专利名称：鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种鸡揪菌多糖分离纯化方法及其注射液。
背景技术：
自从1969年日本学者千原首次报道香菇多糖具有抗肿瘤活性以后，真菌多糖引起越来越多的关注，成为一个非常活跃的研究领域。药用真菌多糖被称为生物反应调节物(Biological response modifier, BRM),因其具有广泛的生物学活性如免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化、抗病毒等作用。鸡揪菌多糖具有易溶于水不溶于乙醇的特性，可通过水提醇沉的方法获得。但这些多糖含有较多杂质，如游离蛋白质、色素以及一些低分子物质，包括寡糖、一些单搪、盐分等，因此必须将粗提多糖进行纯化并鉴定其纯度，为下一步的研究做准备。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种鸡揪菌多糖分离纯化方法及其注射液。本发明的技术方案如下一种鸡揪菌多糖分离纯化方法，采用超声波法提取，20kHz的超声功率，在80°C、料液比为I : 20、提取40min，共提取2次得多糖粗提物，将多糖粗提物配成浓度为20%的溶液，-20°C冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心lOmin，除去聚沉物；重复冻融5次；将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4 I比例混合,充分振荡30分钟,2000r/min离心lOmin，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液；重复上述步骤3次；向除蛋白后的多糖溶液中加入氨水，调PH值到9，50°C保温，不停搅拌，边搅拌边加入10% H2O2直至溶液呈浅色为止；将脱色后的多糖溶液装入透析袋，透析袋的截留分子量> 8000，以蒸馏水流水透析24小时，40°C减压浓缩至IOOmL,加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心lOmin，将沉淀于40°C鼓风干燥后称重。鸡揪菌多糖注射液，将精制鸡揪菌多糖以生理盐水配制为20mg/mL的多糖溶液，调pH = 7. 0,0. 22um微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装，4°C保存。本试验结合畜禽生产实践将TAP注射液结合疫苗使用，以免疫动物的抗体消长规律、白细胞总数及分类计数、免疫器官指数等指标的变化综合考察了不同剂量TAP的免疫增强效果，结果表明一定剂量TAP可显著提高试验动物的体液免疫及细胞免疫能力，效果优于同剂量的APS。
图I提取温度对TAP粗多糖含量的影响；图2提取液料比对TAP粗多糖含量的影响；图3提取时间对TAP粗多糖含量的影响；
图4提取次数对TAP粗多糖含量的影响；图5两种提取方法对TAP粗多糖含量的影响；图6葡萄糖标准曲线；图7为TAP对口蹄疫抗体的影响(η = 6);注相同时间的柱形图上标不同大小写的同一字母表示差异显著(P < O. 05)，标不同字母表示差异极显著(P < O. 01)；图8为TAP对新城疫抗体的影响(η = 10);注相同时间的柱形图上标不同大小写的同一字母表示差异显著(P <0.05)，标不同字母表示差异极显著(P <0.01)。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I鸡揪菌多糖分离纯化工艺研究I试验材料I. I主要药品与试剂鸡揪菌(Termitomyces albuminosus)子实体干品购自西昌市凉山山珍销售处,重蒸苯酚，透析袋(截留分子量8000 14000)，胰蛋白酶，葡萄糖，浓硫酸，氢氧化钠，无水乙醇，氯仿，正丁醇，过氧化氢等为国产分析纯。I. 2主要仪器DU800紫外可见分光光度计(BeckmanCoulter, Inc), AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，格兰仕微波炉(格兰仕电器有限公司)，超声波清洗机(泰能设备有限公司)，RE52-99型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，Fwl77型中草药粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司)，SW-420-2S型恒温水箱(金坛市新航仪器厂)，CSIOl-IE电热鼓风干燥箱(中外合资重庆四达试验仪器有限公司)，MYIO电磁搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)等。2 方法2. I鸡揪菌粗多糖提取工艺的单因素研究2. I. I温度对粗多糖得率的影响将鸡揪菌于50°C烘干至恒重，粉碎至80目，称取5份2. OOg鸡揪菌粉，按照料液质量比I 20加入40mL蒸馏水，分别在60°C、70°C、80°C、90°C、100°C下提取Ih，只提取I次，通过抽滤将各份滤液分别浓缩后定容至20ml，加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心lOmin，将沉淀于40°C烘干后称重，计算多糖粗提率。2. I. 2液料比对粗多糖得率的影响称取5份2.00g鸡揪菌粉分别以I : 10、1 20、1 30、1 40、1 50的料
液(重量比，克克)比加入蒸馏水，在2. I. I确定的最佳提取温度下提取I次，通过抽滤将各份滤液分别浓缩后定容至20ml,加入3倍体积的无水乙醇后静置3h,3000r/min离心lOmin，将沉淀于40°C烘干后称重，计算多糖粗提率。2. I. 3提取时间对粗多糖得率的影响称取5份2. OOg鸡揪菌粉在以上试验确定的最佳液料比和温度下提取I次，提取时间分别为l、2、3、4、5h，按2. I. I方法提取粗多糖，计算多糖粗提率。2. I. 4提取次数对粗多糖得率的影响
称取5份2. OOg鸡揪菌粉在上述方法确定的最佳提取温度、时间及料液比分别提取1、2、3、4、5次，按2. I. I方法提取粗多糖，计算多糖粗提率。2. 2鸡揪菌粗多糖的提取工艺正交试验由于各提取因素之间有相互交叉影响，为全面考察热水浸提法提取鸡揪菌多糖的工艺参数，根据单因素试验的结果及有关资料，对上述四因素，即提取温度、料液比、提取时间、提取次数进行正交试验设计，采用L9(34)正交试验设计提取工艺并测定鸡揪菌多糖粗提率。各因素水平设计见表I。表I因素水平表
权利要求
1.一种鸡揪菌多糖分离纯化方法，其特征在于，采用超声波法提取，20kHz的超声功率，在80°C、料液比为I : 20、提取40min，共提取2次得多糖粗提物，将多糖粗提物配成浓度为20%的溶液，-20°C冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心lOmin，除去聚沉物；重复冻融5次；将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4 I比例混合，充分振荡30分钟，2000r/min离心lOmin，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液；重复上述步骤3次；向除蛋白后的多糖溶液中加入氨水，调PH值到9，50°C保温，不停搅拌，边搅拌边加入10%H2O2直至溶液呈浅色为止；将脱色后的多糖溶液装入透析袋，透析袋的截留分子量> 8000，以蒸馏水流水透析24小时，40°C减压浓缩至IOOmL,加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心lOmin,将沉淀于40°C鼓风干燥后称重。
2.采用权利要求I所述的方法制备的鸡揪菌多糖制备鸡揪菌多糖注射液，其特征在于，将精制鸡揪菌多糖以生理盐水配制为20mg/mL的多糖溶液，调pH = 7. 0,0. 22 y m微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装，4°C保存。
全文摘要
本发明公开了一种鸡枞菌多糖分离纯化方法，采用超声波法提取，20kHz的超声功率，在80℃、料液比为1∶20、提取40min，共提取2次得多糖粗提物，将多糖粗提物配成浓度为20％的溶液，-20℃冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心10min，除去聚沉物；重复冻融5次；将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4∶1比例混合，充分振荡30分钟，2000r/min离心10min，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液。实验结果表明，一定剂量TAP可显著提高试验动物的体液免疫及细胞免疫能力，效果优于同剂量的APS。
文档编号A61P37/04GK102702377SQ20121020610
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者汪开毓, 王思芦, 赵玲, 陈德芳 申请人:四川农业大学