专利名称：眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及眼镜蛇毒神经生长因子的医药新用途，尤其是眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用。
背景技术：
流行病学调查显示，在我国乙型肝炎尤其是慢性活动性肝炎中，有10% -15%可能在5-10年内发展为肝炎后肝硬化。我国慢性肝炎患者约有3千万人，这些患者均有可能或己经发展为肝纤维化。由于由肝炎病毒引起的肝脏损伤缺乏有效的根除方法，常会缓慢发展成肝纤维化，最后发生肝硬化，可见，由肝炎病毒感染导致肝纤维化严重危害性。除肝炎病毒感染外，寄生虫感染、酒精、营养不良和辐射等均可导致肝纤维化，如在我国有饮白酒的习惯，酒精性肝纤维化病例比较多见。因此，肝纤维化的群体是十分巨大的。如何控制慢性肝病的发展，防止肝纤维化以致肝硬化的发生和抗肝纤维化治疗及逆转肝纤维化的进程，日益受到国内外的高度重视。肝纤维化是慢性肝病发展成为肝硬化的主要中心环节，有效治疗肝纤维化可以防止各种慢性肝病向肝硬化、肝癌发展。为此，探索肝纤维化防治的有效方法是非常必要和迫切，具有十分重要的意义。近几十年来人们一直在寻找预防和治疗肝纤维化的药物，并已开发出了一些治疗肝纤维化的药物，如秋水仙碱、氧化苦参碱、干扰素、促肝细胞生长素等，中药制剂有丹参注射液、软肝片等。然而，由于副作用或使用效果不佳等原因，这些药物未能达到令人满意的治疗效果。因此，研究和开发新型抗肝纤维化的药物是一项尤为紧迫的任务。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种眼镜蛇毒神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用，将眼镜蛇毒神经生长因子作为药物的主要活性成分，其疗效好、起效快、安全有效、毒副作用小，是预防和治疗肝纤维化和肝硬化的理想药物。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案
眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用。
眼镜蛇毒神经生长因子具有序列表SEQ. ID. No. 2的氨基酸序列。
眼镜蛇毒神经生长因子是由具有序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列的眼镜蛇基因组DNA编码的。
眼镜蛇毒神经生长因子的分子量为22. 3KD。
上述药物可制成胶囊、软胶囊、片剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂或粉剂。
肝纤维化的形成，主要是由于肝星状细胞(h印atic stellate cells，HSCs)激活， 细胞外基质(extracellular matrix,ECM)生成过多、降解相对不足，在肝内大量沉积所致。 HSCs是肝纤维化形成过程中合成ECM的最主要细胞。HSCs的活化、增殖是肝纤维化发生的中心环节。因此，抑制HSCs增殖、诱导其凋亡是抗肝纤维化的重要策略。发明人在研究眼镜蛇毒神经生长因子(NGF)发现，其可诱导HSC-T6凋亡，在细胞水平上具有抗肝纤维化作用。动物实验证明，眼镜蛇毒神经生长因子在动物体内具有抗肝纤维化作用，能够有效抑制或减轻肝纤维化程度。因此，眼镜蛇毒神经生长因子应用在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中有重要价值，可为人们提供一种疗效优良、毒副作用很低的预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物。
图1是眼镜蛇毒NGF SDS-PAGE电泳图，图中VI峰为眼镜蛇毒NGF，Marker是蛋白分子量标准。
图2是HSC-T6生长曲线图，图中1至8分别为接种密度5X IO4U X IO5,2. 5X 104、 1. 25Χ104、6· 25Χ103、3· 12Χ103、1· 56Χ103、7· 81Χ102。
图3是眼镜蛇毒NGF作用HSC-T6生长柱形图。
图4是眼镜蛇毒NGF作用HSC-T6细胞HE染色图，图中A对照组，B NGF 2ug/ml， C NGF 5ug/ml。
