专利名称：预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及奈瑟氏球菌属0RF2086蛋白(亚科A和亚科B)，它可从奈瑟氏球菌属的菌株以及免疫原性部分和/或所述蛋 白的生物学等价物分离，所述菌株包括脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(血清组 A、B、C、D、W-135、X、Y、Z 和 29E)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和乳糖奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica)菌株。本发明还涉及免疫特异性结合所述蛋白质、免疫原性蛋白和/或生物学等价物的抗体。此外，本发明涉及分离含有编码任何上述蛋白质、免疫原性部分、生物学等价物和/或抗体的核酸序列的多核苷酸。此外，本发明涉及免疫原性组合物及其在预防、治疗和/或诊断由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌感染，尤其是由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组b引起的脑膜炎球菌性疾病中的应用，以及制备所述组合物的方法。本发明涉及重组形式和分离自天然来源的形式，以及脂质化和非脂质化的形式。
背景技术：
尽管可利用抗生素，但脑膜炎球菌性脑膜炎仍是一种可以使儿童和青少年在数小时内死亡的疾病。Pizza等，2000，Science 287:1816-1820。脑膜炎以脑膜发炎为特征，这会导致剧烈头痛、发烧、丧失食欲、对光和声不耐受、肌肉僵硬，尤其是颈部肌肉僵硬，严重时会导致抽搐、呕吐和谵妄，从而导致死亡。脑膜炎球菌性脑膜炎症状突然出现，最终将导致脑膜炎球菌性败血症，其特征为出血性皮疹。如果有任何存活机会都要紧急进行快速诊断和用大剂量抗生素立即治疗。《Bantam医学词典》(Bantam Medical Dictionary),第三版，302，200。脑膜炎球菌性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏球菌(脑膜炎球菌)引起的，这是一种革兰氏阴性、有荚膜的细菌，被分成几个病原血清组，包括么、8、(、0、1-135、乂、￥、2和29￡。脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组B菌株是全世界脑膜炎球菌性疾病的主要原因。例如医学文献中报道，在美国和欧洲，婴儿和儿童的细菌性脑膜炎约50%是由血清组b引起的。目前还没有预防由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组b引起的脑膜炎球菌性疾病的疫苗。自从Goldschneider等的工作以来,30多年前,开发预防血清组B脑膜炎球菌性疾病的免疫原性组合物对于研究人员是一种挑战。Goldschneider等，1969，J. Exp. Med129 (6) : 1307-26 ；Goldschneider 等，1969，J. Exp. Med 129 (6) : 1327-48 ；Gotschlich 等，1969，J. Exp. Med. 129(6) :1385-95 ;和 Gotschlich 等，1969，J. Exp. Med. 129 (6) : 1367-84。与血清组A疾病不同，二战后，这种疾病在北美洲实际上已经消失，Achtman, M.，1995，Trends in Microbiology3 (5) : 186-92,由血清组B和C生物引起的疾病在很多经济发达国家仍旧是一种地方病。疾病的发病率〈1/100，000，而在流行时，高危人群中地方病的发病率200/100, 000是罕见的。已经开发了抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A和C的基于多糖结合物的疫苗，这种疫苗似乎有效预防疾病。目前已经有用血清组A、C、Y和W-135荚膜多糖制造的免疫原性组合物。Ambrosch等，1983，“一种新型四价的免疫原性和副作用”，Bulletin of the WorldHealth Organization 61 (2) : 317-23。然而,这种免疫原性组合物引发一种不依赖T-细胞的免疫应答，这在儿童中无效，且不能对付造成50%以上脑膜炎球菌性疾病的血清组B菌株。
其它人也试图用荚膜多糖开发免疫原性组合物。最近，将血清组C荚膜物质与蛋白质结合制成的血清组C疾病的免疫原性组合物在欧洲已被许可使用。然而，血清组B荚膜不适合作为疫苗候选物，因为这种荚膜多糖是由聚唾液酸构成的，它与发育中的人神经组织上的碳水化合物部分类似。这种糖部分被识别为自身抗原，因此对人的免疫原性弱。外膜蛋白(OMP)被开发作为血清组B疾病疫苗抗原的替代品。与PorA两个可变区结合的单克隆抗体确定了脑膜炎球菌的血清亚分类方案。PorA蛋白因此作为脑膜炎球菌菌株的血清亚分类抗原(Abdillahi 等，1988, Microbial Pathogenesis4(I) :27—32),并被作为血清组B免疫原性组合物的组分而被广泛研究(Poolman, 1996, Adv. Exp. Med.Biol. 397:73-7),因为它们可引发杀菌抗体(Saukkonen, 1987, Microbial Pathogenesis3(4) :261-7)。杀菌抗体被认为是保护作用的指示剂，任何新的免疫原性组合物候选物都应该能够引发这些功能性抗体。人和动物研究表明，血清亚分类抗原PorA引发杀菌抗体。然而，对Por A的免疫应答通常是血清亚型特异的。特别地，血清亚分类数据表明，由PorA制得的免疫原性组合物需要各个血清亚型的PorA都被这样一种免疫原性组合物覆盖，可能多达6-9个。因此，将需要6-9个PorA来覆盖70-80%血清组B菌株。因此，这种蛋白质的可变特性需要一种多价疫苗组合物来抵抗足量的脑膜炎球菌血清亚型临床隔离群。开发血清组B脑膜炎球菌的免疫原性组合物非常困难，最近，一些研究小组测序了代表血清组A和B菌株的基因组以帮助鉴定新型免疫原性组合物的候选物。Tettelin，2000, Science, 287 (5459) :1809-15 ;Pizza 等，2000，Science 287:1816-1820。即便了解了奈瑟氏球菌的基因组，鉴定新型免疫原性组合物候选物也是一种挑战过程，因为现在还没有合适的数学算法。实际上，一项最近的报道声称，尽管已经鉴定了数百个包含理论跨膜区的开放阅读框(“ORFs”)，与表达、纯化、诱导表面反应和功能活性抗体有关的问题使研究者只发现了七种血清组B脑膜炎球菌性免疫原性组合物的候选物。参见同前。其中一种已知。因此，需要一种免疫原性组合物，这种组合物可以(I)引发多种奈瑟氏球菌菌株的杀菌抗体；(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击(live challenge)的被动保护；和/或⑷防止集落形成。
发明内容
为满足这些要求和其它要求，本发明提供了奈瑟氏球菌0RF2086蛋白(“2086蛋白，，)，包括2086亚科A蛋白和2086亚科B蛋白。各个2086蛋白都是可以分离自天然奈瑟氏球菌菌株的蛋白，包括脑膜炎奈瑟氏球菌(血清组么、8、(、0、1-135、乂、￥、2和29E)，淋病奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌菌株。2086蛋白也可用重组技术制备。特别地，本发明提供了 2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物学等价物，与上述任一免疫特异性结合的抗体，以及包含编码上述任一的核酸序列的多核苷酸。本发明包括组合物、免疫原性组合物及其在预防、治疗和/或诊断脑膜炎球菌感染，尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌性疾病中的应用，以及制备所述组合物的方法。这里所述2086蛋白包括重组形式和分离自天然来源的形式以及脂质化和非脂质化的形式。
本发明意外地且有利地提供了组合物，所述组合物(I)引发多种奈瑟氏球菌菌株的杀菌抗体，所述菌株如脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌和/或乳糖奈瑟氏球菌菌株；
(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击的被动保护；和/或⑷防止集落形成，以及使用所述组合物的方法和制备所述组合物的方法。下面描述了本发明的各种实施方案。
图Ia描述了 SDS-PAGE凝胶，它描述了实验获得的蛋白质组分的两种主要蛋白，该实验是为了鉴定奈瑟氏菌的膜蛋白提取物能够引发抗异源菌株的杀菌抗体。图IB描述了通过蛋白酶消化和反相N-末端测序分析TMAE流过组分鉴定两种主要蛋白的实验结果。图2描述了纯化方案和用SDS-PAGE确定rLP2086的均一性。图3描述了通过LC-MS/MS和相应的SDS-PAGE分析TMAE流过组分鉴定两种主要蛋白和一种次要蛋白的实验结果。图4是2086蛋白重组表达的SDS-PAGE凝胶。图5是质粒pPX7340的示意图，如这里的实施例所述。图6是质粒pPX7328的示意图，如这里的实施例所述。图7是质粒pPX7343示意图，如这里的实施例所述。图8描述了各种菌株2086基因的N-末端区域。图9A是鉴定奈瑟氏球菌菌株中免疫原性组分最初步骤的流程图。图9B是鉴定奈瑟氏球菌菌株中免疫原性组分最终步骤的流程图。图IOA是pBAD阿拉伯糖可诱导启动子的示意图，它驱动P4信号/0RF2086融合蛋白的表达以表达rP2086的脂质化形式，如这里的实施例所述。图IOB是用于重组表达0RF2086的非脂质化形式的pET9a_I7载体的示意图。图IlA是代表表达rLP2086蛋白的大肠杆菌B全细胞裂解物的照片。图IlB是代表表达rP2086蛋白的大肠杆菌B全细胞裂解物的照片。图12是显示0RF2086蛋白亚科和类别的结构的系统树。图13是rLP2086亚科A抗血清的全细胞ELISA数据的图示。图14是rLP2086亚科B抗血清的全细胞ELISA数据的图示。。图15是rLP2086混合研究(mixing study)-WCE效价结果的图不。图16是rLP2086/rPorA混合研究-WCE效价结果的图示。