专利名称：新型调节性t细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原特异性免疫、及其形成和调节的领域。
背景技术：
免疫系统是ー种必须调节本身以避免不充分免疫、抑制过度应答以及防止自身反应性应答的維持体内平衡的组织。这种有限的调控是通过ー组鉴定为调节性T细胞的T淋巴细胞部分地介导的。支持存在多于ー个涉及外周耐受保持的调节性T细胞种群的证据逐渐积累。这些不同的调节性种群以不同方式起作用并且一部分是天然产生的，而其他是 局部地由于免疫应答诱导的。尽管大量研究报道了在正常小鼠和人类的外周淋巴组织中，总淋巴细胞的1-5%是a ^ -TCR+DN T细胞，并且MRL/Mpj-lpr/lpr小鼠中的a ^ -TCR+DNT细胞的年龄相关积累，具有突变Fas基因和大量淋巴结病，外周DNT细胞的起源仍然不清楚。由不同DN T细胞表达的标记物中的异质性表明，可能存在多种突变/分化路径。在鼠类模型中，多种研究已经证实，DNa 0 TCR+T细胞可以直接来源于⑶8+T细胞。其他研究表明DNa PTCR+细胞来源于胸腺外器官，如骨髄。由于调节性T细胞在保持外周耐受中起作重要作用，因此对于调节性T细胞的转移的治疗潜カ对于在自身免疫疾病和移植中的应用也很有意义。然而，将调节性T细胞种群用作用于治疗免疫调节紊乱的潜在的以细胞为基础疗法的当前技术由于缺少精确细胞标记物、缺少抗原特异性、以及缺少调节性细胞的可行的来源而仅具有有限的成功。需要调节性T细胞的分离、体外回输(ex vivo)鉴定和扩增的方法以改善目前用于治疗免疫调节紊乱的以细胞为基础的治疗方案。
发明内容
本发明的特征在于是ー种用于分化调节性T细胞的独特路径，所述细胞具有CD4—、⑶8'⑶3+的表型(双阴性T细胞，DN T细胞)并且表达标记物⑶44+、⑶69+、或⑶28+中的
至少ー种。本发明的特征还在于是ー种获得具有⑶4_、⑶8_表型的调节性T细胞的方法，所述方法包括从样品分离⑶4+、⑶8_细胞；将抗原和IL-2、或IL-15中的至少ー种与所述⑶4+、⑶8_细胞一起培养；分离所述⑶4_、⑶8_细胞；其中所述分离的⑶4_、⑶8_细胞具有在对象体内抑制对所述抗原的抗原特异性免疫应答的特性。分离的CD4+、CD8—前体细胞可以具有⑶25+或⑶25_表型，并且来自任一前体的转化的⑶4_、⑶8_细胞是Foxp3_。在另ー优选实施方式中，所述DN调节性T细胞由于CD4基因沉默而获得CD4—表型。本发明的另ー特征在于，所述调节性T细胞还表达标记物⑶3+、⑶25+、TCRP +中的至少ー种，但不表达NKl. 1_，并且是Foxp3_。优选地，所述调节性T细胞还表达低水平的IL-2、IL-4、IFN- y、CTLA-4、TGF- ^，以及高水平的穿孔素和颗粒酶B。在本发明的另一实施方式中，所述CD4_、CD8—细胞抑制抗原特异性应答T细胞的增殖、或活化中的至少一种。这包括这样一种实施方式，其中所述调节性细胞在抑制初始⑶4+、⑶25_应答T细胞的抗原特异性增殖方面比在抑制初始⑶4+、⑶25_应答T细胞的抗原非特异性增殖上更有效。在本发明的另一实施方式中，当利用抗原攻击时，所述调节性T细胞是应答不足的，并且应答可以通过IL-2、或IL-15中的至少一种恢复。本发明的特征还在于是一种用于获得表达以下标记物⑶3+、TCRP +、⑶44+、⑶69+、或⑶28+中的至少一种、并且表达蛋白质穿孔素和颗粒酶B的⑶4_、⑶8_调节性T细胞的方 法。本发明的特征还在于是一种通过至少4轮抗原刺激的增殖获得⑶4_、⑶8_调节性T细胞的方法。所述CD4_、CD8—调节性T细胞抑制抗原特异性应答T细胞的增殖或活化中的至少一种。该应答T细胞可以是⑶4+、⑶25'或⑶8+。本发明的另一特征是包括获得一种抗原特异性的⑶4_、⑶8_调节性T细胞，其中所述抗原是自身抗原、同种异型抗原或异种抗原(anto-, alio-, or xenoantigen)。优选地，这种抗原出现在CD3_成熟的骨髓树突状细胞、B细胞或其他抗原呈递细胞上。本发明的特征还在于是一种分离所述⑶4_、⑶8_调节性T细胞的方法，其通过选择表达细胞表面标记物CD3而不表达细胞表面标记物CD4的所述细胞。如果需要,分离所述CD4_、CD8_调节性T细胞的方法是利用富集柱、或细胞分选中的至少一种完成的。在本发明的另一优选实施方式中，所述分离的⑶4_、⑶8_调节性T细胞是通过IL-2、或IL-15中的至少一种扩增的。本发明的特征还在于是一种抑制在对其有需要的对象内的抗原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述CD4_、CD8—调节性T细胞。本发明的特征还在于是一种治疗在对其有需要的对象内的抗原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述CD4_、CD8—调节性T细胞。本发明的特征还在于是一种调节在对其有需要的对象内的抗原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述CD4_、CD8—调节性T细胞。在前述抑制、治疗或调节抗原特异性应答的方面中，所述抗原特异性免疫应答可以是移植排斥、自身免疫紊乱、移植物抗宿主病(GVHD)、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应原的应答。所述抑制、治疗或调节的方法包括在对其有需要的患者体内加强初始或激活应答T细胞的激活诱导细胞死亡(AICD)。所述应答T细胞可以是CD4+、⑶25_或⑶8+。优选地，所述Al⑶的方法是通过所述应答细胞的凋亡，其中所述Al⑶部分地依赖于穿孔素或颗粒酶B。