图5是眼镜蛇毒NGF作用HSC-T6形态学观察图，图中A对照组，B NGF 2. 5ug/ml, C NGF 5ug/ml，D NGF 7. 5ug/ml。
图6是眼镜蛇毒NGF作用HSC-T6细胞电镜观察图，图中A NGF 2ug/ml, B NGF 5ug/mlο
图7是眼镜蛇毒NGF诱导HSC-T6细胞凋亡TUNEL检测图0OOX)，图中A对照组，B NGF 2ug/ml, C NGF 5ug/ml。
图8是眼镜蛇毒NGF作用HSC-T6细胞流式检测图，图中A HSC-T6 PI单染，B HSC-T6 FITC 单染，C HSC-T6 对照组，D 2ug/ml NGF 处理组，E 5ug/ml NGF 处理组。
图9是眼镜蛇毒NGF作用肝纤维化大鼠模型肝组织HE染色图，图中A正常组，B 模型组，C秋水仙碱组，D眼镜蛇毒NGF组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用研究
一、眼镜蛇毒神经生长因子的制备
1.眼镜蛇毒NGF分离纯化
粗蛇毒上kphadex G_75凝胶柱经1 % HAC洗脱，进行初步分离，对收集的各峰的溶液经PC-12测定NGF的活性。对活性峰再采用CM Sepharose CL-6B离子柱经lmol/1 NaCl和0. 025mol/l NaAC-HAC (pH5. 8buffer)混合液进行线性洗脱；对进一步分离的洗脱峰进行NGF活性鉴定，并对该NGF活性峰应用SDS-PAGE鉴定其纯度和相对分子质量。
2.眼镜蛇毒NGF生物活性鉴定
将生长良好的PC-12细胞以5X IO5浓度接种于M孔板。次日贴壁后换成低血清培养液胎牛血清的FlI培养液)，并加入眼镜蛇毒NGF，使其终浓度为2ug/ml，培养2-4天。普通显微镜下观察对照组细胞成圆形，无突触，聚团生长；眼镜蛇毒NGF作用组，细胞成团平铺，边缘逐渐长出突触，甚至交集成网状。
3. SDS-PAGE鉴定眼镜蛇毒NGF纯度和分子量
将分离纯化后鉴定具有PC-12细胞活性的眼镜蛇毒NGF采用5%浓缩胶浓度，稳压 100V, 12. 5%分离胶浓度，稳压120V进行SDS-PAGE电泳测定。0. 025% R-250染色!3h，HAC 脱色lh。电泳结果NGF活性峰显示一条带为电泳纯，相当分子质量以Marker作参考。
4.眼镜蛇毒NGF基因序列检测
直接从眼镜蛇毒腺组织中提取总RNA，设计引物用聚合酶链反应(PCR)方法，扩增并克隆出眼镜蛇毒NGF全长基因并进行全序列分析，其结果见序列表SEQ. ID. No. 1和SEQ. ID. No. 2的序列。
二、眼镜蛇毒神经生长因子在细胞水平抗肝纤维化作用
1. MTT法测定HSC-T6生长曲线
HSC-T6以初浓度为1 X 105/mL对倍稀释成8个系列浓度(IX 105、5 X 104、 2. 5 X104、l. 25X 104、6X103、3X103、1. 5X103、7. 5 XlO2)，接种于 96 孔板，每个浓度 3 个复孔，200ul/孔，重复接种8块板，完全培养基培养，采用酶标仪每天测定一块96孔板细胞 0D595，连续测定8天，绘制其生长曲线。
2. MTT法测定眼镜蛇毒NGF对HSC-T6的影响
将呈指数生长的HSC-T6以5 X 104/mL的密度接种于96孔板，细胞同步化后，实验组在培养基中加眼镜蛇毒NGF(终浓度为12. 5，6. 25，3. 25，1. 625,0. 8125 μ g/ml)，空白对照组加RPMI-1640培养基，200 μ L/孔，每组3复孔。作用48h，分别加5mg/ml MTT20ul，孵育4h，再加150ul DMSO,微型振荡器上振荡lOmin，孵育lOmin，酶标仪595nm处测吸光度OD值。
3. HE染色观察HSC-T6细胞形态
取对数生长HSC-T6，实验设立对照组，NGF干预组(浓度分别为2. 0ug/ml,5ug/ ml)。作用Mh，采用HE染色。普通光学显微镜下观察，胞核染成蓝色，胞浆呈紫色。
4.紫外激光显微镜观察HSC-T6细胞形态
取对数生长HSC-T6，实验设立对照组，NGF干预组(终浓度分别为2. 5ug/ml，5ug/ ml, 7. 5ug/ml)。作用Mh，采用100ug/ml吖啶橙染色，PALM MicroBeam激光下观察。
5.透射电镜观测HSC-T6细胞凋亡
