专利名称：抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉一种抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法。
背景技术：
流行性感冒(Influenza)是由流行性感冒病毒(简称流感病毒，Influenza Virus, IV)引起的至今尚未得到有效控制的呼吸道急性传染病。甲型流感病毒曾引起了全世界数次大范围的流行，每次大流行不仅造成了巨大的人力资源和物力资源的损失，还严重危害人类和畜禽健康。禽流感(Avain Influenza Al)和猪流感(Swine Influenza SI)分别是由甲型流感病毒引起的禽类传染病和畜类传染病。Smith等人于1933年首次将从人体中所分离到的流感病毒称之为A型流感病毒。20世纪人类流感曾发生过3次瘟疫性的全球大流行，死亡人数达2000多万。禽流感病毒自意大利首次发现至今，由于候鸟的迁徙和国际间禽类贸易的日益频繁，使得该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。猪在流感病毒的种间传播方面占有很特别的地位，被认为是人、禽和/或猪流感病毒通过基因重排产生新的亚型流感病毒的“混合器”。近年来，人畜共患病毒性疾病频繁发生，不仅出现了 SARS等一些新型病毒，而且一些传统型的人畜共患病毒性疾病呈现流行趋势，并且随着病毒的不断进化， 出现了一些新的烈性重组病毒。2009年在全球肆虐的甲型HlNl流感，再次敲响了人畜共患危害人类健康的警钟。目前，我国流感病毒流行广泛并且不断出现变异，毒株间重组的几率非常高。然而并无效果良好的疫苗，且现有疫苗中，不论是灭活苗、弱毒苗，还是亚单位疫苗，都需要培养大量的致病毒株。不仅给疫苗研制带来不便，同时还存在安全性、免疫原性、 产量及保存等诸多方面存在不足，因此迫切需要研制新型的、高效的抗流感疫苗，应用新型疫苗来预防流感的爆发。多表位疫苗(Multi-epitope Vaccine)也称鸡尾酒式疫苗,是同时携带多个与目标抗原相关的及辅助性表位的疫苗。抗原表位预测大多为计算机软件分析法，即根据已有的表位数据资料，通过计算机软件对氨基酸(或碱基)序列进行分析，迅速地预测出候选抗原表位。流感病毒的主要抗原相关蛋白有HA和NA、NP、基质蛋白M1/M2，其中HA、NA和M2 是猪流感病毒的三种表面抗原分子，针对三种抗原的抗体都有抑制病毒感染的作用，但由于HA和NA抗原变异性很高，不同变异株间不交叉保护，研制此类抗原疫苗的速度往往跟不上病毒变异。Ml和M2是病毒的两个基质蛋白，Ml蛋白是病毒的主要结构蛋白，占流感蛋白总量的30% 40%，特异性强，是流感病毒分型的主要依据之一，IEDB的分析结构显示Ml 蛋白中存在至少三个极为保守的抗原决定簇。M2蛋白的氨基酸序列也高度保守，该蛋白在机体内能刺激产生抵抗不同性别流感抗原，但由于M2分子量很小，免疫原性较差，难以诱导高水平的免疫反应。NP蛋白是构成猪流感病毒的主要核蛋白，各亚型毒株之间氨基酸序列保守，是细胞毒性淋巴细胞识别的内部主要抗原。NP和Ml在序列和抗原性上保持相对稳定，二者位于病毒内部，因此不是诱导中和抗体有效的靶目标。然而一旦病毒感染宿主细胞，这些蛋白可能是激活CTL并克服感染的靶目标。2006年Kaiser等提出了通用流感疫苗的设想，主要基于流感保守的NP和M蛋白。在DNA疫苗及活载体重组疫苗上，大量研究已证实通过添加NP或M组分,有助于对其他亚型的流感产生交叉免疫保护。Ernst等、De Filette分别构建了 A型流感病毒M蛋白M2e表位，免疫组小鼠能抵抗HI、H3、H6、H9亚型流感病毒的感染。Kodihal Ii等用火鸡H5N2病毒的HA和NP蛋白制备的亚单位复合疫苗免疫火鸡。在免疫后21d，火鸡产生高的Hl抗体滴度，并对同源或异源(H6N1)AIV的攻击产生抵抗力。Jeon等串联表达了 HA、NP蛋白B细胞的表位、辅助性T细胞的表位和细胞毒性 T细胞表位，将此翻译肽段免疫小鼠后产生了体液免疫和辅助性T细胞反应，小鼠可抵抗致死性病毒的攻击，并迅速得以康复。
发明内容
本发明的流感多表位疫苗，其中所描述CTL表位的选择采用SYFPEITHI、CTLpred、 Multipre对参考毒株序列进行分析，对其HLA*0201及HLA*1101的CTL表位进行预测，筛选得分较高，排名靠前的CTL表位，综合评价各软件预测结果分析得到所需表位。B表位预测使用网络服务器BepiPred I. Osever> Bcepred对线性B细胞表位进行预测。筛选时依据亲水性好(hydrophilicity),可及性高(accessibility),可塑性好 (flexibility)，抗原性强(antigenicity)，分子极性强(polarity)，表面暴露(exposed surface)和转角可能性大(Turns)的为候选B细胞表位。所有预测表位筛选于HA主要抗原区和NP、Ml的保守区域。汇总各项表位预测结果，以CTL表位预测为基础，使预测表位尽量覆盖B细胞表位预测区，以获得兼有CTL与B细胞表位功能的预测表位。应用SWISS MODEL SIB Service 和 3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server 进行分子建模，分析候选表位构象，最终确定细胞表位。根据设计的表位，复原其核酸序列，按照原核优势密码子规则进行了优化，随后进行人工合成。抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制备方法，采用生物信息学方法，结合网络服务器和相关软件对流感保护抗原相关的NP、Ml和HA功能表位进行了预测，获得来自 H1N1、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亚型CTL表位和B细胞表位共8条表位，在每两个表位之间加入柔性片段GPGPG连接，命名为HMN ;将表位多肽相应的核苷酸序列连到质粒载体上，原核系统表达，纯化的表达蛋白配以佐剂制成疫苗，免疫小鼠，所述8条表位分别为SEQ ID No: I至SEQ ID No 8 ；HMN的编码核苷酸序列为SEQ ID No :9。该多肽通过western blot试验,证明目的基因有效表达且具有抗原性；通过小鼠免疫试验，试验组T淋巴细胞亚群指数高于对照组，表明该疫苗可诱导BALC/c小鼠产生针对所选表位的特殊性体液免疫和细胞免疫反应，证明其具有免疫原性。