图17是显示rLP2086鼠抗血清对P2086亚科B脑膜炎奈瑟氏球菌全细胞裂解物反应性的Western印迹。图18是显示rLP2086鼠抗血清对P2086亚科A脑膜炎奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌全细胞裂解物反应性的Western印迹。序列概沭用于研究的序列的SEQ ID N0S.:SEQ ID NO: I当与天然前导序列结合时，编码L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:2用天然前导序列制备的L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:3当与P4前导序列结合时，编码L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列 SEQ ID N0:4用P4前导序列制备的L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:5编码L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:6L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:7当与天然前导序列结合时，编码CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:8用天然前导序列制备的CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:9当与P4前导序列结合时，编码CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 10用P4前导序列制备的CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 11编码CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 12CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13当与天然前导序列结合时，编码⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 14用天然前导序列制备的⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 15当与P4前导序列结合时，编码⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 16用P4前导序列制备的⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 17编码CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 18CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 19当与天然前导序列结合时，编码L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:20用天然前导序列制备的L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:21当与P4前导序列结合时，编码L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:22用P4前导序列制备的L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:23编码L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:24L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID N0:25当与天然前导序列结合时，编码B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:26用天然前导序列制备的B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:27当与P4前导序列结合时，编码B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:28用P4前导序列制备的B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:29编码B16B6菌株的成 熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:30B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 31当与天然前导序列结合时，编码W135 (ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 32用天然前导序列制备的W135 (ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列。SEQ ID N0:33当与P4前导序列结合时，编码W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:34用P4前导序列制备的W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨
基酸序列。SEQ ID NO: 35编码W135 (ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:36W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 37当与天然前导序列结合时，编码Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:38用天然前导序列制备的Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:39当与P4前导序列结合时，编码Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:40用P4前导序列制备的Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:41编码Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:42C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:43当与天然前导序列结合时，编码Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:44用天然前导序列制备的Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基
酸序列。SEQ ID N0:45当与P4前导序列结合时，编码Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:46用P4前导序列制备的Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基
酸序列。SEQ ID N0:47编码Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:48Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:49当与天然前导序列结合时，编码M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:50用天然前导序列制备的M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:51当与P4前导序列结合时，编码M98250732菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:52用P4前导序列制备的M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 53编码M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。 SEQ ID N0:54M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 55当与天然前导序列结合时，编码M98250771菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:56用天然前导序列制备的M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵:57当与？