图IA是由同种异型基因(allogeneic)成熟DC和细胞因子诱导的CFSE标记的T细胞增殖的直方图。来自C57BL/6小鼠的⑶4+CD25_(Teff)和⑶4+CD25+(Treg)细胞利用成熟DBA/2DC+rIL-2或rIL-15刺激5天。CD3+T细胞被门控(gated)并进行CFSE分析。图IB是证实来自C57BL/6CD4+T细胞的CD4—细胞经过成熟DBA/2DC刺激的转化的示意图。画轮廓区域旁的数值表示指定门(designated gate)中的细胞百分数。图IC是表明CD4_细胞仅在多个由同种异型基因成熟DC诱导的细胞增殖周期之后出现的示意图。图ID是证实在支持同种异型抗原(alIoantigen)刺激⑶4+T细胞增殖的相当的浓度下，rIL-2和rIL-15发挥类似的效力以增强⑶4+转化成⑶4—T细胞的直方图和示意图。图2A是证实来自C57BL/6 (⑶45. I)⑶4+T细胞的⑶4_细胞经由丝裂霉素C处理的DBA/2同种异型基因APC刺激的体外转化的示意图。图2B是证实转化自C57BL/6 (⑶45. I)⑶4+T细胞的⑶4_细胞经由同基因(syngeneic)成熟DC刺激的体外转化的示意图。图2C是证实来自⑶4+前体的⑶4_细胞的体内转化和维持的示意图。CFSE标记的同种异型基因C57BL/6 (CD45. 1)CD4+T细胞通过静脉注射转移到B6D2F1小鼠。流式细胞 术是在第3天从B6D2F1小鼠的脾和淋巴结富集而来的C57BL/6(⑶45. I)⑶4+T细胞转化的CD4_细胞。图2D是证实从⑶4+前体细胞向⑶4_细胞的体内转化和保持的示意图。CFSE标记的C57BL/6(⑶45. I)⑶4+T细胞通过静脉注射转移到同基因Rag KO小鼠。流式细胞术是在第7天从同基因Rag KO小鼠的脾和淋巴结的C57BL/6 (⑶45. I)⑶4+T细胞转化的⑶4_细胞。图3A示出了利用抗体转化的CD4_T细胞的染色以表明细胞表面标记物的直方图。图3B是证实在不同细胞种群上通过实时PCR的⑶4和⑶8基因的相对表达的示意图。这里示出的结果代表三个独立实验。图3C是证实大多数DN T细胞是膜联蛋fiV_的直方图和示意图，尽管激活的⑶4+T细胞的大多数是膜联蛋白V+。图3D是证实转化的⑶4_细胞表达独特的表达谱的示意图。来自Foxp3-GFP敲入(knockin) C57BL/6 小鼠的 CD4+CD25-(Teff)和 CD4+CD25+(Treg)细胞单独利用成熟 DBA/2DC或加上rIL-15刺激6天。DN T细胞是GFP_(Foxp3_)。图3E是示出了在不同细胞种群上通过实时PCR确定的指定基因的相对表达的示意图。这里示出的结果代表4个独立实验。*TeffDN :从 CD4+CD25T1 细胞转化的 DN T 细胞。**Treg DN :从 CD4+CD25+T regs 转化的 DN T 细胞。图4A是示出了分离自通过DBA/2成熟DC加上IL-15刺激，并通过成熟DBA/2DC加上指定细胞因子再刺激4天的初级MLR的DN T细胞和CD4+细胞的活化的示意图。增殖通过氚化胸苷([3H]TdR)并入确定并以三个独立实验的平均值示出。图4B是证实在有或没有IL-2或IL-15的情况下在用成熟DC再刺激之后4天，DNT细胞保持DN表型的示意图。图4C是证实通过成熟DBA/2DC诱导的C57BL/6DN T细胞潜在地抑制由相同同种异型抗原(成熟DBA/2DC)引起的CFSE标记的C57BL/6(45. I) Teff增殖的直方图。图4D是证实通过成熟DBA/2DC诱导的C57BL/6DN T细胞以较低效力抑制由第三方同种异型抗原(成熟C3H DC)触发的CFSE标记的C57BL/6(CD45. I) Teff增殖的直方图。图5A是证实通过成熟DBA/2DC刺激的C57BL/6Teff的膜联蛋白V染色的直方图。C57BL/6DN T细胞极大地增加在增殖C57BL/6Teff中的膜联蛋白V+种群。图5B是证实穿孔素在抑制抗原特异性应答中的作用的直方图。CFSE标记的C57BL/6 (CD45. l)Teff细胞通过成熟DBA/2DC刺激。比较了从野生型和穿孔素敲除小鼠转化的C57BL/6DN T细胞的抑制作用。这里示出的结果代表三个独立实验。