一种含有唾液酸片段的脂质衍生物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于药物制剂领域，提供了一种含有唾液酸片段的脂质衍生物，其制备方法以及应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。所述的唾液酸片段包含至少1个唾液酸单元，唾液酸单元间通过α-2,8-糖苷键连接，并且脂质片段与唾液酸片段中非还原端唾液酸单元的7号碳通过C-N键连接。其结构通式如下：使用该种化合物修饰或制备的微粒制剂的免疫原性极低，具有优秀的体内药动学性质。其中SA表示唾液酸单元，n表示最小为1的整数；R-HN片段来自R-NH2，R-NH2是含有伯胺基团的化合物。
【专利说明】—种含有唾液酸片段的脂质衍生物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种含有唾液酸片段的脂质衍生物，其制备方法以及应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。
【背景技术】
[0002]在药物传递系统(Drug Delivery System,DDS)的发展历史中，药物分子及载体的聚合物修饰可以增加药物制剂放置稳定性、降低药物分子的体内降解、改变药物的体内药动学行为从而提高药物治疗效率。其中又以载体及药物分子的PEG化(PEGylated，又称为聚乙二醇化)技术最具开发潜力和实用价值。长期以来，世界各国政府都投入大量人财物力，进行诸如PEG化小分子药物、PEG化大分子药物、PEG化脂质体、PEG化纳米粒、PEG化乳剂、PEG化胶束、PEG化树枝状载体和PEG化聚合物等方面的研究；PEG化技术在肿瘤靶向、肝脏靶向、心脏靶向、肾脏靶向、脑靶向、骨靶向、细胞核靶向及线粒体靶向等研究中也得到广泛的应用；各种功能化载体的构建、基因转染、RNA干扰治疗等21世纪热点领域的主攻方向中同样也都有PEG化技术的身影。以“PEGylated”为关键词，在PubMed上检索1990年~2011年的文献，可得到6263篇相关文章，从1990年的I篇增加至2011年的1182篇，其趋势变化如图。PEG化技术所取得的不俗成绩和勃勃生机使科学家们乐观地认为它能够解决DDS所面临的从制剂学领域到生物学领域的一系列问题。
[0003]涉及PEG化技术的研究文献(1990~2011) 诚然，PEG化技术能够 显著降低蛋白多肽类物质的免疫原性，显著延长载体循环时间，并实现药物的靶向治疗，但PEG化药物/载体的免疫学问题从未被科学家所忽视。早在1964年，Khomyakov等就对PEG用于体内给药的安全性提出过质疑(Khomyakov K, VirnikA, Rogovin Z.The prolongation of the action of pharmaceutical preparations bymixing or combining them with polymers[J].Russian Chemical Reviews, 1964,33:462.)，随着研究者对机体免疫系统与DDS间相互作用的不断了解，以及多种PEG化制剂进入临床应用，PEG化技术在药物治疗安全性和有效性方面所显现的问题日趋严重。最近有文报道，约1/3使用PEG化门冬酰氨酶(PEG-Asparaginase,商品名Oncaspar?)的患者出现了免疫反应(Armstrong JK, Hempel G, Koling S，et al.Antibody againstpoly (ethylene glycol) adversely affects PEG - asparaginase therapy in acutelymphoblastic leukemia patients [J].Cancer, 2007, 110 (I): 103-111.) ;PEG 化尿酸酶(Pegloticase,商品名Krystexxa?)则由于抗-PEG抗体的产生导致58%的患者不能得到治疗(Garay R, Labaune J.1mmunogenicity of Polyethylene Glycol (PEG) [J].TheOpen Conference Proceedings Journal, 2011, (2): 104-107.)。此类问题的出现不仅给临床治疗带来巨大风险，同时也导致社会资源的极大浪费。对于PEG化脂质体、PEG化胶束、PEG化纳米粒等PEG化载体而言，同样会在首次注射时诱导机体产生抗体，使得第二次注射的PEG化载体快速从血液中清除，并大量聚集于肝脾,该现象被称为“加速血液清除(Accelerated Blood Clearance,ABC)”(佘振南，翟文君，邓意辉.“加速血液清除”现象中的免疫机制分析[J].沈阳药科大学学报，2011，28(9): 760-768.)。