佐剂可以具有类似的效果。因此，本发明的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗，也可以使用油性佐剂或其他类型的水性佐剂，虽然会应激大或免疫时间短，但依然可以获得足够的免疫能力。本发明实施例中，为了适合大规模地生产三价灭活疫苗，将三株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养至活菌数不低于4X 109CFU/ml，并在灭活后，并使用超滤的方法进行了浓缩，浓缩至不少于6 X 109CFU/ml的浓度；上述方法最终目的在于使得最终疫苗成品中，三种抗原的含量为大于I X 109CFU/ml (按灭活前菌株浓度计)，从而获得免疫效果良好的三价灭活疫苗。因此，只要最后的成品疫苗抗原浓度为大于lX109CFU/ml，任何对菌株培养方法或浓缩方法的改变和替换，均可以用于制备获得本发明的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗。下面结合具体实施例来进一步描 述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1血清I型LC株、5型YC株、7型YS株的分离的鉴定I材料和方法1.1待检病料来源于河南、湖北等省市共10个猪场中采集疑似胸膜肺炎的发病猪的病料。1.2PCR引物序列PF-5，CCGACTTTTAAATCCGT3，, PR-5，GAACAGTTGTTCGCTAA3，1.3小鼠购于河南省动物实验中心提供。1.4病原菌分离纯化和液体培养无菌取濒死猪肺、咽喉扁桃体等组织，接种到TSA (含1%的NAD)琼脂培养基上，置10% C02，37°C培养24 36h后挑选典型的单个菌落进行纯化培养。挑选纯化好的单菌落接种于TSB (含I %的NAD)液体培养液中，37°C摇床(180r/min)上培养过夜。1.5病原菌形态学观察取自然发病猪和实验感染小鼠的肺和纯培养物进行革兰氏染色镜检。1.6PCR 扩增反应。用接种环挑取数个纯化后的菌落至一含40 μ L无菌三蒸水的EP管中，水煮5 lOmin，立即放入冰水混合物中，待完全冷却后，12，OOOr/min离心3min，取上清4°C保存备用。PCR 反应(25 μ L):10 倍缓冲液 2.5 μ L, 2mmol/L dNTPs 1.0 μ L，I μ mol/L 上游弓丨物 I μ L，1.5 μ mol/L 下游引物 I μ L，TaqDNA 酶(λ 2 μ L，无菌水 17.3 μ L，模板 2 μ L。94°C预变性7min后，按94°C 60s，65°C 40s, 72°C Imin 40s的循环程序进行30次循环，最后一个循环结束后再延伸7min，取PCR产物于含EB的0.8 %琼脂糖胶中电泳，紫外线灯下观察分析。预期扩增的靶基因为APP外膜脂蛋白基因610bp大小的片段。1.7动物试验将8只健康小鼠随机分为两组(每组4只)，一组腹腔注射无菌的TSB液体培养液(对照组)，另一组接种液体培养好的菌液，饲养于实验室中，观察30d。1.8生化鉴定挑取10株纯化好的菌落接种于相应培养基做尿酶、β -溶血、NAD依赖性、cAMP等特性试验。1.9血清型鉴定玻片凝集试验，将阳性血清倍比稀释，取10 μ I血清与20 μ I凝集抗原悬液在洁净的玻片上混和，以生理盐水和未免疫兔血清作空白对照，2min内观察结果，出现明显凝集现象者为阳性。2结果与分析2.1培养特性该菌在10% C02，37°C的条件下生长良好，在液体培养基上生长旺盛。在TSA培养基上，10% C02，37°C，24h后形成直径I 2mm透明，圆润的菌落。2.2病原的形态特征自然发病猪和实验感染小鼠的肺和纯培养物镜检，可见有革兰氏阴性，菌体平直，两极着色的短杆菌。2.3PCR检测结果见 附图1，其中，三株菌扩增出来的条带与预期大小相符。各泳道样品:l,Marker ;2，LC 株；3，YC 株；4，YS 株2.4生化鉴定结果见表I。表I分离菌株LC、YC、YS株细菌生化试验结果
权利要求
1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株，保藏号为CCTCC M2011458。
2.一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，保藏号为CCTCC M2011459。
3.一种猪胸膜肺炎放线杆菌7型YS株，保藏号为CCTCC M2011460。
4.一种预防和治疗猪传染性胸膜肺炎的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗包括猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株抗原。
5.一种预防和治疗猪传染性胸膜肺炎的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗包括猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株抗原，分别为灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株，保藏号为CCTCC M2011458 ;灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，保藏号为CCTCC M 2011459 ;和灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株，保藏号为CCTCC M 2011460。
6.根据权利要求5所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、7型菌株抗原含量为灭活前的菌株大于lX109CFU/ml。
7.根据权利要求5所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗还包括水性免疫佐剂。
8.根据权利要求5所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述水包油型免疫佐剂中油相不使用矿物油。
9.一种根据权利要求4-8任意一项所述猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包 括以下步骤: 1)将猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株，保藏号为CCTCCM2011458 ;猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，保藏号为CCTCCM 2011459 ;和猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株，保藏号为CCTCC M 2011460，分别培养至活菌数应不低于4X109CFU/ml，灭活后，浓缩至不少于6X109CFU/ml的浓度； 2)混合灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌，并与水性佐剂混合均匀，3000-5000rpm搅拌混匀即可获得猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗中，三种抗原的含量灭活前大于I X 109CFU/ml。
11.一种权利要求4-8任意一项所述猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗在预防或治疗猪传染性胸膜肺炎方面的用途。
全文摘要
本发明获得了三株猪胸膜肺炎放线杆菌分别为血清1型LC株，血清5型YC株，和血清7型YS株；并通过上述三株菌株灭活后抗原的合理配制，获得了一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗及其制备方法，以有效地预防和控制猪传染性胸膜肺炎在养殖场中传播和爆发；本发明还提供一种使用水性佐剂的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，最大程度地减少注射时的应激反应，并持续地提高免疫保护作用，因此，特别适合在国内养殖场的大规模应用。
文档编号A61K39/39GK103212067SQ20121001710
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司