专利名称：自发荧光微胶囊及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种自发荧光微胶囊及其制备方法与应用。
背景技术：
发展刺激响应性的药物载体以实现细胞内的药物释放并且实现理想化治疗效果近几年引发了人们广泛的兴趣。到目前为止，很多依靠外界的刺激，比如超声、磁场、光以及病灶区的局部微环境的改变，例如pH值、温度和还原势差别的药物载体被成功构建并且各自实现了理想的药物包埋，运输，释放目的。然而，到目前为止仍然面临的巨大挑战是 如何设计并构建简单的药物载体来实现生理条件下的微环境的刺激响应性的示踪和药物释放的目的。层层组装法制备纳米或微米尺度的胶囊来实现多样化刺激响应性的药物载体有其独到的优势。用该方法组装微胶囊，其壁材可以有多种选择性，如各种功能化的聚电解质、蛋白质、DNA、脂质体等。组装胶囊的驱动力也从传统的静电作用扩展到氢键作用、疏水作用、范德华力、共价交联等多种作用力。微胶囊可以包载一种或多种药物，并且可以实现靶向或可控给药来增加治疗的协同性等。如，基于静电作用力和氢键作用力，新颖的pH值响应的微胶囊得以构建。而且，由于希弗碱键具有动态组装和自发荧光的特性，pH值响应的具有自发荧光的微胶囊引发了人们广泛的研究兴趣。同时，基于二硫键或二硒键交联的结构单元可以被细胞内的谷胱甘肽还原生成巯醇或者硒醇结构，利用这种化学键的氧化状态向还原状态的转变的特性，人们广泛发展了一种还原响应性的药物载体用以实现细胞内的可控释放。由于在生命有机体中存在着很多种PH值的差异和还原势差，利用这些差别构建PH值与还原双响应微胶囊可能在生物材料领域拥有一定的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种自发荧光微胶囊的制备方法及其应用。本发明提供的一种自发荧光微胶囊，由胱胺二盐酸盐交联部分氧化的聚多糖而得。所述部分氧化的聚多糖选自部分氧化的海藻酸钠、部分氧化的葡聚糖、部分氧化的肝素和部分氧化的淀粉中的至少一种；所述部分氧化的海藻酸钠为氧化度为60-70%的海藻酸钠；所述部分氧化的葡聚糖为氧化度为60-70%的葡聚糖；所述部分氧化的肝素为氧化度为60-70%的肝素；所述部分氧化的淀粉为氧化度为60-70%的淀粉所述胱胺二盐酸盐交联部分氧化的聚多糖的质量比为5-10 :1_5，优选5 :2。本发明提供的制备所述自发荧光微胶囊的方法，包括如下步骤I)制备模板粒子；2)将所述步骤I)所得模板粒子置于聚阳离子电解质的NaCl的水溶液中进行吸附，吸附结束后得到表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子；3)将所得表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子置于部分氧化的聚多糖的NaCl的水溶液中进行吸附，得到表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子；4)将所得表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子置于交联剂的水溶液中进行吸附，得到表面吸附胱胺二盐酸盐的模板粒子；5 )重复所述步骤3 )和4 )至在所述步骤I)所得模板粒子表面得到目标层数后，溶解所述步骤I)所得的模板粒子，得到所述自发荧光微胶囊。上述方法的所述步骤I)中，构成所述模板粒子的化合物为碳酸锰或碳酸钙；构成所述模板粒子的化合物为碳酸锰时，所述模板粒子的结构为表面光滑的实心粒子，直径为1-10 μ Μ，优选2 μ M ;
构成所述模板粒子的化合物为碳酸钙时，所述模板粒子的结构为中空多孔结构，其表面由直径为20-50nm的碳酸钙纳米粒子组成，所述模板粒子的直径为1_5 μ Μ，优选3μΜ ；上述模板粒子可按照各种常规方法制备而得。所述步骤2)中，所述阳离子聚电解质选自聚乙烯亚胺、聚烯丙基氯化铵和壳聚糖中的至少一种；所述NaCl的水溶液的浓度为O. 5Μ-1. 0Μ，优选O. 5Μ ;所述阳离子聚电解质的NaCl的水溶液中，阳离子聚电解质的浓度为l_5mg/mL，具体为lmg/mL ；所述步骤3)中，所述部分氧化的聚多糖选自部分氧化的海藻酸钠(ADA)、部分氧化的葡聚糖、部分氧化的肝素和部分氧化的淀粉中的至少一种，优选部分氧化的海藻酸钠；所述NaCl的水溶液的浓度为O. 