图I :重组表达质粒pET28a-HMN PCR鉴定；M1 DNA分子质量标准；1、2 :重组质粒 pET28a-HMN PCR 产物；图2 :重组表达质粒pET28a-HMN酶切鉴定；M1、M2 DNA分子质量标准；1 :空质粒 pET28a 的 BamH Ι+HindIII 双酶切产物；2 :重组质粒 pET28a_HMN 的 BamH Ι+HindIII 双酶切产物；图3 :重组蛋白原核表达，M :蛋白质分子量标准(低)；1 BL21经IPTG诱导后的细菌裂解产物；2 pET28a-BL21经IPTG诱导后的细菌裂解产物；3_6 :pET28a_HMN在28°C 分别由 O. Immol/L、0. 2mmol/L、0. 3mmol/L、0. 4mmol/L IPTG 诱导后的细菌裂解产物；7_10 pET28a-HMN 在 37°C分别由 O. Immol/L、0. 2mmol/L、0. 3mmol/L、0. 4mmol/LIPTG 诱导后的细菌裂解产物；图4 :免疫小鼠T淋巴细胞亚类检测。A:PBS组；B:市售疫苗组；C:25yg组；D: 50 μ g 组。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I流感病毒表位筛选搜集已发表的流感表位，从NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上分别下载 HI、H3、H5、H9亚型流感HA基因、NP基因和Ml基因的氨基酸和核苷酸序列。生物信息学MHC类分子预测采用网络服务器SYFPEITHI (http: //www. syfpeithi. de/home, htm )、CTLpred(http://www. imtech. res. in/raghava/ctlpred/ index, html )、Multipre (http://www. i2r. a-star. Edu. Sg);生物信息学 B 细胞表位预测米用网络服务器 BepiPred I. O sever (http://www.cbs.dtu.dk/services/ BepiPred/)、Bcepred (http://www. imtech.res. in/raghava/bcepred/bcepred_ submission, html)> SWISS MODEL SIB Service (http://swissmodel. expasy. org/)和 3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server(http://bmm. cancerresearchuk. org/ 3djigsaw/)。应用生物信息学的方法，对多种亚型(H1、H3、H5、H9)流感HA、NP和Ml相关的CTL 和B细胞表位进行了预测分析，综合各项表位筛选获得CTL/B相关表位共8条，将表位片段 (请参阅表ISEQ ID No :1至SEQ ID No 8所示)拼接起来(由于多表位基因片段独立且较小，在每两个氨基酸序列之间添加柔性片段GPGPG，以促进表达蛋白进行正确折叠，减少由于空间构象相互影响而可能产生的对抗原性的影响)，命名为HMN。表I
权利要求
1.一种抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制备方法，其特征在于，采用生物信息学方法，结合网络服务器和相关软件对流感保护抗原相关的NP、Ml和HA功能表位进行了预测，获得来自HlNl、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亚型CTL表位和B细胞表位共8条表位，在每两个表位之间加入柔性片段GPGPG连接，命名为HMN ;将表位多肽相应的核苷酸序列连到质粒载体上，原核系统表达，纯化的表达蛋白配以佐剂制成疫苗，8条表位分别为SEQ ID No 1 至SEQ ID No 8 ；HMN的编码核苷酸序列为SEQ ID No :9。
2.根据权利要求I所述的制备方法制备的新型流感病毒多表位串联多肽序列。
全文摘要
本发明公开了一种抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制备方法，采用生物信息学方法，结合网络服务器和相关软件对流感保护抗原相关的NP、M1和HA功能表位进行了预测，获得来自H1N1、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亚型CTL表位和B细胞表位共8条表位，在每两个表位之间加入柔性片段GPGPG连接，命名为HMN；将表位多肽相应的核苷酸序列连到质粒载体上，原核系统表达，纯化的表达蛋白配以佐剂制成疫苗，免疫小鼠。该重组多肽，通过western blot试验，证明目的基因有效表达且具有抗原性；通过小鼠免疫试验，试验组T淋巴细胞亚群指数高于对照组，表明该多肽可诱导BALC/c小鼠产生针对所选表位的特殊性体液免疫和细胞免疫反应，证明其具有较强免疫原性。
文档编号A61P31/16GK102600466SQ20121007870
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者张玉娟, 许君, 郑文明, 马倩, 高振兴 申请人:河南农业大学