专利名称：喹硫平在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及一种物质的制药用途。
背景技术：
自身免疫性疾病是一类以免疫机能紊乱为特征的疾病。由于机体免疫功能紊乱，T细胞对自身抗原产生免疫应答，产生自身抗原特异性T细胞，这些特异性T细胞靶向机体细胞产生损伤作用，而且这些特异性T细胞处于持续的激活和增殖过程。因此，T细胞的异常增殖和侵润是自身免疫性疾病的重要特征。目前，药物治疗对该类疾病的效果有限，而且有较多的副作用。喹硫平(Quetiapine, Que)是一种非典型性抗精神病药,对精神分裂症、情感障碍、脑器质性疾病伴发的精神障碍等疾病均有较好的治疗效果，且副反应较少。迄今为止，国内外尚未见喹硫平用于预防和治疗自身免疫性疾病方面的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于考察喹硫平是否具有免疫调节作用，是否能够用于制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物，从而为自身免疫性疾病的预防和治疗提供新的解决办法。为达到上述目的，本发明通过体外和体内实验，对喹硫平的免疫调节作用以及其对自身免疫性疾病的预防和治疗效果进行了考察。结果发现，喹硫平具有免疫调节功能，能够抑制效应性T细胞的增殖，减轻局部病灶T细胞的侵润；在自身免疫性疾病模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，给予喹硫平能够预防疾病模型动物的发病，并能够减轻症状，缩短病程，起到良好的治疗效果。因此，喹硫平可以用于制备预防和治疗自身免疫性疾病(例如自身免疫性脑脊髓炎等)的药物，也可以用于制备预防和治疗其它以T细胞增殖和侵润为特点的免疫功能紊乱相关疾病的药物。本发明的有益效果在于本发明公开了喹硫平在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，不仅拓宽了喹硫平的应用范围，提升了其市场价值，而且为自身免疫性疾病的预防和治疗提供了一种新的解决办法。
图I显示了喹硫平能够抑制抗CD3抗体诱导的离体T细胞增殖。图2显示了喹硫平能够减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的临床评分。图3显示了喹硫平能够减少实验性自身免疫性脑脊髓炎模型脊髓CD4+和CD8+T细胞的侵润。图4显示了喹硫平能够减少实验性自身免疫性脑脊髓炎模型脾脏和淋巴结内⑶4+和⑶8+T细胞的比例。图5显示了喹硫平能够抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎模型M0G35_55多肽诱导的T细胞增殖。
图6显示了喹硫平预处理能够减缓EAE的发病和临床评分。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明进行详细的描述。实施例中使用的主要动物、试剂和仪器如下体重18 20克的健康成年雌性C57BL/C小鼠(中国人民解放军第三军医大学实验动物中心)；喹硫平(阿斯利康公司)，免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司)，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)、大鼠抗CD4抗体、大鼠抗⑶8抗体、大鼠抗0)3抗体(eBioscience公司),完全弗氏佐剂、多聚甲醒(Simga公司)，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(M0G)35-55多肽(Invitrogen公司)、Alex568标记的抗大鼠第二抗体(Invitrogen公司);FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)，90i荧光显微镜(Nikon公司)。(一)喹硫平抑制抗⑶3抗体诱导的离体T细胞增殖
分离正常C57BL/C小鼠的脾脏淋巴细胞，免疫磁珠分选⑶4+和⑶8+T细胞，用CFSE标记细胞，培养72小时，调节细胞密度至IX 106/ml，用终浓度为I μ g/ml的抗⑶3抗体刺激T细胞增殖，同时给予或不给予浓度为I μ M的喹硫平处理，流式细胞仪检测CFSE强度改变。结果见图1，喹硫平能够显著抑制抗⑶3抗体诱导的⑶4+/⑶8+Τ细胞增殖。(二)喹硫平对实验性自身免疫性脑脊髓炎的预防和治疗效果
实验性自身免疫性脑脊髓炎模型是一种自身免疫性疾病的常用模型，通过给小鼠免疫mog35_55多肽，能够产生mog35_55多肽特异性T细胞，这些T细胞侵润到中枢神经系统，可以造成脊髓白质脱髓鞘，从而引发自身免疫性脑脊髓炎。本发明以实验性自身免疫性脑脊髓炎模型为代表来说明喹硫平对自身免疫性疾病的预防和治疗效果。一、喹硫平对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗效果
I、实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立
取体重18 20克的健康成年雌性C57BL/C小鼠100只，皮下免疫经完全弗氏佐剂乳化的200 μ g M0G35_55多肽，免疫首日(PO)和第7天(P7)分别给予IOOng白喉毒素腹腔注射，建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型。2、喹硫平治疗减轻了实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的临床评分