本课题组的研究表明，PEG化乳剂和PEG化固体脂质纳米粒的重复注射均可导致小鼠、大鼠和比格犬产生强烈的ABC现象(国家自然科学基金资助项目N0.81072602)，其中比格犬在出现ABC现象时往往伴随有严重的类似过敏的反应，如呕吐、腹泻、面部严重水肿等，部分比格犬甚至因此死亡。我们的研究还证明，在低剂量注射时，PEG化阿霉素脂质体、PEG化表阿霉素脂质体和PEG化拓扑替康脂质体均会导致强烈的ABC现象，这给PEG化制剂的连续低剂量注射治疗方案敲响了警钟。ABC现象的产生不仅导致各种PEG化载体的治疗价值极大降低，甚至由于强烈的免疫反应而引起用药对象死亡(Semple SC, Harasym TO, Clow KA, et al.1mmunogenicity and rapid blood clearance of liposomes containing polyethyleneglycol-lipid conjugates and nucleic acid[J].Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics, 2005, 312 (3): 1020.)。另外，PEG 在体内难以降解，会在溶酶体内蓄积并导致毒性反应，少量PEG在体内氧化后产生的过氧化物及副产物亦对人体有害(Caliceti P， Veronese FM.Pharmacokinetic and biodistribution properties ofpoly (ethylene glycol)-protein conjugates[J].Advanced drug delivery reviews,2003, 55(10): 1261-1277.)。当患者大剂量使用PEG化制剂时，如正在研究的血红蛋白脂质体(人造血液，含有DSPE-PEG2_)，这类问题可能带来极为严重的后果。相似的现象还可以在Poloxamine-908包衣的聚苯乙烯纳米球重复注射时观察到(Moghimi SM，GrayT.A single dose of intravenously injected poloxamine-coated long-circulatingparticles triggers macrophage clearance of subsequent doses in rats[J].ClinScij 1997,93(4): 371-379.)。
[0004]此外，除了抗原抗体介导的免疫反应外，聚合物修饰制剂(如Doxif，用于静脉注射给药，含有由FDA批准的可用于静脉注射的PEG)或是含有人工合成聚合物的制剂(如Zoladex?，含有PLGA)在临床应用中还具有发生类过敏反应(pseudoallergy)的风险(Hunter, A.C.and S.M.Moghimi (2002)."Therapeutic synthetic polymers: agame of Russian roulette?" Drug discovery today 7(19): 998-1001.ABPI (1999)Compendium of data sheets and summaries of product characteristics.Pub.Datapharm Publications ISBN 0-907-1 02182-1821)。其中与补体激活相关的类过敏反应(complement activation-related pseudoallergy, CARPA)在美国每年导致约 420000例临床显著的过敏反应及约20400例由过敏性休克产生的死亡(Szebeni，J.(2001)Complement activation-related pseudoallergy caused by liposomes, micelIarcarriers of intravenous drugs, and radiocontrast agents.Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Syst.18，567 - 606)。
[0005]DDS与免疫系统间所产生的强烈相互作用会严重影响药物治疗的安全性、有效性和患者的顺应性。虽然可以通过调整PEG衍生物的修饰密度、改变PEG衍生物种类，或者釆用可断裂PEG脂质化合物等方法来减弱ABC现象(佘振南，翟文君，邓意辉.“加速血液清除”现象中的免疫机制分析[J].沈阳药科大学学报，2011，28(9): 760-768.)，但从长远发展来看，在DDS的设计和开发过程中，避免使用对人体具有潜在免疫原性(或非人源性)的材料将会成为主流，以PEG为代表的具有免疫原性和蓄积毒性的材料的应用将会逐渐受到限制。因此，探索一种新的“免疫伪装”技术，以帮助进入体内的药物对免疫系统“隐形”，成为DDS设计和开发过程中亟待解决的关键问题。