图5C是示出了 Teff细胞增殖的DN T细胞介导的抑制在没有穿孔素的情况下被减弱的示意图。这里示出的结果是三个独立实验的平均值。图是示出了 Teff细胞增殖的穿孔素介导的抑制可能是该Teff细胞的凋亡的示意图。通过成熟DBA/2DC刺激C57BL/6Teff的膜联蛋白V染色。从野生型而不是穿孔素KO小鼠转化的DN T细胞极大地增加了在增殖C57BL/6Teff中的膜联蛋白V+种群。图5E是通过颗粒酶B封闭减弱DN T细胞介导的对Teff增殖的抑制的示意图。这里示出的结果是三个独立实验的平均值。 图5F是通过成熟DBA/2DC刺激的CFSE标记的B6Teff细胞的示意图。B6DN T细胞的抑制作用在颗粒酶B或对照抗体存在下进行测试。图6A是示出了 DN T细胞以同种异型抗原特异性方式抑制初始T效应子刺激的皮肤同种异体移植物排斥的示意图。移植到C57BL/6RAG (-/-)小鼠的来自DBA/2或C3H小鼠的皮肤移植物的排斥由初始C57BL/6Teff细胞的过继转移(adoptive transfer)所诱导。C57BL/6DN T细胞的共转移(共过继，co-transfer)在接受DBA/2移植物的小鼠中更有效地抑制排斥。利用Logrank试验实施统计分析。图6B是示出了 DN T细胞以同种异型抗原特异性方式显著地延长免疫竞争性受体中的MHC错配岛同种异体移植物存活的示意图。给予13xl06DN T细胞显著延长同种异型抗原特异性DBA/2(但不是第三方C3H)胰岛(islet)同种异体移植物(allograft)存活。利用Logrank检验(Logrank test)实施统计分析。图7A是示出了 DN T细胞防止N0D/SCID小鼠免受由致糖尿病T细胞诱导的自身免疫糖尿病的示意图。N0D/SCID小鼠的糖尿病由来自糖尿病NOD小鼠的T细胞诱导。NODDN T细胞的共注射显著地防止该小鼠免患糖尿病。利用Logrank检验实施统计分析。图7B是示出了胰岛GAD65抗原特异性DN T细胞比抗原非特异性DN T细胞在新发作糖尿病NOD小鼠中阻断自身免疫糖尿病更有效的示意图。新发作糖尿病NOD小鼠利用GAD65特异性或非特异性DN T细胞进行转化。利用Logrank检测实施统计分析。图8是一个模型，其证实了在CD4+T细胞的初始抗原诱导激活期间发生的内在体内平衡机制控制免疫应答的程度和种类，包括Th1、Th2、Th17效应子以及⑶4+⑶25+FOXp3+、Trl和CD4+转化的DN调节性细胞的出现。ThI和TH2T细胞亚组的二分法、Treg和TH17效应子的相互分化、以及随后活化诱导的细胞死亡说明内在体内平衡机制如何控制对感染有机体和组织炎症的免疫应答的程度和种类。分化之前未鉴定的DN调节性T细胞的新路径代表调节免疫应答程度的负反馈机制。
具体实施例方式不同的T细胞调节性种群以不同方式起作用，并且一部分是天然产生的，而其他是由于免疫应答而局部诱导的。通过监控在CD4+T细胞增殖和分化期间的CD4表达，我们鉴定了一种用于分化双负(DN)调节性T细胞亚组的新路径。本发明描述一种分离的调节性T细胞，所述细胞具有独特的表型⑶4_、⑶8_，并且表达标记物⑶44+、⑶69+或⑶28+中的至少一种，但不表达NKl. I。在本发明的一个优选实施方式中，⑶4_、⑶8_调节性T细胞是Foxp3 。本发明进一步描述了表达不同于之前鉴定的调节性T细胞的一组独特的表面标记物和基因谱的⑶4_、⑶8_调节性T细胞。优选地，所述⑶4_、⑶8_调节性T细胞还表达低水平的IL-2、IL-4、IFN- y、CTLA-4、TGF- ^，以及高水平的穿孔素和颗粒酶B。在本发明的一个优选实施方式中，所述⑶4_、⑶8_调节性T细胞在抑制初始⑶4+、⑶25_T细胞的抗原特异性增殖上比所述细胞在抑制初始和活化⑶4+、⑶25+上更有效。本发明进一步描述了一种用于获得具有表型CD4_、CD8—的调节性T细胞的方法，所述方法包括从样品分离⑶4+、⑶8_细胞；用抗原和细胞因子IL-2、或IL-15中的至少一种培养所述⑶4+、⑶8_细胞；以及分离转化的⑶4_、⑶8_调节性T细胞。期望地，所述⑶4_、⑶8_调节性T细胞表达以下标记物⑶3+、TCRP+、⑶44+、⑶69+、或⑶28+中的至少一种，但不表达NKl. I。更加期望地，所述⑶4_、⑶8_调节性T细胞是Foxp3_。转化的⑶4_、⑶8_调节性T细胞具有 抑制对象体内对所述抗原的抗原特异性免疫应答。分离所述CD4_、CD8—调节性T细胞是通过选择表达细胞表面标记物CD3、并且缺少细胞表面标记物CD4的所述细胞。在本发明该实施方式的一个优选实施方式中，所述分离是利用富集柱、或细胞分选中的至少一种完成的。本发明还描述了一种方法，其中所述⑶4_、⑶8_调节性T细胞是在细胞因子IL-2、或IL-15中的至少一种存在下，通过至少4轮的抗原刺激获得的。在本发明的一个优选实施方式中，所述CD4_、CD8—调节性T细胞能够抑制抗原特异性应答T细胞的增殖、或活化中的至少一种。经历抑制的应答T细胞种群可以表达⑶4+、⑶25_或⑶4+、⑶25+表型。