5M-1. 0M，优选O. 5M ;所述部分氧化的聚多糖的NaCl的水溶液的浓度为l-5mg/mL,具体为2mg/mL ；所述部分氧化的海藻酸钠为氧化度为60-70%的海藻酸钠；所述部分氧化的葡聚糖为氧化度为60-70%的葡聚糖；所述部分氧化的肝素为氧化度为60-70%的肝素；所述部分氧化的淀粉为氧化度为60-70%的淀粉。所述步骤4)中，所述交联剂为胱胺二盐酸盐；所述交联剂的水溶液的浓度为5-10mg/mL,具体为 5mg/mL ；所述步骤2) -4)吸附步骤中，时间均为60-120分钟，优选120分钟。上述本发明提供的自发荧光微胶囊作为疏水性抗肿瘤药物载体的应用及其在制备疏水性抗肿瘤药物中的应用，也属于本发明的保护范围。本发明提供的上述自发荧光微胶囊同时具有pH与还原双重响应性，可以作为药物载体，不仅可以负载亲水或疏水性的小分子药物，还可以负载治疗性的生物大分子，比如多肽，核酸类药物。故本发明还提供了一种疏水性抗肿瘤药物微胶囊，由载体和负载在所述载体上的抗肿瘤药物组成；其中，所述载体即为前述本发明提供的自发荧光微胶囊。该抗肿瘤药物微胶囊中，所述抗肿瘤药物为多烯紫杉醇。本发明提供的制备所述疏水性抗肿瘤药物微胶囊的方法，包括下述步骤I)制备模板粒子；2)将所述步骤I)所得模板粒子分散在抗肿瘤药物的氯仿溶液中，吸附后得到负载有疏水性抗肿瘤药物的模板粒子并除去溶剂；3)将所述步骤2)所得模板粒子置于聚阳离子电解质的NaCl的水溶液中中进行吸附，吸附结束后得到表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子；4)将所得表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子置于部分氧化的聚多糖的NaCl的水溶液中进行吸附，得到表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子；5)将所得表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子置于交联剂的水溶液中进行吸附，得到表面吸附胱胺二盐酸盐的模板粒子；6)重复所述步骤4)和5)至在所述步骤I)所得模板粒子表面得到目标层数后，溶解所述步骤I)所得的模板粒子，得到所述疏水性抗肿瘤药物微胶囊。 上述方法的所述步骤I)中，构成所述模板粒子的化合物为碳酸钙或二氧化硅；构成所述模板粒子的化合物为碳酸钙时，所述模板粒子的结构为中空多孔结构，其表面由直径为20-50nm的碳酸钙纳米粒子组成，所述模板粒子的直径为1_5 μ Μ，优选3μΜ ；构成所述模板粒子的化合物为二氧化硅时，所述模板粒子的结构为长径比为1-3的短棒状粒子，且粒子内部具有平行中空孔道，长径为100-500nm，优选100_200nm ;上述模板粒子可按照各种常规方法制备而得。所述步骤2)吸附步骤中，时间为6-12小时，优选12小时；所述抗肿瘤药物为多烯紫杉醇；所述步骤3)中，所述阳离子聚电解质的NaCl的水溶液中，所述阳离子聚电解质选自聚乙烯亚胺、聚烯丙基氯化铵和壳聚糖中的至少一种；所述NaCl的水溶液的浓度为
O.5-1. 0M,优选O. 5M ;所述阳离子聚电解质的浓度为l-5mg/mL,具体为lmg/mL ；所述步骤4)中，所述部分氧化的聚多糖选自部分氧化的海藻酸钠(ADA)、部分氧化的葡聚糖、部分氧化的肝素和部分氧化的淀粉中的至少一种，优选部分氧化的海藻酸钠；所述NaCl的水溶液的浓度为O. 5-1. 0M，优选O. 5M ;所述部分氧化的聚多糖的水溶液浓度为l-5mg/mL,具体为 2mg/mL ； 所述步骤)中，所述交联剂为胱胺二盐酸盐；所述交联剂的水溶液的浓度为5-10mg/mL,具体为 5mg/mL ；所述步骤3) -5)吸附步骤中，时间均为60-120分钟，优选120分钟。本发明使用传统的层层组装方法，巧妙的使微胶囊的囊壁同时具有pH与还原双响应，以成为满足细胞低PH，高还原态的微环境敏感的基于聚多糖的自发荧光微胶囊。而且借助于CaCO3模板粒子的表面多孔、内部疏松的结构，可以富集疏水性的抗肿瘤药物并在除核后将药物晶体负载在胶囊的囊壁上，并且实现胶囊的刺激响应性的释放药物而起到抗肿瘤的目的。