4前导序列结合时，编码1198250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:58用P4前导序列制备的M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 59编码M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:60M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:61当与天然前导序列结合时，编码⑶C1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:62用天然前导序列制备的CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:63当与P4前导序列结合时，编码⑶C1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:64用P4前导序列制备的⑶C1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:65编码CDCl 135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:66CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:67当与天然前导序列结合时，编码M97252153菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:68用天然前导序列制备的M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:69当与P4前导序列结合时，编码M97252153菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:70用P4前导序列制备的M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:71编码M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:72M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 73当与天然前导序列结合时，编码⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 74用天然前导序列制备的⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:75当与P4前导序列结合时，编码⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨
基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:76用P4前导序列制备的⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:77编码⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID N0:78CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 79当与天然前导序列结合时，编码⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:80用天然前导序列制备的⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:81当与P4前导序列结合时，编码⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:82用P4前导序列制备的⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:83编码⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID N0:84CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:85当与天然前导序列结合时，编码L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:86用天然前导序列制备的L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:87当与P4前导序列结合时，编码L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:88用P4前导序列制备的L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89编码L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:90L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:91当与天然前导序列结合时，编码M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:92用天然前导序列制备的M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:93当与P4前导序列结合时，编码M97252988菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:94用P4前导序列制备的M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:95编码M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:96M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID N0:97当与天然前导序列结合时，编码M97252697菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:98用天然前导序列制备的M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:99当与P4前导序列结合时，编码M97252697菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 100用P4前导序列制备的M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸
序列。 SEQ ID NO: 101编码M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 102M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 103当与天然前导序列结合时，编码6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 104用天然前导序列制备的6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 105当与P4前导序列结合时，编码6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 106用P4前导序列制备的6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 107编码6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 1086557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 109当与天然前导序列结合时，编码2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:110用天然前导序列制备的2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 111当与P4前导序列结合时，编码2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 112用P4前导序列制备的2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 113编码2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 1142996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 115当与天然前导序列结合时，编码M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 116用天然前导序列制备的M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵117当与？4前导序列结合时，编码1197252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID勵118用？4前导序列制备的] 97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 119编码M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 120M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 121当与天然前导序列结合时，编码M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 122用天然前导序列制备的M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵123当与？4前导序列结合时，编码1197251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 124用P4前导序列制备的M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 125编码M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 126M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 127当与天然前导序列结合时，编码CDC1521菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。 