取对数生长HSC-T6，实验设立对照组，NGF干预组(终浓度分别为2. Oug/ml， 5.0ug/ml)。分别把两组细胞悬浮离心5min后(lOOOr/min)去上清，沉淀细胞经戊二醛和锇酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子双重染色。透射电镜观察、摄片，凋亡细胞异染色质固缩，逐渐向胞核边集，并有凋亡小体形成，甚至出现细胞溶解现象。
6. TUNEL法测定细胞凋亡率
将呈指数生长的HSCs (5 XlOVmL)接种于M孔板，实验对照组不加药。实验组在培养细胞中加眼镜蛇毒NGF (终浓度为2Ug/ml、5Ug/ml)，总体积Iml/孔。作用相应时间后， 胰酶消化并离心收集细胞。制备细胞涂片，室温自然晾干。涂片用4%多聚甲醛固定50min， PBS洗2分钟X 2次，经3 %过氧化氢(H2O2)灭活、蛋白酶K通透、TUNEL反应混合物标记、信号转化及DAB显色后，苏木素衬染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜观察。胞核染成棕黄色为阳性细胞。随机取5个高倍视野，计数200个细胞中凋亡细胞数量，计算细胞凋亡率。
7.流式细胞术检测HSC-T6凋亡
将呈指数生长的HSC_T6(5X104/mL)接种于6孔板，实验对照组不加药。实验组在培养细胞中加入含NGF培养液2ml，使NGF终浓度分别为2. Oug/ml，5ug/ml。培养箱孵育 Mh，胰酶消化离心收集细胞。用含2% BSA的PBS悬浮细胞，置于冰上，送检测。将含细胞的PBS离心弃掉，加入流式上样缓冲液300ul，按实验要求相应加入FITC 5ul或PI 5ul，混合均勻，5-15min避光反应。半小时内上机检测。
8.结果
8. 1 NGF活性峰经SDS-PAGE分析纯度并测定分子量
所分离得到的有NGF活性的是第VI峰，在还原条件下，经过12. 5% SDS-PAGE,第VI 峰为一条带。将标准蛋白迁移率为横坐标，相应分子质量的对数值为终坐标作标准曲线，所得公式为Y=I. 7913X+2. 3365 R = O. 0306。将目的蛋白换算后测量其分子量为22. 3KD。 电泳结果见图1。
8. 2 HSC-T6细胞生长曲线
HSC-T6接种于96孔板，设置8个系列密度观察其密度与生长天数关系，结果见图 2。
由图可知HSC-T6细胞培养1-8天以第8个接种密度(5X104)为宜，最佳生长期为接种后第3天。
8. 3 MTT法检测NGF干预后HSC-T6增殖率降低
将对数生长的HSC-T6以1.25X IO4接种于96孔板，细胞处于同步化后，NGF以浓度12. 5,6. 25，3. 25，1. 625，0. 8125μ g/ml作用细胞，连续培养48h，与对照组比较，细胞增殖率降低，由结果推断NGF作用HCS-T6半数抑制率IC50约为2ug/ml (相当于对照组为 49. 66% 士6. 50%，P<0. 05)。其中以6. 25 μ g/ml作用最显著，抑制率达70% (相当于对照组为 71. 33% 士 1. 53%, *P < 0. 05)，见图 3。
8. 4 NGF作用HSC-T6HE染色观察结果
HE染色后，HSC-T6细胞胞核被染成蓝色，胞浆染成紫色，结果显示对照组细胞形态规则完整，细胞均勻分布。而NGF处理组出现部分细胞核固缩，细胞数量减少，形态散乱， 见图4。
8. 5 NGF 作用 HSC-T6 PALM MicroBeam 形态学观察
HSC-T6对照组细胞镜下形态规则完整，细胞生长均一，胞浆均勻，胞核被染成淡绿色；NGF作用低浓度做药组细胞变少，细胞形态逐渐出现不规则，胞核，被染成绿色。NGF作用高浓度作用组细胞形态不规则，胞膜不完整，胞质固缩，并伴有细胞碎片生成，细胞被染成深绿色，见图5。
8. 6透射电镜观察HSC-T6细胞凋亡
眼镜蛇毒NGF作用HSC-T6细胞，电镜下可见细胞核固缩呈块状，核染色质逐渐边集，胞浆内充满呈空泡状的内质网(Δ)，并有凋亡小体形成(▲)。NGF高浓度组作用下， 细胞周围连接消失，细胞逐渐降解，见图6。
8. 7眼镜蛇毒NGF干预后HSC-T6凋亡的TUNEL检测
TUNEL法检测显示实验组在2. 5 μ g/ml NGF干预下，孵育Mh，HSC_T6凋亡率有所增高 71% 士 1. 59% VS 15. 85% 士 1.58%，P< 0.01)，5 μ g/ml NGF作用下，孵育 24h， HSC-T6 凋亡率显著增高(34.4% 士2. 49% VS 15. 85% 士 1. 58%，P < 0. 01)。经统计学处理有显著性差异，说明NGF可诱导HSC-T6凋亡，见图7。