经历抑制的应答T细胞种群也可以是⑶8+。在所述⑶4_、⑶8_调节性T细胞的产生过程中使用的抗原可以是自身抗原、同种异型抗原或异种抗原。所述抗原的来源可以来自CD3—成熟骨髓树突状细胞或抗原呈递细胞。本发明还描述了一种方法，其中转化的⑶4_、⑶8_T细胞上的细胞表面⑶4分子的消失是CD4基因沉默的结果。在本发明的一个优选实施方式中，CD4_、CD8_调节性T细胞是从⑶4+⑶25—T细胞转化来的。在本发明的另一个优选实施方式中，⑶4_、⑶8_调节性T细胞是从CD4+CD25+T细胞转化来的。在本发明一个进一步优选实施方式中，所述转化的CD4—、⑶8_调节性T细胞是通过细胞因子IL-2、或IL-15中的至少一种扩增的。本发明的特征还在于是一种用于抑制、治疗或调节对其有需要的对象体内的抗原特异性免疫应答，其中所述方法包括给予所述分离的CD4_、CD8—调节性T细胞。在一个优选实施方式中，抗原特异性免疫应答可以包括移植物排斥、自身免疫紊乱、移植物抗宿主病(GVHD)、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应原的应答。在本发明的另一个实施方式中，抗原特异性免疫应答的所述抑制、治疗或调节是通过加强(augment)初始或激活应答T细胞的活化诱导的细胞死亡(AICD)。所述应答T细胞优选地具有⑶4+、⑶25_或⑶4+、⑶25+、或⑶8+表型，并且所述Al⑶是通过所述应答的凋亡。优选地，所述应答T细胞的Al⑶诱导的凋亡部分地依赖于穿孔素。在另一个实施方式中，所述应答T细胞的AICD诱导凋亡部分地依赖于颗粒酶B。实施例以下实施例用于举例描述本发明。它们不用于以任何方式限制本发明。
实施例I :外周⑶4+T细胞转化成⑶4_细胞成熟骨髓来源的树突状细胞(BM DC)已经显示出触发同种异型基因⑶4+⑶25+T调节性细胞(Treg)的体外剧烈增殖的能力。在一个研究T细胞生长因子(TCGF)对⑶4+CD25+Treg和⑶4+⑶25_T细胞的体外激活和增殖的作用的工作中，我们在混合淋巴细胞反应(MLR)中，在有或没有TCGF的情况下采用了 LPS成熟同种异型基因BM DC。荧光CFSE标记的C57BL/6⑶4+CD25+和⑶4+CD25_T细胞用在6天MLR中剧烈增殖的成熟同种异型基因DC进行共培养，并且rIL-2、或rIL-15的加入进一步增强该增殖(图1A)。有趣地，我们发现，大比例的增殖细胞是⑶4阴性的。⑶4阴性细胞的百分比在19. 3% (当⑶4+⑶25+T细胞用成熟DC培养时)至84. 3% (当⑶4+⑶25—T细胞利用成熟DC+rIL_15培养时)的范围(图 1B)。为了检查这些⑶4_细胞的来源，高度纯化的⑶4+CD25_T细胞(> 99% )利用成熟 DC+rIL-15培养。⑶4_细胞在MLR的第1、2和3天没有检测到，表明⑶4_细胞不是来自培养物的可能污染物。在MLR的第4天出现的CD4—伴随强大的细胞增殖，表明CD4—细胞是从增殖的⑶4+T细胞转化的。增殖的T细胞的CFSE荧光强度表明⑶4+⑶25_T细胞向⑶4_细胞的转化仅在4-5轮的同种异型抗原触发的CD4+T细胞增殖之后发生(图1C)。为了定量地评价rIL-2和rIL-15对⑶4+T细胞向⑶4_细胞的转化的影响，我们在MLR中逐步滴加rIL-2和rIL_15的剂量。注意到在⑶4+⑶25+与⑶4+⑶25飞细胞的rIL_2和rIL-15同种异型抗原触发的增殖之间的增强效力的显著不同(图1D)。然而，我们通过近似85%分开的⑶4+CD25_或⑶4+⑶25+T细胞检测，发现在支持同种异型抗原触发的⑶4+CD25_或⑶4+⑶25+T细胞增殖方面相当的浓度。在门控的种群中，rIL-2和rIL_15发挥类似的效果以增强近似70%的⑶4+⑶25_或20%的⑶4+CD25+T细胞向⑶4_细胞转化。通过使用丝裂霉素C处理的DBA/2同种异型基因APC或同基因成熟DC，我们进一步检查了 MLR中⑶4+T细胞向⑶4_T细胞的体外转化。来自初始同源异基因(congenic)CD45. 1C57BL/6小鼠的脾和淋巴结的CFSE标记的CD4+CD25-和CD4+CD25+T细胞，在利用丝裂霉素C处理的DBA/2同种异型基因APC (图2A)或同基因成熟DC (图2B)刺激6天后在体外都可以被转化成⑶4_细胞。在培养基中加入rIL-2或rIL-15显著增强所述转化(图2A)。此外，为了跟踪在同种异型抗原触发或体内平衡增殖期间的体内CD4表达，我们过继地将来自同源异基因⑶45. I初始(naive) C57BL/6小鼠的CFSE标记的高度纯化⑶4+T细胞(> 99% )转移到同种异型基因B6D2F1或同基因免疫缺陷型Rag KO小鼠。如图2C所示，同源异基因⑶45. 1+⑶4+T细胞在过继转移后3天在同种异型基因B6D2F1宿主中经历强烈的增殖。在4-5轮的增殖之后，获自B6D2F1宿主的淋巴结和脾的5. 87%和6. 87%的⑶45. 1+CD4+T细胞分别转化成⑶4_T细胞(图2C)。