SEQ ID N0:128用天然前导序列制备的⑶C1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 129当与P4前导序列结合时，编码CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 130用P4前导序列制备的⑶C1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 131编码⑶C1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:132CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 133当与天然前导序列结合时，编码M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 134用天然前导序列制备的M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵135当与？4前导序列结合时，编码1198250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 136用P4前导序列制备的M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 137编码M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 138M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 139当与天然前导序列结合时，编码870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 140用天然前导序列制备的870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 141当与P4前导序列结合时，编码870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 142用P4前导序列制备的870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 143编码870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 144870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 145当与天然前导序列结合时，编码M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO: 146用天然前导序列制备的M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵147当与？4前导序列结合时，编码1197253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 148用P4前导序列制备的M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 149编码M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 150M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 151当与天然前导序列结合时，编码M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 152用天然前导序列制备的M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:153当与P4前导序列结合时，编码M98250809菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 154用P4前导序列制备的M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 155编码M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 156M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 157当与天然前导序列结合时，编码L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 158用天然前导序列制备的L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 159当与P4前导序列结合时，编码L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 160用P4前导序列制备的L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 161编码L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 162L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 163当与天然前导序列结合时，编码NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 164用天然前导序列制备的NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:165当与P4前导序列结合时，编码NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 166用P4前导序列制备的NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 167编码NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 168NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 169当与天然前导序列结合时，编码M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 170用天然前导序列制备的M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:171当与P4前导序列结合时，编码M98250572菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 172用P4前导序列制备的M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 173编码M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 174M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:175 当与天然前导序列结合时，编码 A4Sanford ;M97251836PART ;M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ IDN0:176 用天然前导序列制备的 A4Sanford ;M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ IDNO: 177 当与 P4 前导序列结合时，编码 A4Sanford ；M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 178 用 P4 前导序列制备的 A4Sanford ；M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 179 编码 A4Sanford ;M97251836PART ;M97251957 ;M97251985 ;M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:180A4Sanford ；M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或厘97251830 菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 181当与天然前导序列结合时，编码CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 182用天然前导序列制备的CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 183当与P4前导序列结合时，编码CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 184用P4前导序列制备的CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 185编码CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 186CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 187当与天然前导序列结合时，编码M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 188用天然前导序列制备的M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 189当与P4前导序列结合时，编码M97252097菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 190用P4前导序列制备的M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 191编码M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 192M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 193当与天然前导序列结合时，编码870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 194用天然前导序列制备的870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序 列。SEQ ID NO: 195当与P4前导序列结合时，编码870227菌株的成熟2086蛋白的氨