8.8眼镜蛇毒NGF诱导HSC-T6凋亡的流式检测
经流式检测显示，实验对照组有少数细胞凋亡，而NGF干预组作用24h检测不同浓度组存在不同程度凋亡。其中NGF 2ug/ml做药组与实验组凋亡率比较有明显差异 (16. 12% ±3. 02% VS 2. 7% ± 1. 55%, P < 0. 01), NGF 5ug/ml 与对照组凋亡率比较有显著性差异 15% 士3. 31% VS 2. 7% 士 1. 55%，P < 0. 01)，证明 NGF 可诱导 HSC-T6 凋亡，见图8。
三、眼镜蛇毒神经生长因子在动物体内抗肝纤维化作用
1.动物
采用广西医科大学实验动物中心繁殖的Wistar大鼠，雌雄各半，雌性动物无怀孕，体重120-150g。领取大鼠动物进入动物实验室后，进行适应性饲养1周。
2.大鼠肝纤维化模型建立
采用复合因素造模法，造模动物于实验第1天皮下注射含40%四氯化碳(CCl4)的液体石蜡液5ml/g，以后每周两次皮下注射上述液体3ml/kg。配以高脂低蛋白食物，即以玉米面为饲料，加0.5%胆固醇，加20%的猪油。10%的酒精为饮用水。共6周。将上述造模动物分组并给予受试药物后各组动物均给以常规饲料饲养。
3.剂量设置及分组
于造模开始第43天，分别从造模动物中随机取3只动物和正常对照中取3只。 观察血清肝功能指标和病理组织学检查，确认造模动物进入明显的肝纤维化状态。根据动物的一般状态和体重均衡的原则，随机分成正常组、模型组、秋水仙碱组、眼镜蛇毒NGF 组，每组10只动物。眼镜蛇毒NGF组设小剂量为2. 5 μ g/kg，中剂量为5 μ g/kg，大剂量为 7. 5 μ g/kgO
4.给药方法和时间
分组当天，注射给药，每只动物为0. 3ml，给药时间为30天。
5.眼镜蛇毒NGF治疗的疗效评价
于给药4周，处死各组大鼠，取肝脏组织块，固定和常规HE染色，病理学指标评价眼镜蛇毒NGF治疗的疗效。
6.结果
实验的肝组织HE染色表明眼镜蛇毒NGF干预组的大鼠肝纤维化程度较轻，肝小叶结构基本正常，与模型组大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结构结节构成的假小叶，及结节周围纤维组织沉积、增生相比，其假小叶形成和纤维不明显，实验结果表明眼镜蛇毒NGF对实验性大鼠肝纤维化具有较好的逆转作用，见图9。结果显示，蛇毒神经生长因子各剂量组对治疗肝纤维化均有抑制及减轻作用，其中中剂量和大剂量组效果明显。
结论实验结果表明眼镜蛇毒NGF对肝纤维化有抑制作用。
权利要求
1.眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述眼镜蛇毒神经生长因子具有序列表 SEQ. ID. No. 2的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述眼镜蛇毒神经生长因子是由具有序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列的眼镜蛇基因组DNA编码的。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述眼镜蛇毒神经生长因子的分子量为 22. 3KD0
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物可制成胶囊、软胶囊、片剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂或粉剂。
全文摘要
本发明公开了眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用。研究表明，眼镜蛇毒神经生长因子可诱导HSC-T6凋亡，在细胞水平上具有抗肝纤维化作用，在动物体内也具有抗肝纤维化作用，能够有效抑制或减轻肝纤维化程度。将眼镜蛇毒神经生长因子作为药物的主要活性成分，其疗效好、起效快、安全有效、毒副作用小，是预防和治疗肝纤维化和肝硬化的理想药物。
文档编号A61P1/16GK102552881SQ20121005278
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者农君, 廖共山, 廖明, 张学荣, 林兴, 班建东, 罗小玲, 胡仁统, 赖允丽, 陈缨 申请人:广西医科大学