专利名称：一种抗肿瘤生物补片的制作方法
一种抗肿瘤生物补片
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤生物补片，特别涉及一种用于肿瘤切除后对组织缺损进行修补的复合补片。
背景技术：
生物补片的定义是指取自同种、异种的组织，经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质(extracellular matrix,ECM)/脱细胞组织基质(acellulartissue matrix, ACTM)的三维框架结构并能用于修复人体软组织的材料,或人工合成生物材料及其与可降解材料的合成或复合材料制成的生物补片。其根据组织来源可分为同种异体材料如真皮脱细胞基质(acellular dermis matrix, ADM)、羊膜、硬脑膜或其他胶原基质组织，异种异体材料包括动物的小肠黏膜下层(SIS)、心包、腹膜或其他胶原基质组 织，目前已有数十种商品化的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)/脱细胞组织基质(acellular tissue matrix,ACTM)材料生物补片；人工合成生物材料包括人工合成或提取的胶原蛋白等，可降解材料包括合成可降解材料如聚乳酸、聚羟基乙酸等及天然可降解材料如壳聚糖等。生物补片的成分主要是蛋白质，包括形成ECM/ACTM三维网状支架结构的胶原纤维及糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖(透明质酸、硫酸软骨素A)等糖类和一些脂质，部分材料还含有生长因子。生物补片拥有适合于体壁修复的初始生物力学强度。植入后，随着宿主组织的长入，生物补片逐步降解，两者基本同步，最终生物补片完全被宿主组织代替。生物补片还具有一定的耐受感染能力，这得益于其能实现早期局部快速再血管化、吞噬细胞早期进入，细菌生物膜难以形成，故生物补片可用于伴有污染或潜在感染的创面。生物补片是目前临床应用的趋势和研究的热点，生物材料具有易于周围组织长入及新生血管生成，防粘连，可降解等特点，相较于其他临床常用的合成材料具备较大优势，但将其应用于肿瘤切除术后的缺损修补或重建，肿瘤细胞种植复发的可能性将会增加，理论上不具有可行性，这与目前临床上的应用趋势存在矛盾。
发明内容为了对肿瘤切除后组织缺损(包括腹壁缺损、胸壁缺损、颅部缺损、四肢缺损及内脏缺损等)或创面进行修复，本发明将抗肿瘤药物制成可吸收涂层并浸染、复合或化学交联、修饰于生物补片，制成具有抗肿瘤能力及组织缺损修复能力的生物补片。为实现上述目的，本发明提供一种用于肿瘤切除后对组织缺损或创面进行修复的补片，其特征在于所述补片浸染有纳米级缓释涂层、可缓释抗肿瘤药物。本发明的补片，其中，所述补片为生物补片，所述生物补片包括同种异体材料生物补片、异种异体材料生物补片或人工合成生物材料补片及人工合成生物材料与可降解材料的合成补片或复合材料补片。本发明的补片，其中，所述抗肿瘤药物包括钼类、干扰转录过程和阻止RNA合成的药物、抗生素、抗信号转导药、抗肿瘤辅助药、抗肿瘤抗体药、调节体内激素平衡类、拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、抑制蛋白质合成与功能药、影响核酸生物合成的药、影响血管生成药或影响微管蛋白药物各类天然或人工合成抗肿瘤药物，以及放射性元素、粒子或金属可增强局部放化疗效果及靶向性的各类药物及制剂。本发明的补片，其中，所述同种异体材料生物补片包括真皮脱细胞基质、羊膜、硬脑膜或其他胶原基质组织。本发明的补片，其中，所述异种异体材料包括动物的小肠黏膜下层、心包、腹膜或其他胶原基质组织。本发明的补片，其中，所述人工合成生物材料包括人工合成或提取的胶原蛋白。本发明的补片，其中，所述可降解材料包括聚乳酸、聚羟基乙酸的合成可降解材料及包括壳聚糖的天然可降解材料。 本发明的补片，其中，所述生物补片的厚度为0. Olmm-lOmm。本发明的补片，其中，所述生物补片的形状为圆形、椭圆形、长方或正方形、V形、孔洞形、围领、袖口或套袖形、球形或其他不规则形状。