在过继转移后7天，获自同基因Rag KO宿主的CD45. 1+CD4+T细胞的体内平衡增殖和转化的类似图形在图2D中示出。实施例2 :转化的⑶4_细胞具有独特表型和基因表达谱为了表征转化的⑶4_细胞，我们检查了细胞表面标记物的表达。转化的⑶4_细胞表达一组独特的细胞表面标记物，如图3A所示。⑶4_T细胞是⑶4_、⑶8_、⑶3+、TCR 3 +、NKl. I' CD44+、CD25+、CD69+、CD28+。由于转化的CDf细胞是CD8-和CD3+，所以我们将它们命名为CD4+转化的双阴性(DN)T细胞。为了确定细胞表面上CD4表达消失的机制，我们通过利用实时PCR分析了转化的⑶4—T细胞的⑶4基因表达。如图3B所示，⑶4基因在⑶4+T细胞中高度表达。相反，在转化的⑶4—T细胞中没有可检测到的⑶4基因表达。另外，⑶8基因在⑶8+T细胞中高度表达，但在⑶4+和转化的DN T细胞中不表达。因此，⑶4基因在转化的DN T细胞中是沉默的。之前的研究报道了，激活诱导的细胞死亡(AICD)是在个别(discrete)数量的T细胞分化之后出现的T细胞激活和凋亡事件的常规结果。我们考察了增生CD4+和DN T细胞亚组之间的凋亡事件。在体外MLR 5天之后在增生的⑶4+T细胞中有54%的膜联蛋白V+染色的T细胞(图3C)。令人吃惊地，在转化的DN T细胞中仅有6. 12%的膜联蛋白V+染色阳性细胞，即使它们已经经过了 4-8轮的细胞分化(图3C)，表明转化的DN T细胞耐受AICD。分支家族(forkhead family)转录因子Foxp3充当Treg细胞种系特化因子(specification factor),并由此独立于0)25表达而鉴定Treg细胞。利用之前描述的基因革巴向方法，Foxp3gfp敲入小鼠传代,其中双顺反子(bicistronic)EGFP报告子被引入到内源性 Foxp3 座位(Bettelli et al.，Nature 441 (7090) :235-8 (2006))。通过利用来自 Foxp3gfp 敲入 C57BL/6 小鼠的 CD4+CD25_Foxp3gfp+ 和 CD4+CD25+Foxp3gfp_T 细胞，我们发现当它们转换到DN T细胞时，⑶4+⑶25_FoXp3gfp+T细胞丧失它们的Foxp3gfp表达，并且当它们转换到DN T细胞时CD4+CD25+Foxp3gfp-T细胞保持Foxp3gfp阴性(图3D)。总之，来自CD4+CD25-和⑶4+CD25+起源的转化DN T细胞是Foxp3阴性的。利用定量实时PCR技术来分析转化的DN T细胞的基因表达谱。如图3D所示，从⑶4+CD25_和⑶4+⑶25+T细胞转化的DN T细胞不表达Foxp3，并且在低水平上表达其他Treg相关的CTLA-4和TGFP基因(图3E)。由活化的⑶4+T细胞以高水平表达IL-2、IL-4和IFNy基因，由DN T细胞在低水平上表达。有趣地，DN T细胞表达高水平的细胞毒性淋巴细胞相关基因穿孔素和颗粒酶B。因此，从⑶4+CD25—或⑶4+⑶25+T细胞转化的DN T细胞共有不同于初始⑶4+CD25_、初始⑶4+CD25+Treg、以及激活的⑶4+T细胞的类似基因表达谱。实施例3 :转化的DN T细胞是调节性T细胞为了分析⑶4+转化的DN T细胞的功能特性，我们通过细胞分选从初步MLR分离了 CD4+和DN T细胞。在利用如在初步MLR中使用的成熟DC(DBA/2)的相同类的再刺激之后，C57BL/6CD4+T细胞剧烈增生，并且rIL_2、rIL_4或rIL_15的加入进一步增强增生(图4A)。相反,DN T细胞当通过成熟DC再刺激时是应答不足(hyporesponsive)的。有趣地，rIL-2或rIL-15能、但rIL-4不能、完全恢复DN T细胞的应答性(图4A)。此外，DN T细胞在利用成熟DC再刺激之后保持稳定的表型，即使在通过利用成熟DC+IL-2或IL-15再刺激的强烈增生之后(图4B)。我们进一步分析了 DN T细胞对同种异型抗原触发的初始⑶4+CD25_T细胞增生的影响。如图4C所示，CFSE标记的初始同源异基因CD45. 1C57BL/6CD4+CD25—T细胞在利用同种异型基因DBA/2或C3H来源的成熟DC的MLR 5天期间经历剧烈增殖(图4C和图4D)。在利用DBA/2成熟DC的初步MLR中，当在以I : I比率具有T效应子的DN T细胞的混合物中共培养时，从初始C57BL/6⑶4+CD25_和⑶4+⑶25+T细胞转化的DN T细胞发挥原始⑶4+⑶25_T效应子的相同同种异型抗原触发的增生的强抑制。有趣地，rIL-2和rIL-15加入原代培养物中(其显著增强⑶4+向DN T细胞的转化)对DN T细胞抑制次级(secondary)MLR中的同种异型抗原触发的初始CD4+CD25_T细胞增殖的效力的有害影响(图4C)。此外，DN T细胞抑制的效力趋于是同种异型抗原特异性的。如图4D所示，由DBA/2同种异型抗原刺激诱导的DN T细胞以较低效力抑制次级MLR中的C3H同种异型抗原初始的初始T效应子增殖。