r>[0028](4)冷冻干燥:步骤(3)收集的沉淀物3倍体积的去离子水溶解后放入真空冷冻干燥仪，在真空度-0.06 MP至-0.08MP、温度< _40°C，在12-24小时处理完毕。
[0029](5)聚酰胺层析柱纯化:将步骤(4)中沉淀物3倍去离子水溶解，形成的多糖粗提液，装入聚酰胺层析柱中利用响应面优化提取工艺条件，测定纯化前后的多糖含量，多糖纯度，蛋白脱含量为评价指标，确定吸附洗脱最佳条件:聚酰胺用量，去离子水用量，洗脱速度，得到当聚酰胺用量粗多糖5倍体积，洗脱液为2倍柱体积去离子水，洗脱速度1.5ml/min时多糖得率为27.29%，多糖纯度72.49%，蛋白脱除率62.35% ;洗脱吸附前多糖得率32.79%，多糖纯度54.33%，蛋白含量5.79% ;洗脱吸附后多糖含量40.68%，多糖纯度72.49%，蛋白含量2.18%。
[0030](6)浓缩干燥:将步骤(5)得到多糖洗脱液收集合并，并减压蒸发浓缩，4000r/min冷冻离心15min得到浓缩液后，冷冻干燥得到纯化后阿魏菇多糖。
[0031]本发明采用将干燥阿魏菇子实体破碎粉碎、超声一微波提取、醇沉、冷冻干燥、聚酰胺层析柱纯化等处理技术手段尽管离不开现有技术的支持和启发，但是超声一微波提取联合聚酰胺层析柱纯化工艺中阿魏菇子实体的提取温度、提取时间和料液比，以及聚酰胺层析柱纯化中的以多糖保留率，多糖纯度，蛋白脱除率作为评价指标，确定最佳上样量，去离子水用量，洗脱速率等工艺条件对于决定阿魏菇子实体多糖的品质都具有重要的作用，也是决定性因素，不能说采用的技术手段和工具是现有技术，进而否定本发明提供的整体制备阿魏菇子实体多糖的创新性，现有所有技术发明和创新都离不开现有技术的支撑和基础。可见，本发明提供的阿魏菇子实体多糖制备工艺中的各技术因素和技术参数都经过综合考量和设计，本发明提供的阿魏菇子实体多糖的制备方法中各技术环节具有上下一体，任何技术步骤不可或缺，紧密不可分割的特点，不能任何取舍肢解其中的技术步骤。
[0032]实施例二:
(O原料预处理:将阿魏菇干燥子实体剪碎后经过粉碎机粉碎，过40目筛，称取阿魏菇粗粉10g，向其中加入150ml80%乙醇80°C回流两次，每次2h，滤除乙醇，残渣减压蒸发至干。
[0033](2)超声一微波萃取:向经过预处理的残渣中加入150ml水，溶解均匀后移入超声微波萃取仪中，在超声功率70W，提取温度70 °C，提取15min，然后滤液在4000r/min转速下，冷冻离心15min，收集上清液后将残渣再次进行超声微波提取，合并两次上清液，上清液，然后加入4倍体积95%乙醇，使混合液中乙醇体积百分浓度为80%，静置24h后于4000r/min转速下离心15min得到沉淀物5.4g。
[0034](3)聚酰胺层析柱纯化:称取60—100目聚酰胺30g，倒入一定量的蒸馏水加热15min使之分散均匀，装入层析柱，用蒸馏水完全洗脱后，加入已经用去离子水溶解了多糖沉淀物形成的多糖溶液80ml，进行吸附平衡20min，然后用1.5倍去离子水以1.0ml/min速率进行洗脱，并收集洗脱液。
[0035](4)浓缩，干燥:将得到多糖洗脱液收集合并，并在真空浓缩，真空度-0.07?-0.08MPa，温度彡70°C，冷冻干燥在_35°C温度下，冷冻干燥24h后得到纯化后干燥粉末4.7g,取出1.0g溶解为多糖溶液备用。
[0036]标准曲线的绘制:以干燥至恒重的葡萄糖为标准品，精确称取，用蒸馏水溶解定容，使其浓度为1.16 μ g/ μ I的标准溶液，另外取苯酚10g，加水150ml溶解，至于棕色瓶中，即苯酚试液。精确吸取标准溶液10，20，4 0，60，80，100 μ 1，分别至于有塞的试管中，各加蒸馏水使体积为1ml，再各加苯酚1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀后置沸水中加热15min，取出冷却至室温；另取蒸馏水Iml加入苯酚和浓硫酸，同上，造作作为空白对照，用721型分光光度计于490nm处测定吸光度，以吸收度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线(图1)得到回归方程:A=10.762C-0.0318，R2=0.9995.样品总多糖含量的测定:精确吸取样品液1ml，按照标准曲线项下方法测定吸光度，根据回归方程，求得阿魏菇多糖平均含量为47.2%。同时计算阿魏菇多糖纯度的其纯化为88.4%。
[0037]实施例三:对比例I
热水浸提法提取多糖:将阿魏菇干燥子实体剪碎后经过粉碎机粉碎，过40目筛，称取阿魏菇粗粉10g，向其中加入150ml80%乙醇80°C回流两次，每次2h，滤除乙醇，残渣减压蒸发至干。向经过预处理的残渣中加入150ml水，溶解均匀后，在80°C条件下水浴回流两次，每次2h，合并两次提取液，然后真空浓缩真空度-0.07?-0.08MPa，温度< 70°C )。冷冻发燥得到阿魏菇粗多糖固态。