图I是层层组装制备载药微胶囊药物载体的方法示意图。图2是层层组装制备的微胶囊的自发荧光图。图3是层层组装制备的微胶囊的pH与还原双响应的图。图4是负载尼罗红的层层组装聚多糖的碳酸钙模板粒子在除核前后的共聚焦图。
图5是载抗肿瘤药物微胶囊对人骨肉瘤细胞的细胞毒性柱状分析图；其中，蓝色的柱状图代表了载药微胶囊的细胞毒性，(I)代表无任何外加物质，(2)代表加入实施例I制备的无药物微胶囊，(3) - (6)代表了加入梯度浓度的抗肿瘤药物微胶囊；红色的柱状图代表相同浓度的溶解在DMSO中的自由的抗肿瘤药物的细胞毒性实验。
具体实施例方式下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 囊壁材料的选用本发明采用的作胶囊的囊壁材料为部分氧化的海藻酸钠(ADA)和胱胺二盐酸盐，其中ADA氧化度为60-70%。ADA是用高碘酸钠氧化海藻酸钠制备得到的，制备方法简述如下lg海藻酸钠溶于40mL去离子水中，加入I. OSg高碘酸钠，室温下避光搅拌24h后，加入2mL乙二醇，避光反应15min以终止反应，产物于4°C下透析至完全除去过量的高碘酸钠和乙二醇，冻干并真空保存，得到氧化度为70%的ADA。氧化后的海藻酸钠生成了活性醛基，具有二醛结构。pH与还原双响应的自发荧光微胶囊的制备方法，具体可为首先将碳酸锰模板置于聚乙烯亚胺的NaCl溶液中，吸附一定时间后，离心分离，清洗、去除未吸附的聚电解质溶液；然后将上述粒子浸没于部分氧化海藻酸钠(ADA)溶液中，吸附一定时间后，离心分离，清洗；再将上述粒子加入到胱胺二盐酸盐的溶液中，吸附一定时间后，离心分离，清洗。重复上述过程，依次交替吸附ADA和胱胺二盐酸盐至所需层数，除核后即可得到自发荧光双响应性的胶囊载体。药物模型本发明采用了一种荧光染料尼罗红，可用于脂类及蛋白质等的染色用以观察疏水性药物的负载情况。本发明采用一种抗肿瘤药物多烯紫杉醇是通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用的。它可与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制其解聚，导致丧失了正常功能的微管束的产生和微管的固定，从而抑制细胞的有丝分裂，抗瘤谱较广，并在微摩尔浓度范围内即有细胞毒性。制备负载有疏水性药物的微胶囊的方法，具体可为如附图I所示，模板粒子分散在含有一定量的疏水性抗肿瘤药物的氯仿中，并在室温条件下震动吸附12h。离心，去掉上层清液，真空抽干负载有疏水性药物的模板粒子，并在层层组装前将模板粒子稍稍超声一会儿。接着将模板例子置于聚乙烯亚胺的NaCl溶液中，吸附一定时间后，离心分离，清洗、去除未吸附的聚电解质溶液；然后将上述粒子置于部分氧化海藻酸钠(ADA)溶液中，吸附一定时间后，离心分离，清洗；再将上述粒子加入到胱胺二盐酸盐的溶液中，吸附一定时间后，离心分离，清洗。重复上述过程，依次交替吸附ADA和胱胺二盐酸盐至所需层数，除核后即可得到自发荧光双响应性的载药胶囊。本发明中所述碳酸锰模板粒子均按照下述方法制备而得分别配置O. 016MMnS04溶液和O. 16M NH4HCO3溶液，取一定体积的O. 016M MnSO4溶液于烧杯中，随后加入乙醇溶液，混合均匀(可超声5 10s)(乙醇的加入量要保持乙醇=MnSO4=I 10);一次性快速加入等体积的O. 16M NH4HCO3溶液于烧杯中，立即超声(根据所要制备的粒子大小超声不同时间)；静置约30分钟，取沉淀物离心，多次水洗，得到的MnCO3粒子在4°C下贮存。制备的模板粒子的结构为表面光滑的实心粒子，直径为1-10 μ Μ，优选2 μ M ;所述碳酸钙模板粒子均按照下述方法制备而得分别配置IOmL O. 2Μ CaCl2和IOmL O. 2Μ Na2CO3溶液，取ImL的Na2CO3溶液于小反应瓶中，一次性快速加入等体积的CaCl2溶液于瓶中，立即搅拌30s，静置一段时间，将沉淀物离心并多次水洗，最后用乙醇洗涤，真空干燥得到的CaCO3粒子在低温下贮存。制备的模板粒子结构为中空多孔结构，其表面由直径为20-50nm的碳酸钙纳米粒子组成，直径可控制在1_5 μ M之间，优选3 μ M的CaCO3粒子为模板粒子。所述二氧化硅模板粒子均按照下述方法制备而得称取O. 25g CTAB溶解在120mL蒸馏水中。