本发明的补片，其中，所述抗肿瘤药物可联合应用。本发明的补片涂布、浸染、复合或化学交联有纳米级、缓释抗肿瘤药物或其他物质(如放射性元素、重金属等)。本发明的补片中的抗肿瘤药物可联合应用，例如5-氟尿嘧啶联合雷帕霉素。制备冯芸的《5-FU载药纳米微粒的制备、表征及体外实验》和黄开红的《聚乳酸载药纳米微粒制备及其释药效能》及陈艳的《壳聚糖/5-氟尿喃唳纳米粒子制备及性能评价》中的描述，全部在本发明中引用作为参考。将抗肿瘤药物制成具有生物相容性和生物可降解性的高分子材料为载体的抗肿瘤药物，纳米载药微粒其活性成分(药物或生物活性材料等)可包裹于粒子内部或吸附于粒子表面，可增溶疏水性药物，保护药物活性，增加药物稳定性，体外释放实验表明微粒具有缓释特性。制备而成的抗肿瘤药物为纳米级、缓释药物。在某些实施方案中，可以将制备而成的抗肿瘤药物本身或组合物在载体中涂布、浸染或化学交联、修饰于生物补片上，所述生物补片可以是同种异体材料或异种异体材料或人工合成生物材料及其与可降解材料的合成或复合材料。同种异体材料包括真皮脱细胞基质(acellular dermismatrix,ADM)、羊膜、硬脑膜或其他胶原基质组织,异种异体材料包括动物的小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)、心包、腹膜或其他胶原基质组织，目前已有数十种商品化的生物补片；人工合成生物材料包括人工合成或提取的胶原蛋白等，可降解材料包括合成可降解材料如聚乳酸、聚羟基乙酸等及天然可降解材料如壳聚糖等。包括其他商品化的生物补片但不仅限于上述所述生物补片如同种异体材料生物补片和异种异体材料生物补片或人工合成生物材料及其与可降解材料的合成或复合材料。。在本发明优选实施方案中，优选将抗肿瘤药物均匀涂布、浸染或化学交联、修饰于补片上，使药剂分布均匀同时不改变补片的形状。在本发明某些优选实施方案中，制剂均匀涂布、浸染或化学交联、修饰于全部补片上，例如(a)仅涂布、浸染或化学交联、修饰于补片的一侧或两侧；(b)仅涂布、浸染或化学交联、修饰于补片的边缘；(c)仅涂布、浸染或化学交联、修饰于补片的一端；(d)涂布、浸染或化学交联、修饰于在全部补片上；(e)用一种药剂涂布、浸染或化学交联、修饰于补片一部分，补片剩余部分用另一种药剂涂布、浸染或化学交联、修饰等。可以配制本发明的抗肿瘤药物可以包含多于一种药物。本发明的有益效果(I)本发明的生物补片同时具有抗肿瘤能力；(2)可用于对肿瘤切除后的组织缺损或创面进行修补；(3)可用于临床上预防原发/继发性腹壁肿瘤切除术后的并发症，如肿瘤复发、肠粘连于缺损腹壁、腹壁的不完整造成的远期切口疝的发生等；
(4)可将其应用于原发/继发的胸壁肿瘤、颅部肿瘤、肢体肿瘤等，以及脏器(空腔或实质脏器等)肿瘤切除术后的局部化疗和组织修复，只需根据不同肿瘤改变补片中缓释化疗药物类型即可，且局部化疗副作用可显著较少，而疗效显著增加。
图I新型纳米涂层生物补片示意简图；脱细胞基质材料(ACTM)外具有含纳米微粒壳聚糖缓释涂层。图2新型纳米涂层生物补片电镜超微结构图。
具体实施方式实施例I抗肿瘤生物补片的制备A.用涂层并浸染补片的方法下面描述使用方形的8cmxl0cm合成补片的典型方法。对于更大的补片，使用更大体积的聚合物/药物溶液。简短地，将足量的聚合物直接称量到20ml玻璃闪烁管中，加入足够的DCM以便获得2%W/v溶液。然后将小瓶盖上和用手混合以便溶解聚合物。然后用连接高于通风橱平台6-12英寸的固定装置的微型钳将补片保持在垂直方向，以使能够水平喷雾。使用自动吸管，将适当体积(最少5ml)的2%聚合物溶液转移至分开的20ml玻璃闪烁管中。然后加入适当量的5-氟尿嘧啶联合雷帕霉素的纳米微粒至溶液中并通过手振荡混匀。为了准备喷雾，去除该小瓶的盖子并将TLC喷雾器的圆筒浸入聚合物溶液。注意喷雾器的储蓄器无需在本方法中使用20ml的玻璃闪烁管作为储蓄器。将氮气瓶连接到喷雾器的进气口。逐渐增加压力直至雾化和喷雾开始。记录压力并在整个方法中使用该压力。为了喷雾补片使用5秒的振动喷雾，喷雾之间15秒的干燥时间。在此喷雾后，旋转补片180°并喷雾补片的另一侧。在干燥期间，手指夹紧气管以避免喷雾损耗。持续喷雾直至适当量的聚合物沉积在补片上。该数量可以基于体内特定的修补应用。为了测定该数量，在已经完成喷雾并且补片已经干燥以后称量补片。从成品重量中减去补片的起始重量。这得到涂布在补片上的聚合物(加上5-氟尿嘧啶联合雷帕霉素的纳米微粒)的量。将涂布的补片贮藏在密封容器中。