基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 196用P4前导序列制备的870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 197编码870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 198870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 199当与天然前导序列结合时，编码H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 200用天然前导序列制备的H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:201当与P4前导序列结合时，编码H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:202用P4前导序列制备的H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:203编码H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:204H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 205当与天然前导序列结合时，编码H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:206用天然前导序列制备的H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 207用P4前导序列制备的H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:208编码H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:209当与P4前导序列结合时，编码H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:210H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 211当与天然前导序列结合时，编码8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:212用天然前导序列制备的8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:213当与P4前导序列结合时，编码8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID N0:214用P4前导序列制备的8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:215编码8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:2168529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 217当与天然前导序列结合时，编码6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 218用天然前导序列制备的6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:219当与P4前导序列结合时，编码6940菌株的成熟2086蛋白的氨基 酸序列的核酸序列SEQ ID NO:220用P4前导序列制备的6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:221编码6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ IDN0:2226940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 223当与天然前导序列结合时，编码M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 224用天然前导序列制备的M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:225当与P4前导序列结合时，编码M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:226用P4前导序列制备的M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 227编码M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:228M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 229当与天然前导序列结合时，编码880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:230用天然前导序列制备的880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:231当与P4前导序列结合时，编码880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:232用P4前导序列制备的880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:233编码880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:234880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:235当与天然前导序列结合时，编码M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:236 用天然前导序列制备的 M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:237 当与P4前导序列结合时，编码M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:238 用 P4 前导序列制备的 M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:239 编码 M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟 2086 蛋白
的氨基酸序列的核酸序列。
SEQID NO:240M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟 2086 蛋白的氨基
酸序列。
SEQID NO:241当与天然前导序列结合时，编码M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID N0:242用天然前导序列制备的M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID勵:243当与？4前导序列结合时，编码1198250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID NO:244用P4前导序列制备的M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID N0:245编码M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID N0:246M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID NO:247当与天然前导序列结合时，编码CDC1573菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQID NO: 248用天然前导序列制备的CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID NO: 249当与P4前导序列结合时，编码CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID NO:250用P4前导序列制备的CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID N0:251编码CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID N0:252CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID NO:253编码乳酰胺奈瑟氏球菌菌株的2086蛋白的氨基酸序列的部分核酸序列。SEQID N0S:254_259与蛋白质的2086家族的蛋白结合的氨基酸序列。SEQID NOS: 260-278与2086亚科A的蛋白结合的氨基酸序列。SEQID NOS: 279-299与2086亚科B的蛋白结合的氨基酸序列。SEQID NO:300是与本发明实施方案所述2086蛋白家族(“2086蛋白”)相应的
氨基酸共有序列。SEQID NO: 301是与本发明实施方案所述2086蛋白亚科A相应的氨基酸共有序列。SEQID N0:302是与本发明实施方案所述2086蛋白亚科B相应的氨基酸共有序列。SEQID NO:303带有BamHI限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号4623)。SEQID NO:304带有NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号4624)。SEQID NO:305正向引物的核酸序列(化合物编号4625)。SEQID N0:306正向引物的核酸序列(化合物编号:5005)。SEQID NO:307反向引物的核酸序列(化合物编号5007)。SEQID N0:308带有BglII限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号5135)。