将0.875mL 2M NaOH溶液加入到上述CTAB溶液中，搅拌加热至80°C。然后将I. 25mL TEOS逐滴加入到上述混合物中。反应混合物在80°C下继续搅拌反应2小时，所得 到的白色粉末用甲醇充分洗涤并真空干燥24小时。最后将白色粉末置于马弗炉中在500°C下煅烧6小时以除去CTAB模板。该二氧化硅模板粒子的结构为长径比为1-3的短棒状粒子，且粒子内部具有平行中空孔道，长径为100-500nm，优选100_200nmo实施例I、pH与还原双响应的自发荧光微胶囊I)制备模板粒子分别配置O. 016M MnSO4溶液和O. 16M NH4HCO3溶液，取一定体积的O. 016M MnSO4溶液于烧杯中，随后加入乙醇溶液，混合均匀(可超声5 IOs)(乙醇的加入量要保持乙醇=MnSO4=I 10);一次性快速加入等体积的O. 16MNH4HC03溶液于烧杯中，立即超声(根据所要制备的粒子大小超声不同时间)；静置约30分钟，取沉淀物离心，多次水洗，得到的MnCO3粒子在4°C下贮存。制备的模板粒子的直径为2μ M ;2)将步骤I)所得150mg碳酸锰模板粒子分散到浓度为lgL—1的阳离子聚电解质聚乙烯亚胺(PEI，Mw=50000-100000)的O. 5M的NaCl的水溶液中，吸附15min后，3000rpm离心分离3min，去掉上层清液，用去离子水洗涤三次，得到表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子；3)随后将步骤2)所得表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入281/1氧化度为65%的部分氧化的聚多糖海藻酸钠(ADA)的O. 5M的NaCl的水溶液中，并在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附部分氧化的聚多糖ADA的碳酸锰模板粒子；4)再将步骤3)所得表面吸附部分氧化的聚多糖海藻酸钠ADA的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入含有SgL—1胱胺二盐酸盐(CM)的水溶液中，在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附有胱胺二盐酸盐(CM)的碳酸锰模板粒子；5)重复步骤3)和4)，使碳酸锰模板粒子表面依次交替吸附ADA和CM直到5个双层后，将所得组装好的粒子分散液逐滴滴加到O. IM的Na2EDTA溶液中分批溶掉作为核的碳酸锰模板粒子，得到本发明提供的PH与还原双响应的自发荧光微胶囊。为了便于表达，以后简写为(ADA/CM)5。使用激光共聚焦荧光显微镜观察中空微胶囊在本体溶液中的形貌和自发荧光特点。取5μ L的微胶囊悬液滴到24X50X0. 13-0. 17毫米的载玻片上，上面盖一片20X20X0. 13-0. 17毫米的盖玻片，轻轻压紧，并用真空硅油密封。选用405激光器激发，在对应的发射波长下观察。如附图2所示，当微胶囊被405nm的激光激发时，在三个发射波段425nm-475nm (a), 500nm-550nm (b), 600-650nm (c)分别收集胶囊的共聚焦突光图片。明显的是，荧光强度最强的图片对应于收集于蓝色通道(图a)，而荧光强度最弱的图片对应于收集于红色通道(C)。选区荧光发射光谱的峰值出现在481nm，与区段荧光图片的结果相吻合(d)。微胶囊的这种自发荧光的现象归因于所形成的不饱和希弗碱键的η- π *跃迁。接下来，共聚焦系统表征不同pH值和还原性试剂的缓冲液中的胶囊的通透性，分子量为2000kDa的FITC-dextran为荧光探针。将胶囊分别悬浮于pH=7. 4; pH=5. O; pH=7. 4，IOmM DTT的缓冲液中Ih后，等体积的胶囊悬浮液与FITC-dextran混合，10分钟后，在共聚焦显微镜下以488nm的激光器激发并观察胶囊囊壁的通透情况。如附图3所示，对照图b和图a可以看到，当pH由7. 4变化为5. O时，胶囊由内腔荧光强度明显低于外部变成胶囊内外强度一致。这就表明，当PH值降低时，大分子可以透过囊壁进入、胶囊内部。原因可能在于(ADA/CM)J5囊是通过希弗碱键而构筑的，希弗碱作用在弱酸条件下会变得不稳定甚至部分解离，由此，造成了囊壁的结构疏松，而改善了其通透性。