B.用于复合补片的方法下面描述使用4cmx6cm椭圆形的合成补片的典型方法。对于更大的补片，使用更大体积的聚合物/药物溶液。将2g聚合物称入20ml玻璃闪烁管中并加入20mlDCM。盖上小瓶并放置其2小时以溶解(频繁用手振荡小瓶以帮助溶解过程)。将已知量的5-氟尿嘧啶联合雷帕霉素的纳米微粒直接称入8ml玻璃小瓶中并加入4ml聚合物溶液。使用玻璃巴斯德移液管，通过轻轻抽吸聚合物溶液混匀5-氟尿嘧啶联合雷帕霉素的纳米微粒。一旦5-氟尿嘧啶联合雷帕霉素的纳米微粒混匀，将玻璃小瓶保持在几乎垂直的位置(粘性聚合物溶液将不流出)。使用慑子，将补片插入小瓶一直到底部。通过使口的角度低于水平线和然后恢复小瓶至稍 高于水平线的角度使聚合物溶液几乎流至小瓶口。缓慢移开补片(约30秒)。将补片固定在垂直位置干燥。实施例2体外药物释放速率将小块(0. 5x0. 5cm)涂布5_氟尿喃唳联合雷帕霉素的纳米微粒的补片(n = 4)放置在14ml玻璃管中，接着加入IOml含有0. 4g/L白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH =7.4)。在8rpm轻轻旋转混合下在37°C下温育管子。在规则的时间间隔，取出IOml上清液用于5-氟尿嘧啶及雷帕霉素的分析并用新鲜PBS/白蛋白缓冲液替代。将Iml 二氯甲烷加入取出的上清液并盖上管子和用手振荡I分钟，以使所有释放的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素分配到分开的二氯甲烷相中。然后在500xg下将管子离心I分钟，取出IOml上层水相并丢弃，在氮下在50°C下蒸发二氯甲烷相20分钟。将lml60%乙腈水溶液(v/v)加入每管以溶解干燥的内含物。然后通过HPLC,使用Waters C18 Novapak柱，以由58%乙腈/5%甲醇/37%水组成的流动相以lml/min的流速在232nm下检测分析这些溶液的5-氟尿喃唳及雷帕霉素。相对于其他方法如放射性标记测定选择HPLC方法用于释放药物的定量，因为色谱方法确保仅测量完整(未降解)形式的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素药物分子。在0-50iig/ml的范围内获得溶解在60%乙腈40%水中的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素的标准曲线，并用于直接定量释放5-氟尿嘧啶及雷帕霉素的量。实施例3体内补片功效将全身麻醉引入家猪。剃刮腹部部区域并用洗涤液将皮肤消毒。在无菌条件下在腹部一侧切一垂直切口，暴露腹腔。将合成补片修补于腹壁中或替代腹膜接触腹腔脏器。将动物随机分成4组，每组5头接受合成补片的猪，所述补片涂布(I)仅载体聚合物；(2)装载I %的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素纳米微粒的载体聚合物；(3)装载5%的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素纳米微粒载体聚合物或(4)装载10%的5-氟尿喃唳及雷帕霉素纳米微粒载体聚合物。关腹。以相同方法制备对侧的腹部切口并将对照未涂布的补片用于修复腹壁或替代腹膜。让动物恢复。在术后I个月、3个月及6个月时分别杀死动物。摘除补片及周围组织，无菌生理盐水或PBS冲洗，并保持4%多聚甲醛液中30分钟。然后制备组织学标本。切割横截面并用染色H&E、Movat’ s及Massion染料染色。记录补片周围的组织的组织病理学。进行形态度量分析以测量补片的腔表面上和相邻血管中的增生，并进行生物力学测定。明确补片在体内的生物安全性及组织相容性。