[0006]唾液酸(Sialic acid, SA)又称糖酸，是一类九碳单糖，作为生物杂聚物的重要组成部分，SA主要以短链残基的形式通过2-位异头碳的羟基以α-糖苷键连接于糖蛋白、糖脂和寡糖的末端。聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是SA单体以α-2，8_或α_2，9_酮苷键等方式连接而成的直链聚合物。将PSA进行酶解，或是对天然来源的PSA进行分离，可以得到各种聚合度的PSA。SA普遍存在于哺乳动物的细胞膜表面，如人红细胞及血管内皮细胞表面均是高度唾液酸化的。研究表明，红细胞经唾液酸酶处理后其寿命从原来的120天锐减至丨J几个小时(Deninno MP.The Synthesis and Glycosidation of-AcetylneuraminicAcid[J], Synthesis, 1991, 1991(8): 583-593.)。另外，许多病原体利用 SA“装扮”自身,以掩蔽其抗原表位，抑制补体旁路途径的激活，降低了免疫原性，从而成功逃脱宿主免疫系统的攻击(Char land N, Kobisch M, Martineau - Doize B, et al.Role of capsularsialic acid in virulence and resistance to phagocytosis of Streptococcussuis capsular type 2[J].FEMS Immunology & Medical Microbiology, 1996,14(4):195-203.Madico G， Ngampasutadol J， Gulati S， et al.Factor H binding andfunction in sialylated pathogenic neisseriae is influenced by gonococcal, butnot meningococcal, porin[J].The Journal of Immunology, 2007,178 (7): 4489.X月中瘤的转移也与SA/PSA的“免疫伪装”作用有关(Suzuki Mj Nakayama Jj Suzuki A，et al.Polysialic acid facilitates tumor invasion by glioma cells [J].Glycobiologyj2005，15(9): 887.)D
[0007]作为一种药物分子或载体的修饰材料，PSA与PEG具有一些相似点，如水溶性、长循环性(Gregoriadis Gj McCormack B，Wang Zj et al.Polysialic acids: potentialin drug delivery [J].FEBS letters, 1993, 315(3): 271-276.)、易于工业化生产(PSA可通过发酵及合成工艺获得)和分子量的可选择性(控制聚合度得到高至3万的不同分子量)等。但相比于PEG，PSA具有生物可降解性、无免疫原性以及保持被修饰物活性能力强等优势。 [0008]鉴于SA/PSA用于药物传递的独特优势，研究者们将其用于蛋白多肽类药物的修饰并取得了可喜的结果。如门冬酰氨酶经PEG修饰后(PEG-Asparaginase，商品名Oncaspar?)，不仅活性严重下降，还可导致机体产生较强的免疫反应(FernandesAl，Gregoriadis G.Polysialylated asparaginase: preparation, activity andpharmacokinetics[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structureand Molecular Enzymologyj 1997，1341 ⑴:26-34.)?但 PSA 化门冬酉先氛酶却无免疫原性(Fernandes Al， Gregoriadis G.The effect of polysialylation onthe immunogenicity and antigenicity of asparaginase:1mplication in itspharmacokinetics [J].1nternational journal of pharmaceutics, 2001，217 (1-2):215-224.)，而且活性几乎得到100%的保持。另外，PSA在消除所修饰蛋白/多肽的免疫原性和抗原性的同时似乎并不影响它们与相应受体的结合。例如，肿瘤特异性抗体Fab片段经PSA修饰后，不仅循环时间延长，而且在肿瘤部位的分布量增加(Gregoriadis G，Jain S， Papaioannou I， et al.1mproving the therapeutic efficacy of peptidesand proteins: a role for polysialic acids [J].1nternational journal ofpharmaceutics, 2005, 300(1-2): 125-130.)。需要特别强调的是，PSA 是一种人体内源性物质，可被组织神经氨酸酶完全降解为无毒性的SA。而PEG是合成聚合物，它在细胞色素P450酶催化下以极低速率氧化为醛和酮，而且其高/低分子量形式都倾向于在组织内蓄积，大量长期注射时会造成毒性积累。