同等重要的是，对照图c和图b可以看到，在同样的酸度条件下(pH ^ 7. 4)，当环境中存在还原性试剂IOmM DTT时，通透性也同样增加，原因在于囊壁中的S-S被还原断键，证实了胶囊的还原响应性。结果证明了如此制备的微胶囊具有PH和还原性双敏感性的性质。实施例2、制备负载尼罗红或者多烯紫杉醇的载药微胶囊I)制备模板粒子:分别配置IOmL O. 2M CaCl2和IOmL O. 2M Na2CO3溶液，取ImL的Na2CO3溶液于小反应瓶中，一次性快速加入等体积的CaCl2溶液于瓶中，立即搅拌30s，静置一段时间，将沉淀物离心并多次水洗，最后用乙醇洗涤，真空干燥得到的CaCO3粒子在低温下贮存。该模板粒子CaCO3粒子的直径为3μ M ;2)将步骤I)所得150mg碳酸钙模板粒子分别分散在含有O. 5mg的尼罗红或5mg的多烯紫杉醇的ImL氯仿中，并在室温条件下震动吸附12h。离心，去掉上层清液，真空抽干负载有疏水性药物的CaCO3粒子，并在层层组装前将模板粒子稍稍超声5min (改为具体时间)，得到吸附有尼罗红或多烯紫杉醇的碳酸钙模板粒子；3)将步骤2)所得150mg吸附有尼罗红或多烯紫杉醇的碳酸钙模板粒子分散到浓度为IgL1的阳离子聚电解质聚乙烯亚胺(PEI，Mw=50000-100000)的O. 5M的NaCl的水溶液中，吸附15min后，3000rpm离心分离3min，去掉上层清液，用去离子水洗涤三次，得到表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸钙模板粒子；4)随后将步骤3)所得表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸钙模板粒子的悬浮液加入281/1氧化度为65%的部分氧化的聚多糖海藻酸钠(ADA)的O. 5M的NaCl的水溶液中，并在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附部分氧化的聚多糖ADA的碳酸钙模板粒子；5)再将步骤4)所得表面吸附部分氧化的聚多糖ADA的碳酸钙模板粒子的悬浮液加入含有SgL—1胱胺二盐酸盐(CM)的水溶液中，在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附有胱胺二盐酸盐(CM)的碳酸钙模板粒子；6)重复步骤4)和5)，使碳酸钙模板粒子表面依次交替吸附ADA和CM直到5个双层后，将所得组装好的粒子分散液逐滴滴加到O. IM的Na2EDTA溶液中分批溶掉作为核的碳酸钙模板粒子，得到本发明提供的负载尼罗红或者多烯紫杉醇的载药微胶囊。用激光共聚焦荧光显微镜观察负载尼罗红载药模板层层组装粒子在除核前(附图4a)后(附图4b)形貌图，并对胶囊进行选区荧光发射扫描(附图4c)，发现荧光发射的峰值在620nm，进一步证明了囊壁上的红色荧光来源于尼罗红的荧光发射，而非来源于胶囊的自发荧光；并将负载多烯紫杉醇的载药微胶囊与人骨肉瘤细胞连续培养48h，用MTT法检测其细胞毒性。其结果如附图5所示，蓝色的柱状图代表了载药微胶囊的细胞毒性，红色的柱状图代表相同浓度的溶解在DMSO中的自由的抗肿瘤药物的细胞毒性实验。实施例3、pH与还原双响应自发荧光微胶囊I)制备模板粒子分别配置O. 016M MnSO4溶液和O. 16M NH4HCO3溶液，取一定体积的O. 016M MnSO4溶液于烧杯中，随后加入乙醇溶液，混合均匀(可超声5 IOs)(乙醇的加入量要保持乙醇=MnSO4=I 10);一次性快速加入等体积的O. 16MNH4HC03溶液于烧杯中，立即·超声(根据所要制备的粒子大小超声不同时间)；静置约30分钟，取沉淀物离心，多次水洗，得到的MnCO3粒子在4°C下贮存。该模板粒子为表面光滑的实心粒子，直径为2M ；2)将步骤I)所得的150mg碳酸锰模板粒子分散到浓度为lgL—1的阳离子聚电解质聚乙烯亚胺(PEI，Mw=50000-100000)的O. 5M的NaCl的水溶液中，吸附15min后，3000rpm离心分离3min，去掉上层清液，用去离子水洗涤三次，得到表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子；3)随后将步骤2)所得表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入28171氧化度为65%的部分氧化的聚多糖葡聚糖的O. 