当T效应子利用DN T细胞以I : 0. 25比率(100，000T效应子25，000DN T细胞，图4D)共培养时，效力的差异是更显著(profound)的。激活诱导的细胞死亡(Al⑶)是控制免疫应答程度的一种重要内在机制。通过分析在有或没有DN T细胞的情况下利用成熟DC共培养增殖的CD4+T细胞中的凋亡事件，我们寻求确定DN T细胞对增殖⑶4+T细胞的Al⑶的影响。如图5A所示，当⑶4+⑶25_T细胞仅用成熟同种异型基因DC共培养时，在增殖的CD4+T细胞中有24. 8%的膜联蛋白V+细胞。相反，当⑶4+⑶25_T细胞用以I : I比率(T效应子DN T细胞)的成熟同种异型基因DC+DNT细胞共培养时，在增殖的⑶4+T细胞中有75. 7%的膜联蛋白V+细胞。因此，DN T细胞增大成熟DC刺激的MLR中的增殖⑶4+T细胞的细胞死亡。穿孔素(一种细胞毒性淋巴细胞相关的细胞因子)由DN T细胞高度表达(图3D)。为了研究DN T细胞抑制CD4+CD25_增殖的机制，我们考察了穿孔素在DN T细胞介导的抑制中的作用。我们比较了从野生型C57BL/6小鼠转化的DN T细胞的抑制作用和来自穿孔素 基因敲除C57BL/6小鼠的DN T细胞的抑制作用。来源于穿孔素KO小鼠的DN T细胞抑制成熟DC刺激的初始⑶4+⑶25_T效应子增殖的效力显著低于野生型小鼠(图5B和5C)。当T效应子以I : I的比率与DNT细胞共培养时，抑制速率从71.6%降低至29. 2%，当T效应子以I : 0.25的比率与DNT细胞共培养时，抑制速率从55. 3%降低至13. 3%，(图5C)。图证实了在共培养物中，来源于穿孔素KO小鼠而不是来源于野生型小鼠的DN T细胞不增加活化T效应子中的膜联蛋白V+细胞，表明穿孔素在DN T细胞介导的细胞死亡和抑制中至少部分地起作用。我们进一步证实了颗粒酶B在DN T细胞介导的抑制中起作用。通过特异性抗体对颗粒酶B的封闭减少了活化T效应子中的膜联蛋白V+细胞(图5E)，其表示为活化T效应子抑制的百分数降低(图5F)。实施例4 :转化的DN调节性T细胞能够抑制体内同种免疫应答为了进一步测试转化DN T细胞的体内功能潜力，我们利用了之前描述的皮肤同种异体移植物的过继转移模型(Sanchez-Fueyo et al.，J Immunol. 168 :2274-2281 (2002))。在有或没有100，000DN T细胞的情况下，C57BL/6 (H-2b) RAG (-/-)受体接受100，000初始C57BL/6效应子T细胞，其中的DN T细胞是从通过在MLR中利用成熟DBA(H_2d)DC+rIL-15共培养6天的初始C57BL/6小鼠的⑶4+CD25—T细胞转化的。同种异型抗原特异性DBA/2或对照第三方株C3H(H-2k)尾部皮肤移植物在随后几天置入。如图6A所示，100，000初始C57BL/6⑶4+CD25_T细胞的过继转移能够以分别20天和10天的平均移植物存活时间触发DBA/2或C3H皮肤同种异体移植物的急性排斥。相反，相同数量的转化C57BL/6DN T细胞的过继转移不会刺激DBA/2或C3H皮肤同种异体移植物的排斥，表明DN T细胞在同种异型抗原再刺激后是无反应性的。然而，当从用DBA/2成熟DC+IL-15的MLR 6天后的初始C57BL/6CD4+CD25_T细胞转化的相等数量的初始C57BL/6CD4+CD25_和DN T细胞共转移时，DBA/2皮肤同种异体移植物(allograft)的明显延长出现(图6A，p = 0. 0067)。相反，DNT细胞的共转移不会防止第三方株C3H皮肤同种异体移植物的急性排斥(图6A)。因此，DNT细胞能够以同种异型抗原特异性方式抑制体内初始Cd4+CD25_T细胞触发的皮肤同种异体移植物排斥。
基于发现DN T细胞在皮肤同种异体移植物的体内过继T细胞转移模型中的同种异型特异性抑制作用，我们努力确定作为单一疗法给予相对少量的DN T细胞是否对免疫竞争性MHC完全错配的移植模型中的移植物存活具有任何作用。我们选择胰岛移植模型，其中将13xl06从用成熟DBA/2 (H-2d) DC+rIL-15在MLR中共培养6天的初始C57BL/6小鼠的CD4+CD25—T细胞转化来的DN T细胞，在胰岛细胞移植时转移到链脲霉素诱导的糖尿病C57BL/6受体中。如图6B所示，相比于未处理的对照组(P = 0. 005)，13x106DN T细胞的转移导致同种异型抗原特异性DBA/2株(但不是第三方C3H株)胰岛的同种异体移植物存活的统计学显著性延长。这证实在MHC错配胰岛同种异体移植模型中，离体回输(ex vivo)的CD4+T细胞转化的同种异型抗原特异性DN调节性T细胞被用作防止同种异体移植排斥的免疫调节疗法。我们进一步证实，DN调节性T细胞能够防止自身免疫糖尿病的形成。如图7A所示，DN T细胞保护N0D/SCID小鼠免受由来自糖尿病NOD小鼠的致糖尿病T细胞诱导的自身免疫糖尿病。