将模型小鼠随机分为喹硫平治疗组和模型对照组，每组40只；另取10只正常C57BL/C小鼠作为未免疫组对照。从免疫首日开始，每日称量两组小鼠体重，观察小鼠摄食情况，并进行临床评分，评分标准如下0分，无临床症状；0. 5分，尾部无力；I分，尾部瘫痪；2分，协调性运动消失；2. 5分，单侧后肢瘫痪；3分，双侧后肢瘫痪；3. 5分，双侧后肢瘫痪伴前肢无力；4分；前肢瘫痪；5分，濒死或者死亡。免疫小鼠于免疫14-16天左右开始出现临床症状，当临床评分达到O. 5分时(免疫后第16天)，喹硫平治疗组小鼠开始给予喹硫平治疗，按照10mg/kg/天的剂量将喹硫平溶解于双蒸水中作为饮用水给予小鼠，治疗过程持续40天；模型对照组小鼠在此期间每日给予等量双蒸水。结果见图2，模型对照组小鼠疾病持续恶化，临床评分最高上升到3左右，而喹硫平治疗组小鼠的临床评分在治疗期间维持在I左右。3、喹硫平治疗减少了实验性自身免疫性脑脊髓炎模型脊髓CD4+和CD8+T细胞的侵润将未免疫组、模型对照组和喹硫平治疗组小鼠分别用质量百分浓度为1%的戊巴比妥钠溶液麻醉，用浓度为O. OlM的PBS进行心脏灌注，再用质量百分浓度为4%的多聚甲醛固定，取脊髓，用质量百分浓度为30%的蔗糖与质量百分浓度为4%的多聚甲醛的混合液脱水24小时，冰冻切片(厚20 μ m)。所得切片用质量百分浓度为10%的牛血清白蛋白溶液封闭，用大鼠抗⑶4或⑶8抗体孵育过夜，再用Alex568标记的抗大鼠第二抗体室温避光孵育I小时，置荧光显微镜下观察并拍照，用图像分析软件Image-Pro Plus5. O计数⑶4+和⑶8+T细胞。结果见图3，未免疫组小鼠脊髓未见CD4+和CD8+T细胞侵润，模型对照组小鼠脊髓有大量⑶4+和⑶8+T细胞侵润，而喹硫平治疗组小鼠脊髓可见侵润⑶4+和⑶8+T细胞明显减少。 4、喹硫平治疗减少了实验性自身免疫性脑脊髓炎模型脾脏和淋巴结内CD4+和⑶8+T细胞的比例
分离模型对照组和喹硫平治疗组小鼠的脾脏和淋巴结，分离淋巴细胞，调节细胞密度至O. 5X 106/ml，用大鼠抗⑶4或⑶8抗体于4°C孵育30分钟，检测FoxP3，细胞固定并通透，用抗Foxp3抗体染色，细胞用⑶4+和⑶4+FoxP3+划门并计算，染色细胞用流式细胞仪分析。结果见图4，与模型对照组比较，喹硫平治疗组小鼠脾脏和淋巴结内⑶4+和⑶8+T细胞的比例明显下降。5、喹硫平治疗抑制了实验性自身免疫性脑脊髓炎模型M0G35_55多肽诱导的T细胞增殖
免疫后14天，分离模型对照组和喹硫平治疗组小鼠的脾脏，获得淋巴细胞单细胞悬液，用免疫磁珠分选⑶4+⑶25-T细胞，用CFSE标记细胞后，分别用I μ g/mlUO μ g/ml和100 μ g/ml M0G35_55多肽诱导T细胞增殖，流式细胞仪检测CFSE强度改变。结果见图5，与模型对照组比较，喹硫平治疗组小鼠脾脏CD4+T细胞的增殖明显受到抑制。二、喹硫平对实验性自身免疫性脑脊髓炎的预防效果
取体重18 20克的健康成年雌性C57BL/c小鼠50只，随机分为喹硫平预防组和对照组，喹硫平预防组小鼠于免疫前7天开始喹硫平预防，按照10mg/kg/天的剂量将喹硫平溶解于双蒸水中作为饮用水给予小鼠，预防过程持续7天，对照组小鼠在此期间每日给予等量双蒸水，之后两组小鼠皮下免疫经完全弗氏佐剂乳化的200μ g M0G35_55多肽，免疫首日和第7天分别给予IOOng白喉毒素腹腔注射。从免疫首日开始，每日称量两组小鼠体重，观察小鼠摄食情况，并进行临床评分，评分标准如下0分，无临床症状；0. 5分，尾部无力；1分，尾部瘫痪；2分，协调性运动消失；2. 5分，单侧后肢瘫痪；3分，双侧后肢瘫痪；3. 5分，双侧后肢瘫痪伴前肢无力；4分；前肢瘫痪；5分，濒死或者死亡。结果见图6，对照组小鼠于免疫第16天开始出现临床症状，与对照组小鼠比较，喹硫平预防组小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病时间延迟，同时临床症状减轻。以上体外和体内研究结果表明，喹硫平具有免疫调节功能，能够抑制效应性T细胞的增殖，减轻局部病灶T细胞的侵润；在自身免疫性疾病模型一实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，给予喹硫平能够预防疾病模型动物的发病，并能够减轻症状，缩短病程，起到良好的治疗效果。因此，喹硫平可以用于制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物，也可以用于制备预防和治疗其它以T细胞增殖和侵润为特点的免疫功能紊乱相关疾病的药物。以喹硫平为有效成分的药物用于预防和治疗自身免疫性疾病时，其使用方法可以如下前4天的日总剂量依次为50mg (第I天)，IOOmg (第2天)，200mg (第3天)和300mg(第4天)，从第5天开始将剂量逐渐增加至40(T600mg/天，也可根据患者的临床反应和耐受性将剂量在15(T750mg/天之间进行调整，服药期间应密切注意患者血压、精神状态和肝肾功能改变，出现异常时停药。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.喹硫平在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为自身免疫性脑脊髓炎。
全文摘要
本发明公开了喹硫平在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，研究结果表明，喹硫平具有免疫调节功能，能够抑制效应性T细胞的增殖，减轻局部病灶T细胞的侵润，在自身免疫性疾病模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，给予喹硫平能够预防疾病模型动物的发病，并能够减轻症状，缩短病程，起到良好的治疗效果，本发明不仅拓宽了喹硫平的应用范围，提升了其市场价值，而且为自身免疫性疾病的预防和治疗提供了一种新的解决办法。
文档编号A61P25/28GK102716133SQ20121009819
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者梅峰, 肖岚, 郭晟 申请人:中国人民解放军第三军医大学