SEQ ID N0:309带有BamHI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号5658)。SEQ ID NO:310带有SphI限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号5660)。SEQ ID N0:311带有BamHI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号6385)。SEQ ID N0:312带有BglII和NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:6406)。SEQ ID N0:313正向引物的核酸序列(化合物编号:6470)。SEQ ID NO:314反向引物的核酸序列(化合物编号6472)。SEQ ID N0:315带有BamHI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号6473)。
SEQ ID N0:316带有BglII和NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:6474)。SEQ ID N0:317正向引物的核酸序列(化合物编号:6495)。SEQ ID NO:318反向引物的核酸序列(化合物编号6496)。SEQ ID N0:319带有SphI限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号6543)。SEQ ID N0:320带有BglII限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号6605)。SEQ ID N0:321带有BglII和NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号6721)。SEQ ID N0:322P4前导序列的核酸序列。SEQ ID NO:323天然2086前导序列变体I的核酸序列。SEQ ID NO: 324天然2086前导序列变体2的核酸序列。SEQ ID NO:325天然2086前导序列变体3的核酸序列。SEQ ID NO: 326天然2086前导序列变体4的核酸序列。SEQ ID NO:327P4431 的氨基酸序列。SEQ ID NO:328P5163 的氨基酸序列。SEQ ID N0:329是本发明实施方案的氨基酸序列。
具体实施例方式一类新的具有抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的交叉功能杀菌活性的抗原可避免对多价PorA的需求以进行抗感染免疫。这种抗原被意外识别并在这里被描述和要求权利。首先在脑膜炎球菌菌株的可溶性外膜蛋白(sOMP)的复杂混合物中观察到这种抗原。通过一系列分级和蛋白质纯化步骤直到感兴趣的蛋白质混合物仅含有少数蛋白而发现这种抗原的杀菌活性。通过N-末端氨基酸测序和肽作图鉴定了这种混合物中的主要蛋白质。具有杀菌活性的感兴趣的蛋白质被鉴定为0RF2086蛋白，这是一种脂质化蛋白质(也被称为LP2086)。“0RF2086蛋白”是指一种由奈瑟氏球菌属的开放阅读框2086 (0RF2086)编码的蛋白质。新的免疫原性组合物在这里是指分离自脑膜炎奈瑟氏球菌的基于奈瑟氏球菌属0RF2086蛋白(也称为“2086蛋白”或“0RF2086”蛋白质，在这里可替换使用，或P2086 (指非脂质化蛋白)和LP2086(指蛋白的脂质化形式))的候选物，它通过合并细胞分级分离，不同洗涤剂提取、蛋白质纯化，以及制备抗血清并用多种菌株进行杀菌活性测定而鉴定。作为潜在的免疫原性组合物和上述参考资料中所述诊断方法的替代品，本发明涉及组合物以及通过使用蛋白质、其免疫原性部分和其生物学等价物，及编码所述多肽、蛋白质和等价物的基因以及与其免疫特异性结合的抗体治疗和/或预防脑膜炎球菌感染的方法。根据本发明的实施方案，基于上述试剂显示的交叉反应性或非菌株特异性，包括分离的多肽、其免疫原性部分和/或其生物学等价物的基于2086蛋白的免疫原性试剂被意外确定为免疫原性候选物。特别地，所述候选物出乎意料地被鉴定出具有以下能力(I)引发多种奈瑟氏球菌和/或淋球菌菌株的杀菌抗体；(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击的被动保护；和/或(4)防止集落形成。因此，本发明提供了包含所述免疫原性试剂的免疫原性组合物，包括分离的多肽、其免疫原性部分和/或其生物学等价物，以及使用它们抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法。(参见这里的实施例I用于鉴定2086蛋白的方法。)术语“非菌株特异”在这里指抗原引发抗一种以上脑膜炎奈瑟氏球菌菌株(例如异源脑膜炎球菌菌株)的免疫应答效应的特性。术语“交叉反应”在这里可与术语“非菌株特异”互换使用。术语“免疫原性非菌株特异性脑膜炎奈瑟氏球菌抗原”在这里描述可分离 自脑膜炎奈瑟氏球菌的抗原，尽管它也可分离自其它细菌(例如其它奈瑟氏球菌菌株，如淋球菌菌株)，或用重组技术制备。本发明的2086蛋白包括脂质化和非脂质化的蛋白。此外，本发明还试图将与各个蛋白质相应的不成熟蛋白或前蛋白用作中间化合物/组合物。根据本发明的实施，本发明还提供了与上述免疫原性试剂免疫特异结合的抗体。此外，本发明涉及包含编码上述任一的核酸序列的分离的多核苷酸。因此，本发明提供了组合物和/或免疫原性组合物以及它们在预防、治疗和/或诊断脑膜炎球菌性脑膜炎，尤其是血清组B脑膜炎球菌性疾病中的应用，以及制备所述组合物的方法。本发明的组合物具有高免疫原性并能够引发杀菌抗体的产生。这些抗体与异源血清组、血清型和血清亚型的脑膜炎球菌菌株交叉反应。因此，本发明的组合物克服了以前脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗的不足，它具有对异源奈瑟氏球菌菌株引发杀菌抗体的能力。因此，本发明提供了可与较少组分结合而产生保护作用的免疫原性组合物，这种保护作用可与先前使用的试剂相比，这是本发明的其它优点。所述组合物或免疫原性试剂(例如多肽、免疫原性部分或片段和生物学等价物等，但不限于此)可单独使用或与其它抗原或试剂一起使用以引发对脑膜炎球菌感染和疾病的免疫保护，以及引发对其它病原体引起的感染和/或疾病的免疫保护。由于减少了抗多种菌株所需的抗原的数量，这样就简化了用来抗脑膜炎球菌感染的免疫原性组合物的设计。实际上，纯化的2086蛋白将显著地并出乎意料地减少提供足够的引起脑膜炎球菌性疾病的菌株的免疫原性所需的蛋白数量。所述2086蛋白可在大肠杆菌中作为脂蛋白重组表达，这是蛋白质的野生形式，其表达水平远高于天然脑膜炎球菌。由于发现来自一种菌株的抗2086蛋白的抗体可杀死不相关的(即异源的)菌株，我们试图表征大量异源菌株以确定存在“2086同源物”，并确定序列保守的水平。尽管用PCR测得约70%的菌株具有2086同源物，这种同源物可用扩增起始2086基因的引物从菌株8529扩增，但其余约30%对这种测试呈阴性。余下的约30%被发现含有与来自2086基因的起始8529仅有约60%氨基酸序列同源性的2086同源物。其它引物被确定可从这些约30%的菌株扩增2086同源物。所测脑膜炎奈瑟氏球菌菌株属于亚科A或亚科B，这取决于可扩增2086同源物的引物。这些实验的细节描述在下面的实施例5中。2086蛋白在各种血清亚型中的存在情况为确定脑膜炎奈瑟氏球菌菌株之间2086基因的序列保守水平，克隆了亚科A和B的一些代表的全长基因并进行了 DNA序列分析。用这里所述的引物，例如参见表IV，鉴定了 24种表达不同血清亚型抗原且也表达共享蛋白P2086的血清组B脑膜炎球菌菌株。这些序列的例子在这里提供并作为成熟DNA序列显示(即在半胱氨酸残基切除所有脂蛋白信号序列)。例如参见偶数编号的SEQ ID N0S:2-252的氨基酸序列，但不限于此。由于2086蛋白不大量出现在野生型菌株中，它是杀菌抗体的靶。这些抗体不同于响应PorA产生的抗体,能够杀死表达异源血清亚型的菌株。2086蛋白的抗体还可被动保护幼鼠免遭脑膜炎球菌攻击(见表VII)。2086蛋白的重组表达使得可用2086蛋白作为免疫原性组合物以预防脑膜炎球菌性疾病。临床实验中所有新近的脑膜炎球菌性免疫原性组合物的候选物都是含有许多不同蛋白的复杂混合物或外膜蛋白制品。提供血清亚型特异性的PorA蛋白质需要一种免疫原性组合物中含有 6-9种变异体以覆盖约70-80%疾病相关的血清亚型。相反，这里清楚证明，一种2086蛋白的抗血清能够杀死6种血清亚型的代表，在西欧和美国它们引起约65%的疾病隔离群。因此，纯化的2086蛋白具有减少提供足够覆盖引起脑膜炎球菌性疾病的血清亚型的免疫原性组合物所需的蛋白数量的潜力。蛋白质、免疫原性蛋白和生物学等价物本发明提供的2086蛋白是分离的蛋白质。术语“分离的”是指用人手从天然状态改变。如果“分离的”组合物或物质在自然界存在，则它已经被改变或从其原始环境除去，或者两者同时发生。例如天然出现在活动物中的多肽或多核苷酸不是“分离的”，但相同的分离自其天然状态共存物质的相同多肽或多核苷酸是“分离的”，如这里所用的术语。因此，术语“分离的蛋白质”在这里包括分离自天然来源的蛋白和用重组技术制备的蛋白，以及与其它抗原和/或添加剂组合的蛋白，添加剂如药学上可接受的载体、缓冲剂、佐剂等。根据本发明的实施方案，2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物学等价物包含以下任何氨基酸序列ADIGxGLADA (SEQ ID NO:254)，其中，x 是任何氨基酸； IGxGLADALT (SEQ ID NO: 255)，其中，x 是任何氨基酸；SLNTGKLKND(SEQ ID NO:256)；SLNTGKLKNDKxSRFDF(SEQ ID NO:257，其中，x 是任何氨基酸);SGEFQxYKQ (SEQ ID NO: 258)，其中，x 是任何氨基酸；或IEHLKxPE (SEQ ID NO: 259)，其中，x 是任何氨基酸。根据本发明的实施方案，2086亚科A蛋白质，其免疫原性部分和/或其生物学等价物包含以下任何氨基酸序列GGGVAADIGx (SEQ ID NO:260)，其中，x 是任何氨基酸；SGEFQIYKQ(SEQ ID NO:261)；HSAWALQIE(SEQ ID NO:262)；EKINNPDKID(SEQ ID NO:263)；SLINQRSFLV(SEQ ID NO:264)；
