一种阿魏菇多糖提取与纯化的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然产物多糖提取纯化的技术领域，具体的说，本发明涉及一种生物活性多糖提取纯化的技术领域，更进一步的说，本发明涉及阿魏菇生物多糖的提取纯化的技术领域。
【背景技术】
[0002]阿魏菇是新疆地区特色生物资源之一，因其生长在新疆草原干旱植物阿魏上而得名，阿魏菇真菌多糖具有增强人体免疫力和调节人体生理平衡的作用，深受人们的欢迎，是一种天然营养保健食品。
[0003]阿魏菇味美可口，营养丰富，现有技术记载阿魏菇含有18种氨基酸，人体8种必需氨基酸全都具备，还含有多种微生素及钾、纳、钙、磷、镁、锌、铜、砸等矿物质，蛋白质含量占干菇的20%。特别是阿魏菇真菌多糖的含量是其他食用菌的3-5倍。被誉为“草原上的牛肝菌”。
[0004]多糖是天然生物高分子之一，广泛存在于植物，动物和微生物组织中，自20世纪50年代发现其免疫调节及抗肿瘤活性后，多糖即成为当今生命科学研宄热点之一，而食用菌多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、抗溃疡、抗衰老、增强免疫力、降血压、降血糖等多糖中胜利活性，是新药和功能食品开发重要原料。
[0005]天然多糖的分离提纯，现有技术常见报道的热水浸提法是提取多糖阿魏菇多糖常用方法。但是，传统热水浸提法存在提取时间长，温度高，得率低等问题，针对这些不足，近年来，出现了超声或微波辅助、超高压、酶法，超声一微波联合萃取等新的提取技术与方法。
[0006]超声-微波协同萃取具有超声波和微波功率独立可调、定时定温。适用于快速、高效、靶向合成指定化工单体及目标混合物，适用领域涉及中草药物有效成分的萃取，萃取过程具有化学选择性高、萃取效率高、有效成分损失率低、产物结晶度高等特点。
[0007]聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物，对酚类等富含酚羟基的化合物具有较强的吸附性，也能吸附蛋白质，因此对于多糖类物质的脱色和脱蛋白的效果。但目前聚酰胺层析柱尚未应于与阿魏菇粗多糖纯化当中，相关报道和研宄也在国内没有见到。
[0008]因此，探索和研宄适口性好、溶水性好、不含油及任何添加剂、能耗低、实现鹰嘴豆粉工业化连续生产，工业化操作简单的制备工艺过程具有重要的意义。
【发明内容】
[0009]针对目前未见利用超声-微波协同萃取应用在阿魏菇多糖的提取纯化技术领域，也未见利用聚酰胺层析柱应用于阿魏菇粗多糖纯化的研宄现状。本发明旨在于提供一种阿魏菇多糖的提取纯化方法，利用超声一微波提取结合真空干燥技术，利用聚酰胺层析柱纯化、冷冻干燥得到纯化后阿魏菇多糖，得到纯度高、生物活性好、质量稳定的阿魏菇多糖产品，具有广泛的应用价值。
[0010]本发明通过以下技术方案实现的。
[0011]本发明以干燥阿魏菇子实体经乙醇浸提，首次将超声一微波联用技术应用与阿魏菇多糖的提取，并利用响应面法优化了超声一微波提取的主要技术参数提取温度、提取时间和料液比，经醇沉、冷冻干燥，经过聚酰胺层析柱纯化，去离子水洗脱，冷冻干燥得到纯化后阿魏菇多糖，与传统热水浸提法相比较，多糖的含量和纯度都有较大提高，并且应用本发明对阿魏菇多糖的纯化方法对于后续多糖的活性研宄影响很小，活性保留率较高。
[0012]本发明具体提供一种阿魏菇多糖的提取纯化方法，具体的制备方法如下:
(I)将干燥阿魏菇子实体，用粉碎机粉碎并过筛，称取过40目的阿魏菇粉末与80%乙醇按照料液比1:10 —1:15 (g/ml)80°C回流4h，滤除乙醇，残渣减压蒸发至干。
[0013](2)超声一微波提取:利用响应面优化方法确定提取温度、提取时间和料液比处理工艺条件:将步骤(2)得到的残渣与水按照料液比1:15 (g/ml)混合后移入超声微波萃取仪中，聚酰胺用量粗多糖5倍体积，洗脱液为2倍柱体积去离子水，洗脱速度1.5ml/min，然后滤液离心过滤后将残渣再次进行超声微波提取，合并两次滤液，再次离心后，取上清液，上清液去除杂质。
[0014](3)醇沉:向步骤(2)得到的上清液中加入95vt%工业酒精(体积百分浓度，下同)静置12-24小时后，4000r/min冷冻离心15min得到沉淀物。
[0015](4)冷冻干燥:步骤(3)收集的沉淀物用3倍体积的去离子水溶解后放入真空冷冻干燥仪，在真空度-0.06 MP至-0.08MP、温度彡_40°C，在12-24小时处理完毕。
[0016](5)聚酰胺层析柱纯化:将步骤(4)制备的沉淀物3倍去离子水溶解，形成的多糖粗提液，装入聚酰胺层析柱中，聚酰胺用量粗多糖5倍体积，洗脱液为2倍柱体积去离子水，洗脱速度1.5ml/min时多糖得率为27.29%，多糖纯度72.49%，蛋白脱除率62.35%。
[0017](6)浓缩干燥:将步骤(5)得到多糖洗脱液收集合并，并减压蒸发浓缩，4000r/min冷冻离心15min得到浓缩液后，冷冻干燥得到纯化后阿魏菇多糖。