N0D/SCID小鼠的糖尿病是由来自糖尿病NOD小鼠的T细胞诱导的。NOD DN T细胞的共注射显著地保护该小鼠免患糖尿病。此外，我们证实了这是一种抗原特异性保护，因为胰岛GAD65抗原特异性DN T细胞比抗原非特异性DN T细胞在新发作糖尿病NOD小鼠中在阻断自身免疫糖尿病方面更有效力(图7B)。 其他实施方式在本说明书中引述的所有出版物和专利都通过引用结合于本文中，如同每一个单独的出版物或专利特别地和单个地指明通过引用并入一样。尽管上述发明已经通过为了清楚理解的目的举例说明和实施例的方式进行部分详细地描述，但是对于本领域技术人员来说明显的是，依据本发明的教导，可以进行某些改变和变形而不背离所附权利要求的精神或范围。虽然本发明已经结合特定实施方式进行了描述，但是应当理解，本发明能够进一步变形。因此，本申请将覆盖所有依照本发明的原理所作的本发明的任何变形、用途或修饰，包括来自本领域中的已知或常规实践的偏离本披露内容的那些。其他实施方式在所附权利要求中。
权利要求
1.一种分离的调节性T细胞，所述细胞具有⑶4_、⑶8_表型，所述细胞表达⑶44+、⑶69+和⑶28+中的至少一种。
2.根据权利要求I所述的调节性T细胞，其中所述细胞也表达⑶3+、⑶25+和TCRP +中的至少一种。
3.根据权利要求I所述的调节性T细胞，其中所述细胞具有NKl.I—表型。
4.根据权利要求I所述的调节性T细胞，其中所述细胞具有FoXp3_表型。
5.根据权利要求I所述的调节性T细胞，其中所述细胞表达低水平的IL-2、IL-4、IFN- y、CTLA-4和TGF- ^，并且表达高水平的穿孔素和颗粒酶B。
6.根据权利要求I所述的调节性T细胞，其中所述细胞的CD4—表型是CD4基因沉默的结果。
7.根据权利要求I所述的调节性T细胞，其中所述细胞抑制初始CD4+、CD25—T细胞的抗原非特异性增殖比抑制初始CD4+、CD25T细胞的抗原特异性增殖更有效。
8.一种获得⑶4_、⑶8_调节性T细胞的方法，所述方法包括 a)从样品分离⑶4+、⑶8_细胞； b)将所述⑶4+、⑶8_细胞用抗原和IL-2或IL-15中的至少一种培养； c)分离所述CD4_、CD8_； d)其中所述分离的CD4'CDK细胞具有抑制对象体内对所述抗原的抗原特异性免疫应答的特性。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述分离的CD4+、CD8—细胞是CD25+。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述分离的CD4+、CD8—细胞是CD25—。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述分离的⑶4+、⑶K细胞是Foxp3\
12.根据权利要求8所述的方法，其中由所述培养步骤b)得到的所述CD4_、CD8—细胞至少经过4轮的抗原刺激。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述CD4_、CD8_细胞抑制抗原特异性应答T细胞的增殖或活化中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述应答T细胞是⑶4+、⑶25_或⑶4+、⑶25+。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述CD4_、CD8_表达蛋白质穿孔素和颗粒酶B。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述⑶4_、⑶8_细胞表达以下标记物⑶3+、TCR3 +、CD44+、CD69+、或 CD28+ 中的至少一种。
18.根据权利要求8所述的方法，其中所述⑶4_、⑶8_细胞具有NKl.I—表型。
19.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗原是一种自身抗原、同种异型抗原或异种抗原。
20.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗原是出现在CD3—的成熟骨髓树突状细胞或抗原呈递细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是B细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
22.根据权利要求8所述的方法，其中所述CD4_、CD8_细胞的分离通过选择表达细胞表面标记物⑶3和不表达细胞表面标记物⑶4的所述细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述分离是使用富集柱或细胞分选中的至少一种完成的。
24.根据权利要求8所述的方法，其中所述⑶4_、⑶8_细胞是通过IL-2或IL-15中的至少一种扩增的。