SGLGGEHTAF(SEQ ID NO :265)；GEHTAFNQLP(SEQ ID NO :266)；SFLVSGLGGEH(SEQ ID NO :267)；EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP(SEQ ID NO :268)；GKAEYHGKAF(SEQ ID NO :269)；YHGKAFSSDD(SEQ ID NO :270)； GKAEYHGKAFSSDD(SEQ ID NO:271)；IEHLKTPEQN(SEQ ID NO :272)；KTPEQNVELA(SEQ ID NO :273)；IEHLKTPEQNVELA(SEQ ID NO :274)；AELKADEKSH(SEQ ID NO :275)；AVILGDTRYG(SEQ ID NO:276)；AELKADEKSHAVILGDTRYG (SEQ ID NO:277);或EEKGTYHLAL(SEQ ID NO:278)。2086亚科B蛋白质、其免疫原性部分和/或其生物学等价物，包含以下任何如本发明实施方案所述的氨基酸序列LITLESGEFQ(SEQ ID NO:279)；SALTALQTEQ(SEQ ID NO :280)；FQVYKQSHSA(SEQ ID NO:281)；LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ(SEQ ID NO:282)；I⑶IAGEHTS(SEQ ID NO :283)；EHTSFDKLPK(SEQ ID NO :284)；I⑶IAGEHTSFDKLPK(SEQ ID NO :285)；ATYRGTAFGS(SEQ ID NO :286)；DDAGGKLTYT(SEQ ID NO :287)；IDFAAKQGHG(SEQ ID NO :288)；KIEHLKSPEL(SEQ ID NO :289)；ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV(SEQ ID NO:290)；HAVISGSVLY(SEQ ID NO:291)；KGSYSLGIFG(SEQ ID NO :292)；VLYNQDEKGS(SEQ ID NO :293)；HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG(SEQ ID NO :294)；AQEVAGSAEV(SEQ ID NO :295)；IHHIGLAAKQ(SEQ ID NO :296)；VETANGIHHI(SEQ ID NO :297)；AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO :298);或VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO:299)。所述2086蛋白包括以下如本发明实施方案所述的共有序列和/或其免疫原性部分。
2086 蛋白共有序列(SEQ ID NO:300):CSSG-----GGGVxADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGA EKTxxx⑶SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGxxITLxSGEFQxYKQxHSAxxALQxExxxxxxxxxxxxxxRxFxxxxxxGEHTxFxxLPxx-xAxYxGxAFxSDDxxGxLxYxIDFxxKQGxGxIEHLKxPExNVxLAxxxxKxDEKxHAVIxGxxxYxxxEKGxYxLxxxGxxAQExAGxAxVxxxxxxHxIxxAxKQ在上述共有序列中，“x”表示任何氨基酸，氨基酸位置5-9的区域是任何0-5个氨基酸，氨基酸位置67-69的区域是任何0-3个氨基酸，同时氨基酸位置156是任何0_1个氨基酸。氨基酸位置5-9的区域优选包含0、4或5个氨基酸。氨基酸位置67-69的区域优选包含0或3个氨基酸。特别值得一提的是，这种共有序列说明了 2086蛋白的高变异性。根据理论，但不局限于此，这种高变异性被认为提供了有利且未预料的交叉反应性。 根据本发明的一个实施方案，所述2086蛋白以免疫原性、非病原的和非菌株特异为特征。此外，根据本发明再一个实施方案，这些蛋白意外地具有免疫原性，尽管约2%-约40%是非保守的。术语“非保守的”在这里指可以发生插入、取代和/或缺失的氨基酸数目占蛋白质中总氨基酸数目的百分比。例如，如果蛋白质有40%是非保守的并有例如263个氨基酸，则蛋白质中有105个氨基酸位置上的氨基酸可以发生取代。同样，如果蛋白质有10%是非保守的并有例如约280个氨基酸，则有28个氨基酸位置上的氨基酸可发生取代。所述2086蛋白不包含蛋白质免疫原性的氨基酸残基也可发生缺失。此外，可基于不同区域的同源性将所述2086蛋白分成亚科。例如，下面提供了共有序列的两个亚科，亚科A和亚科B，但不局限于此2086 亚科 A 序列(SEQ ID 301)CSSG——GGGVAADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTxxx⑶SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGQxITLxSGEFQIYKQxHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPxGKAEYHGKAFSSDDxxGxLxYxIDFxxKQGxGxIEHLKTPEQNVELAxAELKADEKSHAVILGDTRYGxEEKGTYHLALx⑶RAQEIAGxATVKIxEKVHEIxIAxKQ“x”是任何氨基酸。氨基酸位置5-8的区域是任何0-4个氨基酸。氨基酸位置66-68的区域是任何0_3个氨基酸。氨基酸位置5-8的区域优选包含0或4个氨基酸。氨基酸位置66-68的区域优选包含0或3个氨基酸。2086 亚科 B (SEQ ID 302)CSSGGGG-----VxADIGxGLADALTAPLDHKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGxLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQxQDxExSxKMVAKRxFxI⑶IAGEHTSFDKLPKxxxATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVxLAxxYIKPDEKxHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGxxAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ“x”是任何氨基酸。氨基酸位置8-12的区域是任何0-5个氨基酸。
氨基酸位置8-12的区域优选包含0或5个氨基酸。根据本发明的实施方案，2086蛋白亚科可再分成簇(cluster)。例如根据本发明的一个实施方案，提供了以下以下簇偶数编号的SEQ ID N0S:2-12 ;偶数编号的SEQ IDN0S: 14-24 ;偶数编号的SEQ ID N0S: 26-42 ;偶数编号的SEQ ID N0S: 50-60 ;偶数编号的SEQ ID N0S:62-108 ;偶数编号的 SEQ ID N0S: 110-138 ;偶数编号的 SEQ ID N0S: 140-156 ；偶数编号的SEQ ID N0S: 158-174和偶数编号的SEQ ID N0S:224-252 本发明的多肽序列可与偶数编号的SEQ ID NOS:2-252的参考序列相同，S卩100%相同，或与参考序列相比有一定数目的氨基酸改变，即同一 性百分比小于100%。这种改变包括至少一种氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代)或插入。这种改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之间的任何地方，分散在参考氨基酸序列的各个氨基酸中间或在参考氨基酸序列内的一个或多个毗连基团中。因此，本发明还提供了含有与序列表中所含氨基酸序列(即偶数编号的SEQ IDNOS:2-252)相同序列的蛋白质。根据特定的序列，序列的同一性程度优选大于60%(例如60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99. 9%或更高)。这些同源蛋白包括突变体和等位基因变异体。在本发明优选的实施方案中，所述2086蛋白或其它2086多肽(例如免疫学部分或生物学等价物)产生对同源和至少一种异源脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体。特别地，2086多肽的抗体被动保护幼鼠免遭脑膜炎球菌的侵袭，例如鼻内的。在更加优选的实施方案中，所述2086多肽可使幼鼠抵抗同源菌株和至少一种异源菌株。所述多肽可选自上述序列，如偶数编号的SEQ ID N0S:2-252，或者所述多肽可以是所列多肽的任何免疫学片段或生物学等价物。优选地，所述多肽选自上述序列中任何偶数编号的SEQ ID N0S:2-2520本发明还涉及所述2086多肽的等位基因变体或其它变异体，这是生物学等价物。合适的生物学等价物能够(I)引发对同源菌株和至少一种异源奈瑟氏球菌菌株和/或淋球菌菌株的杀菌抗体；(2)与同源菌株和至少一种异源奈瑟氏球菌菌株和/或淋球菌菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击的被动保护；和/或(4)防止集落形成。合适的生物学等价物与这里所述2086多肽之一(即偶数编号的SEQIDNOS :2-252)至少有约60%，优选至少约70%，更优选至少约75%，再优选约80%，再优选约85%，再优选约90%，再优选约95%或再优选约98%，或再优选约99%类似，这使得所述等价物能够引发与本发明的2086蛋白实质上相同的免疫原性特性。