5M的NaCl的水溶液中，并在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附部分氧化的聚多糖葡聚糖的碳酸锰模板粒子；4)再将步骤3)所得表面吸附部分氧化的聚多糖葡聚糖的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入含有SgL—1胱胺二盐酸盐(CM)的水溶液中，在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附有胱胺二盐酸盐(CM)的碳酸锰模板粒子；5)重复步骤3)和4)，使碳酸锰模板粒子表面依次交替吸附部分氧化的葡聚糖和CM直到5个双层后，将所得组装好的粒子分散液逐滴滴加到O. IM的Na2EDTA溶液中分批溶掉作为核的碳酸锰模板粒子，得到本发明提供的PH与还原双响应的自发荧光微胶囊。实施例4、pH与还原双响应自发荧光微胶囊I)制备模板粒子分别配置O. 016M MnSO4溶液和O. 16M NH4HCO3溶液，取一定体积的O. 016M MnSO4溶液于烧杯中，随后加入乙醇溶液，混合均匀(可超声5 IOs)(乙醇的加入量要保持乙醇=MnSO4=I 10);一次性快速加入等体积的O. 16MNH4HC03溶液于烧杯中，立即超声(根据所要制备的粒子大小超声不同时间)；静置约30分钟，取沉淀物离心，多次水洗，得到的MnCO3粒子在4°C下贮存。该模板粒子为表面光滑的实心粒子，直径为2μ M ;2)将步骤I)所得150mg模板粒子分散到浓度为lgL—1的阳离子聚电解质聚乙烯亚胺(PEI，Mw=50000-100000)的O. 5M的NaCl的水溶液中，吸附15min后，3000rpm离心分离3min，去掉上层清液，用去离子水洗涤三次，得到表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子；3)随后将步骤2)所得表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入28171氧化度为65%的部分氧化的聚多糖淀粉的O. 5M的NaCl的水溶液中，并在震荡条件下吸附2h后，用去离子 水洗涤三次，得到表面吸附部分氧化的聚多糖淀粉的碳酸锰模板粒子；4)再将步骤3)所得表面吸附部分氧化的聚多糖淀粉的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入含有SgL—1胱胺二盐酸盐(CM)的水溶液中，在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附有胱胺二盐酸盐(CM)的碳酸锰模板粒子；5)重复步骤3)和4)，使碳酸锰模板粒子表面依次交替吸附淀粉和CM直到5个双层后，将所得组装好的粒子分散液逐滴滴加到O. IM的Na2EDTA溶液中分批溶掉作为核的碳酸锰模板粒子，得到本发明提供的PH与还原双响应的自发荧光微胶囊。实施例5、pH与还原双响应自发荧光微胶囊I)制备模板粒子分别配置O. 016M MnSO4溶液和O. 16M NH4HCO3溶液，取一定体积的O. 016M MnSO4溶液于烧杯中，随后加入乙醇溶液，混合均匀(可超声5 IOs)(乙醇的加入量要保持乙醇=MnSO4=I 10);一次性快速加入等体积的O. 16MNH4HC03溶液于烧杯中，立即超声(根据所要制备的粒子大小超声不同时间)；静置约30分钟，取沉淀物离心，多次水洗，得到的MnCO3粒子在4°C下贮存。该模板粒子为表面光滑的实心粒子，直径为2μ M ;2)将步骤I)所得150mg碳酸锰模板粒子分散到浓度为lgL—1的阳离子聚电解质聚乙烯亚胺(PEI，Mw=50000-100000)的O. 5M的NaCl的水溶液中，吸附15min后，3000rpm离心分离3min，去掉上层清液，用去离子水洗涤三次，得到表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子；3)随后将步骤2)所得表面包覆阳离子聚电解质层聚乙烯亚胺的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入28171氧化度为65%的部分氧化的聚多糖肝素的O. 