25.—种抑制在对其有需要的对象内抗原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予权利要求8所述的⑶4_、⑶8_细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答是移植排斥、自体免疫紊乱、移植物抗宿主病(GVHD)、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应原的应答。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答的抑制是通过加强的活化导致的初始或活化的应答T细胞的细胞死亡(AICD)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述应答T细胞是⑶4+、⑶25_或⑶4+、⑶25+。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述AICD是通过所述应答细胞凋亡。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述AICD是通过部分依赖穿孔素的凋亡。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述AICD是通过部分依赖颗粒酶B的凋亡。
33.一种治疗在对其有需要的对象内抗原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予权利要求8所述的⑶4_、⑶8_细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答是移植排斥、自体免疫紊乱、GVHD、对感染的应答、对肿瘤细胞的应答、以及对变态反应原的应答。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答的治疗是通过加强初始或活化的应答T细胞的AICD。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述应答T细胞是⑶4+、⑶25_或⑶4+、⑶25+。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述AICD是通过所述应答细胞的凋亡。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述AICD是通过部分依赖穿孔素的凋亡。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述AICD是通过部分依赖颗粒酶B的凋亡。
41.一种调节在对其有需要的对象内抗原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予权利要求8所述的⑶4_、⑶8_细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答是移植排斥、自体免疫紊乱、GVHD、对感染的应答、对肿瘤细胞的应答、以及对变态反应原的应答。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答的调节是通过加强初始或活化的应答T细胞的AICD。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述应答T细胞是⑶4+、⑶25_或⑶4+、⑶25+。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述AICD是通过所述应答细胞的凋亡。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述AICD是通过部分依赖穿孔素的凋亡。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述AICD是通过部分依赖颗粒酶B的凋亡。
全文摘要
本发明涉及新型调节性T细胞及其应用。本发明提供一种分离的调节性T细胞，所述细胞具有CD4-、CD8-表型，所述细胞表达CD44+、CD69+和CD28+中的至少一种。本发明提供一种分离的调节性T细胞以及获得调节性T细胞的方法。本发明也提供在需要给予对象分离的调节性T细胞的对象体内抑制抗原特异性免疫应答的方法(即，移植排斥、自体免疫紊乱、移植物抗宿主病、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应原的应答)。本发明也提供了在需要给予对象分离的调节性T细胞的对象体内治疗或调节抗原特异的免疫应答反应。
文档编号A61P37/02GK102766596SQ20121020595
公开日2012年11月7日 申请日期2007年11月28日 优先权日2006年11月29日
发明者张栋, 郑心校 申请人:贝斯以色列护理医疗中心