[0038]Sevag方法处理脱蛋白:取得粗多糖固体溶解的溶液，与Sevag试剂(V氯仿正丁醇=4:1)按照体积比5:1，震摇3次每次15min后，冷冻离心机4000r/min转速下离心15min取上清液后，加入4倍体积95%乙醇，使混合液中乙醇体积百分浓度为80%，静置24h，后于得到沉淀物4.3g按照多糖含量测定方法测定多糖含量为35.4%，多糖纯度按照多糖纯度测定方法测定为68.6%.通过对实例二与实施例三提供的对比例I的比较可以看出，本发明提取方法与现有技术相比，降低了生产成本，得率提高了 11.8%，多糖纯度提高了 19.8%。
[0039]实施例四:对比例2
超声-微波萃取阿魏菇多糖:将阿魏菇干燥子实体剪碎后经过粉碎机粉碎，过40目筛，称取阿魏菇粗粉10g，向其中加入150ml80%乙醇80°C回流两次，每次2h，滤除乙醇，残渣减压蒸发至干。向经过预处理的残渣中加入150ml水，溶解均匀后移入超声微波萃取仪中，在超声功率70W，提取温度70°C，提取15min，然后滤液在4000r/min转速下，冷冻离心15min，收集上清液后将残渣再次进行超声微波提取，合并两次上清液，上清液，然后加入4倍体积95%乙醇，使混合液中乙醇体积百分浓度为80%，静置24h后于4000r/min转速下离心15min得到沉淀物5.8g。
[0040]Sevag方法处理脱蛋白:取得粗多糖固体溶解的溶液，与Sevag试剂(V氯仿正丁醇=4:1)按照体积比5:1，震摇3次每次15min后，冷冻离心机4000r/min转速下离心15min取上清液后，加入4倍体积95%乙醇，使混合液中乙醇体积百分浓度为80%，静置24h，后于得到沉淀物4.5g按照多糖含量测定方法测定多糖含量为37.8%，多糖纯度按照多糖纯度测定方法测定为70.9%.通过对实例二与实施例四提供的对比例2的比较可以看出，本发明提取方法与现有技术相比，降低了生产成本，得率提高了 9.4%，多糖纯度提高了 17.5%。
[0041]如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种阿魏菇多糖的提取纯化方法，其特征在于，具体的制备方法如下: (1)将干燥阿魏菇子实体，用粉碎机粉碎并过筛，称取过40目的阿魏菇粉末与80%乙醇按照料液比1:10至1:15 (g/ml)80°C回流4h，滤除乙醇，残渣减压蒸发至干； (2)超声一微波提取:将步骤(2)得到的残渣与水按照料液比1:15 (g/ml)混合后移入超声微波萃取仪中，在超声功率50W，提取温度70°C，微波频率2450MHz，功率70W，提取15min，然后滤液离心过滤后将残渣再次进行超声微波提取，合并两次滤液，再次离心后，取上清液，上清液去除杂质； (3)醇沉:向步骤(2)得到的上清液中加入95vt%工业乙醇(体积百分浓度)静置12-24小时后，4000r/min冷冻离心15min得到沉淀物； (4)冷冻干燥:步骤(3)收集的沉淀物，3倍去离子水溶解后，放入真空冷冻干燥仪，在真空度-0.06 MP至-0.08MP、温度彡_40°C，在12-24小时处理完毕； (5)聚酰胺层析柱纯化:将步骤(4)中沉淀物3倍体积去离子水溶解，溶解形成的多糖粗提液，然后装入聚酰胺层析柱中利用响应面优化方法测定纯化前后的多糖含量，多糖纯度，蛋白脱含量为评价指标，确定吸附洗脱最佳条件:聚酰胺用量，去离子水用量，洗脱速度，得到当聚酰胺用量粗多糖5倍体积，洗脱液为2倍柱体积去离子水，洗脱速度1.5ml/min时多糖得率为27.29%，多糖纯度72.49%，蛋白脱除率62.35% ； (6 )浓缩干燥:将步骤(5 )得到多糖洗脱液收集合并，并减压蒸发浓缩，4000r/min冷冻离心15min得到浓缩液后，冷冻干燥得到纯化后阿魏菇多糖。
【专利摘要】本发明公开了一种阿魏菇多糖提取与纯化的方法.将阿魏菇子实体粉碎过40目筛,与80%乙醇料液比1：10—1:15，在80℃回流4h，滤除乙醇，残渣减压蒸发至干后与水以料液比1：15混合后经超声微波萃取，在超声功率50W，提取温度70℃，微波频率2450MHz，功率70W，提取15min。滤液离心过滤后残渣再次超声微波提取，合并两次滤液，离心取上清液去除杂后，多糖粗提液过聚酰胺层析柱吸附纯化：聚酰胺用量粗多糖5倍体积，洗脱液为2倍柱体积去离子水，洗脱速度1.5ml/min，浓缩真空干燥得到纯化后阿魏菇多糖。本发明工艺路线简单，能耗低，显缩短提取时间，提高提取率，产物纯度高，生物活性好，质量稳定。
【IPC分类】C08B37-00
【公开号】CN104744601
【申请号】CN201510167505
【发明人】王亮, 陈义勇, 张伟丰, 丁慧玲, 许丹丹, 买吾拉江
【申请人】新疆大学, 王亮
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月10日