5M的NaCl的水溶液中，并在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附部分氧化的聚多糖肝素的碳酸锰模板粒子；4)再将步骤3)所得表面吸附部分氧化的聚多糖肝素的碳酸锰模板粒子的悬浮液加入含有SgL—1胱胺二盐酸盐(CM)的水溶液中，在震荡条件下吸附2h后，用去离子水洗涤三次，得到表面吸附有胱胺二盐酸盐(CM)的碳酸锰模板粒子；5)重复步骤3)和4)，使碳酸锰模板粒子表面依次交替吸附肝素和CM直到5个双层后，将所得组装好的粒子分散液逐滴滴加到O. IM的Na2EDTA溶液中分批溶掉作为核的碳酸锰模板粒子，得到本发明提供的PH与还原双响应的自发荧光微胶囊。结论本发明构建了生物兼容性的，对肿瘤细胞低pH，高还原态的微环境敏感的基于聚多糖的自发荧光微胶囊。而且借助于CaCO3模板粒子的表面多孔、内部疏松的结构，可以富集疏水性的抗肿瘤药物并在除核后将药物晶体负载在胶囊的囊壁上，并且实现胶囊的刺激响应性的释放药物而起到抗肿瘤的目的。尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化、和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。
权利要求
1.一种自发荧光微胶囊，由胱胺二盐酸盐交联部分氧化的聚多糖而得。
2.根据权利要求I所述的微胶囊，其特征在于所述部分氧化的聚多糖选自部分氧化的海藻酸钠、部分氧化的葡聚糖、部分氧化的肝素和部分氧化的淀粉中的至少一种； 所述部分氧化的海藻酸钠为氧化度为60-70%的海藻酸钠； 所述部分氧化的葡聚糖为氧化度为60-70%的葡聚糖； 所述部分氧化的肝素为氧化度为60-70%的肝素； 所述部分氧化的淀粉为氧化度为60-70%的淀粉； 所述胱胺二盐酸盐交联部分氧化的聚多糖的质量比为5-10 :1-5，优选5 :2。
3.一种制备权利要求I或2所述自发荧光微胶囊的方法，包括如下步骤 1)制备模板粒子； 2)将所述步骤I)所得模板粒子置于聚阳离子电解质的NaCl的水溶液中进行吸附，吸附结束后得到表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子； 3)将所得表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子置于部分氧化的聚多糖的NaCl的水溶液中进行吸附，得到表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子； 4)将所得表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子置于交联剂的水溶液中进行吸附，得到表面吸附胱胺二盐酸盐的模板粒子； 5)重复所述步骤3 )和4 )至在所述步骤I)所得模板粒子表面得到目标层数后，溶解所述步骤I)所得的模板粒子，得到所述自发荧光微胶囊。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，构成所述模板粒子的化合物为碳酸锰或碳酸钙； 构成所述模板粒子的化合物为碳酸锰时，所述模板粒子的结构为表面光滑的实心粒子，直径为1-10 μ Μ，优选2 μ M ; 构成所述模板粒子的化合物为碳酸钙时，所述模板粒子的结构为中空多孔结构，其表面由直径为20-50nm的碳酸钙纳米粒子组成，所述模板粒子的直径为1_5 μ Μ，优选3 μ M ; 所述步骤2)中，所述聚阳离子电解质选自聚乙烯亚胺、聚烯丙基氯化铵和壳聚糖中的至少一种；所述NaCl的水溶液的浓度为O. 5Μ-1. 0Μ，优选O. 5Μ ;所述阳离子聚电解质的NaCl的水溶液中，阳离子聚电解质的浓度为l_5mg/mL，具体为lmg/mL ； 所述步骤3)中，所述部分氧化的聚多糖选自部分氧化的海藻酸钠、部分氧化的葡聚糖、部分氧化的肝素和部分氧化的淀粉中的至少一种，优选部分氧化的海藻酸钠；所述NaCl的水溶液的浓度为O. 5M-1. 0M，优选O. 5M ;所述部分氧化的聚多糖的NaCl的水溶液的浓度为l-5mg/mL,具体为 2mg/mL ； 所述步骤4)中，所述交联剂为胱胺二盐酸盐；所述交联剂的水溶液的浓度为5-10mg/mL,具体为 5mg/mL ； 所述步骤2) -4)吸附步骤中，时间均为60-120分钟，优选120分钟。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，所述部分氧化的海藻酸钠为氧化度为60-70%的海藻酸钠； 所述部分氧化的葡聚糖为氧化度为60-70%的葡聚糖； 所述部分氧化的肝素为氧化度为60-70%的肝素； 所述部分氧化的淀粉为氧化度为60-70%的淀粉。