[0009]综上可见,PSA是PEG的绝佳替代物,但目前SA/PSA在药物传递系统中的应用主要被限于蛋白多肽类药物的修饰，由Lipoxen公司开发的PSA修饰制剂长效胰岛素SuliXen?和长效促红细胞生成素Er印oXen?在英国已经进入了 2期临床研究。将PSA或结构类似的多糖连接在蛋白或多肽上的方法可见US-A-5846951或W0-A-0187922，这些方法中的一些方法依靠对聚合物“非还原”端的化学衍生以生成醛基，并借助此醛基实现PSA与蛋白多肽的缀合。但为了获得满意的反应收率需要在较高温度下进行一定的时间，这不利于所修饰的蛋白多肽等药物的稳定(例如干扰素a _2b)，其次，所需的反应物浓度(即聚合物过量)可能是无法实现或者是不经济的。因此，将PSA/SA衍生物用于药物载体的修饰，再将药物载入载体，将能够克服药物的不稳定性与PSA化反应所需条件间的矛盾。而且将药物装载于SA/PSA衍生物修饰载体中，相比于将SA/PSA衍生物与药物直接相连的策略，往往能获得较高的载药量。
[0010]但至今为止，将PSA用于药物载体的修饰研究仅有一篇文献报道，技术尚不成熟。该文献利用PSA分子中的羧基与正癸胺(n-decylamine)反应,合成了 PSA正癸胺衍生物，该物质可以自组装成为胶束，并装载难溶性药物(Bader RA, Silvers AL, ZhangN.Polysialic acid-based micelles for encapsulation of hydrophobic drugs[J].Biomacromolecules, 2011, 12(2): 314-320.)。但该合成反应具有极大的随机性，控制性差；而且PSA所连接的脂肪链`短，胶束在体内易于解体，靶向递药能力低；并且该材料难以稳固的插入到脂质体表面。
【发明内容】
[0011]为了开拓唾液酸衍生物在药物载体中的应用，我们提供了一种可广泛用于微粒制剂修饰的含有唾液酸片段的脂质衍生物(本专利中也称为唾液酸/聚唾液酸脂质衍生物)，其特征在于，唾液酸片段包含至少I个唾液酸单元，唾液酸单元间通过α -2，8-糖苷键连接，并且脂质片段与唾液酸片段中非还原端唾液酸单元的7号碳通过C-N键连接。
[0012]本发明中所述的含有唾液酸片段的脂质衍生物具有如下结构:
【权利要求】
1.一种含有唾液酸片段的脂质衍生物，其特征在于，唾液酸片段包含至少I个唾液酸单元，唾液酸单元间通过α -2，8-糖苷键连接，并且脂质片段与唾液酸片段中非还原端唾液酸单元的7号碳通过C-N键连接。
2.根据权利要求1所述的含有唾液酸片段的脂质衍生物，其特征在于，所述化合物具有通式(I)的结构
3.根据权利要求2所述的含有唾液酸片段的脂质衍生物，其特征在于，所述R-NH2是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋黄磷脂酰基乙醇胺、硬脂酰油酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰亚油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰亚油酰磷脂酰乙醇胺、二癸酰磷脂酰乙醇胺、二辛酰磷脂酰乙醇胺、二己酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰基乙醇胺聚乙二醇氨基、脂肪胺。
4.根据权利要求2所述的含有唾液酸片段的脂质衍生物，其特征在于，所述R-NH2是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺聚乙二醇氨基、直链或支链烷基胺。
5.根据权利要求3或4中任意一项所述的含有唾液酸片段的脂质衍生物，其特征在于所述磷脂酰乙醇胺聚乙二醇氨基中聚乙二醇片段的分子量为1000-10000道尔顿。
6.权利要求1至5中任何一项所述的含有唾液酸片段的脂质衍生物的应用，其特征在于所述化合物单独或与其他物质联合用于微粒制剂的制备和修饰。
【文档编号】A61K9/14GK103509066SQ201210208428
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2012年6月25日
【发明者】邓意辉, 佘振南, 张婷, 欧瀚杰 申请人:沈阳药科大学