[0018]本发明采用将干燥阿魏菇子实体破碎粉碎、超声一微波联用技术提取、醇沉、冷冻干燥、聚酰胺层析柱纯化等处理技术手段，尽管离不开现有技术的支持和启发，但是超声一微波联合提取技术以及聚酰胺层析柱首次应用于纯化工艺中阿魏菇子实体的工艺条件:提取温度、提取时间和料液比，以及聚酰胺层析柱纯化中的以多糖保留率，多糖纯度，蛋白脱除率作为评价指标，确定最佳上样量，去离子水用量，洗脱速率等工艺条件对于决定阿魏菇子实体多糖的品质都具有重要的作用，也是决定性因素，不能说采用的技术手段和工具是现有技术，进而否定本发明提供的整体制备阿魏菇子实体多糖的创新性，现有所有技术发明和创新都离不开现有技术的支撑和基础。
[0019]本发明利用响应面优化提取工艺条件，测定纯化前后的多糖含量，多糖纯度，蛋白脱含量为评价指标，确定吸附洗脱最佳条件:利用响应面优化提取工艺条件，测定纯化前后的多糖含量，多糖纯度，蛋白脱含量为评价指标，确定吸附洗脱最佳条件:聚酰胺用量，去离子水用量，洗脱速度，聚酰胺用量粗多糖5倍体积，洗脱液为2倍柱体积去离子水，洗脱速度
1.5ml/min时多糖得率为27.29%，多糖纯度72.49%，蛋白脱除率62.35% ;洗脱吸附前多糖得率32.79%，多糖纯度54.33%，蛋白含量5.79%。洗脱吸附后多糖含量40.68%，多糖纯度72.49%，蛋白含量2.18%。可见，本发明提供的阿魏菇子实体多糖制备工艺中的各技术因素和技术参数都经过综合考量和设计，本发明提供的阿魏菇子实体多糖的制备方法中各技术环节具有上下一体，任何技术步骤不可或缺，紧密不可分割的特点，不能任何取舍肢解其中的技术步骤。
[0020]本发明通过实施如上提供的技术方案达到如下的有益效果:
(I)本发明在制备阿魏菇子实体多糖时，将超声一微波提取联合聚酰胺层析柱纯化工艺有机结合，扬长避短，合理组合，优势互补，有效地克服现有提取工艺中存在的提取时间长，工序复杂，多糖损失率高所得多糖纯度较低等问题:在实验室以及在工业生产中，水提醇沉工序复杂需要水提，过滤，再水提，过滤合并滤液浓缩纯化等工艺步骤提起时间长，劳动成本高，并且多糖提取率低，就目前研宄结果表面阿魏菇多糖的得率一般在5%?25%，除此之外，所采用的纯化手段一般为Sevag法以及利用SephadeX200等进行纯化，存在有机物质残留，纯化所需材料成本高等问题，不适用于工业化大生产。本发明将超声一微波联用技术与聚酰胺层析柱纯化技术两项技术结合，扬长避短，合理组合，优势互补，极大的提高了阿魏菇多糖的得率，多糖纯度以及蛋白质的脱除率等在本发明中响应面得出的最佳工艺条件下；聚酰胺用量粗多糖5倍体积，洗脱液为2倍柱体积去离子水，洗脱速度1.5ml/min时多糖得率为27.29%，多糖纯度72.49%，蛋白脱除率62.35%。明显优于其他提取方法。
[0021](2)本发明的一种阿魏菇多糖的提取、纯化方法与传统热水浸提法相比较，多糖的含量和纯度都有较大提高，多糖得率由5%?25%提高到了 20%?27.3%,多糖纯度由原来的54.33%提高到了 72.49%，并且应用本发明对阿魏菇多糖的纯化方法对于后续多糖的活性研宄影响很小，活性保留率较高，在体外抗氧化实验中对于羟自由基(0H.)，超氧阴离子自由基(02 —)以及DPPH的清除率可以分别达到63%，59%，67%，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，最小抑菌浓度分别为3.125,6.25和3.125mg/mL，且抑菌活性与多糖质量浓度呈正相关关系。
[0022](3)本发明提取方法与现有技术相比，降低了生产成本，得率由15.49%到27.29%，提高了 11.8%，多糖纯度由54.33%到72.49%，提高了 18.16%。
【附图说明】
[0023]图1显示为苯酚一硫酸法测定阿魏菇多糖标准曲线。
【具体实施方式】
[0024]本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0025]实施例一:阿魏菇多糖的提取纯化
阿魏菇多糖的提取纯化方法具体制备方法步骤如下:
(I)将干燥阿魏菇子实体，用粉碎机粉碎并过筛，称取过40目的阿魏菇粉末与80%乙醇按照料液比1:10 —1:15 (g/ml) 80°C回流4h，滤除乙醇，残渣减压蒸发至干。
[0026]( 2 )超声一微波提取:利用响应面优化方法确定提取温度、提取时间和料液比处理工艺条件:将步骤(2)得到的残渣与水按照料液比1:15 (g/ml)混合后移入超声微波萃取仪中，在超声功率50W，提取温度70°C，微波频率2450MHz，功率70W，提取15min。然后滤液离心过滤后将残渣再次进行超声微波提取，合并两次滤液，再次离心后，取上清液，上清液去除杂质。
[0027](3)醇沉:向步骤(2)得到的上清液中加入95vt%工业酒精(体积百分浓度，下同)静置12-24小时后，4000r/min冷冻离心15min得到沉淀物。