建立裸鼠腹壁肿瘤动物模型，切除部分肿瘤后，应用合成补片修补于腹壁中或替代腹膜接触腹腔脏器，使补片置于肿瘤细胞残留缺损或创面。将动物随机分成4组，每组5只接受合成补片的裸鼠，所述补片涂布(I)仅载体聚合物；(2)装载1%的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素纳米微粒的载体聚合物；(3)装载5%的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素纳米微粒载体聚合物或(4)装载10%的5-氟尿嘧啶及雷帕霉素纳米微粒载体聚合物。关腹。在术后I个月、3个月及6个月时进行小动物活体成像，观察补片局部肿瘤细胞增殖情况及转移情况，分别杀死动物。摘除补片及周围组织，无菌生理盐水或PBS冲洗，并保持4%多聚甲醛液中30分钟。然后制备组织学标本。切割横截面并用染色H&E、Movat’ s及Massion染料染色。记录补片周围的组织的组织病理学及肿瘤细胞种植生长情况。进行形态度量分析以测量补片的腔表面上和相邻血管中的增生。明确合成补片抗肿瘤能力。可以以多种方法用本发明的组合物涂布补片，所述方法包括例如(a)通过直接 添加制剂于补片(例如通过用聚合物/药物膜喷雾斯滕特模，或通过将斯滕特模浸溃在聚合物/药物溶液)；(b)通过用物质如水凝胶涂布补片，水凝胶再吸收组合物；(c)通过编织涂布的线(或聚合物本身形成线)成补片结构；(d)通过将补片插入由制剂组成或涂布制剂的套管或筛目，或(e)用组合物构建补片本身，或(f)用化学方法交联、修饰于生物补片。最后应当说明的是以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式
进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种用于肿瘤切除后对组织缺损或创面进行修复的补片，其特征在于所述补片浸染有纳米级缓释涂层、可缓释抗肿瘤药物。
2.如权利要求I所述补片，其特征在于所述补片为生物补片，所述生物补片包括同种异体材料生物补片、异种异体材料生物补片或人工合成生物材料补片及人工合成生物材料与可降解材料的合成补片或复合材料补片。
3.如权利要求I所述补片，其特征在于所述抗肿瘤药物包括钼类、干扰转录过程和阻止RNA合成的药物、抗生素、抗信号转导药、抗肿瘤辅助药、抗肿瘤抗体药、调节体内激素平衡类、拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、抑制蛋白质合成与功能药、影响核酸生物合成的药、影响血管生成药或影响微管蛋白药物各类天然或人工合成抗肿瘤药物，以及放射性元素、粒子或金属可增强局部放化疗效果及靶向性的各类药物及制剂。
4.如权利要求2所述补片，其特征在于所述同种异体材料生物补片包括真皮脱细胞基质、羊膜、硬脑膜或其他胶原基质组织。
5.如权利要求2所述补片，其特征在于所述异种异体材料包括动物的小肠黏膜下层、心包、腹膜或其他胶原基质组织。
6.如权利要求2所述补片，其特征在于所述人工合成生物材料包括人工合成或提取的月父原蛋白。
7.如权利要求2所述补片，其特征在于所述可降解材料包括聚乳酸、聚羟基乙酸的合成可降解材料及包括壳聚糖的天然可降解材料。
8.如权利要求2所述补片,其特征在于所述生物补片的厚度为0.Olmm-lOmm。
9.如权利要求2所述补片，其特征在于所述生物补片的形状为圆形、椭圆形、长方或正方形、V形、孔洞形、围领、袖口或套袖形、球形或其他不规则形状。
10.如权利要求3所述补片，其特征在于所述抗肿瘤药物可联合应用。
全文摘要
本发明提供一种用于对肿瘤切除后组织缺损或创面进行修复的补片，其特征在于所述补片为生物补片，其特征在于将纳米级、抗肿瘤药物涂布或浸染所述生物补片制成可缓释化疗药物的可吸收涂层，进而制成具有抗肿瘤能力及组织缺损修复能力的补片。
文档编号A61L27/24GK102698319SQ20121005276
公开日2012年10月3日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者田茂霖, 申英末, 陈杰 申请人:首都医科大学附属北京朝阳医院