6.权利要求1-2任一所述自发荧光微胶囊作为疏水性抗肿瘤药物载体的应用； 权利要求1-2任一所述自发荧光微胶囊在制备疏水性抗肿瘤药物中的应用。
7.—种疏水性抗肿瘤药物微胶囊，由载体和负载在所述载体上的抗肿瘤药物组成；其特征在于所述载体为权利要求1-2任一所述自发荧光微胶囊。
8.根据权利要求7所述的疏水性抗肿瘤药物微胶囊，其特征在于所述抗肿瘤药物为多烯紫杉醇。
9.一种制备权利要求7或8所述疏水性抗肿瘤药物微胶囊的方法，包括下述步骤 O制备模板粒子； 2)将所述步骤I)所得模板粒子分散在抗肿瘤药物的氯仿溶液中，吸附后得到负载有疏 水性抗肿瘤药物的模板粒子并除去溶剂； 3)将所述步骤2)所得模板粒子置于聚阳离子电解质的NaCl的水溶液中中进行吸附，吸附结束后得到表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子； 4)将所得表面包覆阳离子聚电解质层的模板粒子置于部分氧化的聚多糖的NaCl的水溶液中进行吸附，得到表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子； 5)将所得表面吸附部分氧化的聚多糖的模板粒子置于交联剂的水溶液中进行吸附，得到表面吸附胱胺二盐酸盐的模板粒子； 6)重复所述步骤4 )和5 )至在所述步骤I)所得模板粒子表面得到目标层数后，溶解所述步骤I)所得的模板粒子，得到所述疏水性抗肿瘤药物微胶囊。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，构成所述模板粒子的化合物为碳酸钙或二氧化硅； 构成所述模板粒子的化合物为碳酸钙时，所述模板粒子的结构为中空多孔结构，其表面由直径为20-50nm的碳酸钙纳米粒子组成，所述模板粒子的直径为1_5 μ Μ，优选3 μ M ; 构成所述模板粒子的化合物为二氧化硅时，所述模板粒子的结构为长径比为1-3的短棒状粒子，且粒子内部具有平行中空孔道，长径为100-500nm，优选100_200nm ; 所述步骤2)吸附步骤中，时间为6-12小时，优选12小时；所述抗肿瘤药物为多烯紫杉醇； 所述步骤3)中，所述阳离子聚电解质的NaCl的水溶液中，所述阳离子聚电解质选自聚乙烯亚胺、聚烯丙基氯化铵和壳聚糖中的至少一种；所述NaCl的水溶液的浓度为O.5-1. 0M,优选O. 5M ;所述阳离子聚电解质的浓度为l-5mg/mL,具体为lmg/mL ； 所述步骤4)中，所述部分氧化的聚多糖选自部分氧化的海藻酸钠、部分氧化的葡聚糖、部分氧化的肝素和部分氧化的淀粉中的至少一种，优选部分氧化的海藻酸钠；所述NaCl的水溶液的浓度为O. 5-1. 0M，优选O. 5M ;所述部分氧化的聚多糖的水溶液浓度为l_5mg/mL，具体为2mg/mL ； 所述步骤)中，所述交联剂为胱胺二盐酸盐；所述交联剂的水溶液的浓度为5-10mg/mL，具体为5mg/mL ； 所述步骤3) -5)吸附步骤中，时间均为60-120分钟，优选120分钟。
全文摘要
本发明公开了一种自发荧光微胶囊及其制备方法及其应用。该自发荧光微胶囊，由胱胺二盐酸盐交联部分氧化的聚多糖而得。该微胶囊由含有醛基的带负电性的聚多糖的聚多糖氧化衍生物和带正电性的小分子交联剂胱胺二盐酸盐交联剂层层交联而得。该微胶囊借助CaCO3等模板粒子的表面多孔、内部疏松的结构，可以富集疏水性的抗肿瘤药物并在除核后将药物晶体负载在胶囊的囊壁上，并且实现细胞内胶囊的刺激响应性的释放药物而起到抗肿瘤的目的。
文档编号A61P35/00GK102727464SQ201210206279
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者李峻柏, 费进波, 高靓 申请人:中国科学院化学研究所