或者，所述生物学等价物与偶数编号的SEQ ID NOS:2-252中的2086蛋白之一有实质上相同的免疫原性特性。更加本发明的一个实施方案，所述生物学等价物与偶数编号的SEQ ID NOS 2-252的有相同的免疫原性特性。通过产生本发明蛋白质的变异体和修饰物得到了生物学等价物。这些蛋白质的变异体和修饰物是通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸来改变氨基酸序列而获得的。氨基酸序列被修饰，例如通过取代以产生实质上相同质量或改进质量的多肽。优选的引入变化的方法包括通过定点诱变产生多肽的核酸序列的预定突变。修饰和变化可发生在本发明多肽的结构中，这样获得的的分子仍具有脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性。例如，但不限于此，在未丧失免疫原性的序列中，某些氨基酸可被其它氨基酸取代(包括非保守性取代和保守性取代)。由于多肽的相互作用能力和性质确定了多肽的生物学功能活性，多肽序列(或者，当然，其指定的DNA编码序列)中可发生许多氨基酸序列的取代，然而，所得多肽具有类似特性。本发明包括这里所述多肽结构以及编码所述多肽的核酸序列的任何变化，其中，所述多肽保持免疫原性。根据这里提供的指导，精通此领域的技术人员能够很容易地修饰所述多肽和多核苷酸。例如某些可变区被确定可允许有取代或缺失。如上所述，根据本发明的一个实施方案，所述2086共有序列显示了 2086蛋白家族的保守和非保守性区域。在作出这些变化时，可采用精通此领域的技术人员已知的任何技术。例如，但不限于此，可考虑氨基酸的亲水指数。在对多肽赋予生物活性功能时，亲水氨基酸指数的重要性在此领域中通常被理解。Kyte等，1982. J. Mol. Bio. 157:105-132。基于亲水性，也可进行类似氨基酸的取代，尤其是生物功能等价多肽或如此产生的肽要用于免疫学实施方案时。美国专利4，554，101描述了多肽的最大局部平均亲水性，这由其毗邻氨基酸的亲水性控制，与其免疫原性相关，即与多肽的生物学特性相关，在此将此专利并入以供参考。所述多肽的生物学等价物也可通过定点诱变制备。定点诱变是通过特定诱变指定的DNA来制备第二代多肽或来自其序列的生物功能等价多肽或肽的有用技术。这种改变可发生在需要氨基酸取代的地方。这种技术还提供制备和测试序列变异体的能力，例如结合上述一种或多种想法，在DNA中引入一个或多个核苷酸序列变化。定点诱变可通过使用特定的寡核苷酸序列产生突变体，所述序列编码所需突变的DNA序列和足够数量的毗邻核苷酸，以提供足够大小的引物序列和序列复杂性从而在横贯缺失连接的两侧上形成稳定的双链体。通常，长度约为17-25个核苷酸的引物是优选的，序列连接的两侧约有5-10个残基被改变。通常，定点诱变技术是本领域熟知的。应该意识到的是，该技术通常采用噬菌体载体，它可以以单链和双链形式存在。通常，这里所述的定点诱变是通过首先获得单链载体而进行的，该载体的序列中包含编码所有或部分所选脑膜炎奈瑟氏球菌多肽序列的DNA序列。制备了带有所需突变序列的寡核苷酸引物(例如合成的)。然后将该引物退火形成单链载体，并用酶如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段延伸，以完全合成带有突变的链。因此形成了杂双链体，其中第一条链编码最初的非突变序列，第二条链带有所需突变。然后用这种杂双链体载体来转化合适的细胞，如大肠杆菌细胞，并选择包含带有该突变的重组载体的克隆。市售的试剂盒可提供需要的所有试剂，除但寡核苷酸引物外。所述2086多肽包括任何与具有偶数编号的SEQ ID NOS 2-252之一的氨基酸序列的2086蛋白有足够的序列相似性和/或生物学等价的蛋白或多肽。此外，本发明的2086多肽不限于特定来源。因此，本发明提供一般检测和从各种来源分离多肽。同样，基于本文提供的指导，所述2086多肽可用重组方法制备，这是本领域技术人员熟知的，或用此领域已知的任何其它合成方法制备。本发明预料，将所述2086多肽切割成片段将有利于进一步用于结构或功能分析或用于产生如2086相关多肽和2086特异性抗体的试剂。这可通过用肽酶如如内切蛋白酶glu-C(Boehringer, Indianapolis, IN)处理纯化或未纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌多肽而实现。另一种方法是用CNBr处理，这样可以从天然脑膜炎奈瑟氏球菌2086多肽中产生肽片段。也可用重组技术来产生2086蛋白的特定片段。
术语“变异体”在这里分别是指不同于参考多核苷酸或多肽但保留实质特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变异体的核苷酸序列与参考多核苷酸不同。变异体核苷酸序列的变化可以改变或不改变参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可导致参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，如下所述。多肽的典型变异体的氨基酸序列不同于参考多肽。通常，差异是有限的，因此参考多肽和变异体的序列总体而言非常类似，且在许多区域是相同的(即生物学等价物)。变异体和参考多肽的氨基酸序列可以不同，这包括一种或多种任何组合的取代、添加、缺失。取代或插入的氨基酸残基可由或不可由遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变异体可以是天然存在的如等位基因变异体，或者可以是非天然存在的变异体。非天然存在的多核苷酸和多肽的变异体可通过诱变技术或通过直接合成制备。“同一性”是本领域已知的，它是指通过序列比较确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在此领域中，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，这可通过在所述序列的链之间进行配对而确定。“同一性”和“相似性”可用已知的方法计算，这些方法包括但不限于以下文献中描述的方法《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology), Lesk, A. M.编，牛津大学出版社，纽约，1988 ; 《生物计算信息学和基因组计划》(Biocomputing: Informatics and Genome Projects),Smith, D. ff.编，学术出版社，纽约，1993 ;《序列数据的计算机分析》(Computer Analysisof Sequence Data),第 I 部分，Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.编，Humana Press,新泽西州，1994 ;《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology),von Heinje, G.,学术出版社，1987 ;和《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer),Gribskov, M.和 Devereux, J.编，M Stockton Press,纽约，1991 ；和 Carillo，H.和Lipman, D.，SIAMJ. AppliedMath. ,48:1073(1988)。优选的确定同一性的方法是要得到测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编成公众可获得的计算机程序。优选的确定两个序列之间同一性和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux, J.等，1984)、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul，S. F.等，1990)。BLASTX 程序可从NCBI 以及其它来源(BLAST手册，Altschul, S.等，NCBI NLM NIH Bethesda,Md. 20894 ；Altschul, S.等，1990)获得。也可用熟知的Smith Waterman算法来确定同一性。例如，但不局限于此，本发明的氨基酸序列可与参考序列一偶数编号的SEQ IDN0S: 2-252相同，即100%相同，或者与参考序列相比可包含一些氨基酸改变,这样同一性百分比就小于100%。这种改变选自至少一种氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代)或插入，其中，所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或这些末端位置之间的任何地方，独立地分散在参考序列的氨基酸中间或在参考序列内的一个或多个毗连基团中。将SEQ ID N0S:2-252的氨基酸总数乘以各自的同一性百分比的分数(除以100)，然后将所述SEQ ID N0S:2-252中任一氨基酸总数减去该结果就可得到给定的同一性百分比的氨基酸改变的数目，或na=xa- (xa y),其中，\是氨基酸改变的数目，xa是SEQ ID NOS:2-252中的氨基酸总数，y是，例如用0. 70表示70%，0. 80表示80%，0. 85表示85%，等等，且其中任何非整数的xa-y的结果在从Xa中减去之前都被减小成最接近的整数。
在优选的实施方案中，上述多肽选自偶数编号的SEQ ID NOS 2_252所列出的蛋白质，如2086蛋白的成熟形式。2086蛋白或等价物等可以是脂质化或非脂质化的。ORF 2086可在带有天然ORF 2086信号序列的大肠杆菌中表达。然而，需要找到改进蛋白质表达的方法。根据本发明的实施方案，前导序列产生蛋白质的脂质化形式。例如，下面描述了使用非典型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)P4蛋白的信号序列以提闻表达。
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细菌脂蛋白的加工以含有信号序列的前体或脂蛋白质(prolipoprotein)的合成开始，该信号序列依次含有共有序列脂蛋白加工/修饰位点。这种脂蛋白质最初通过常规的Sec系统位于革兰氏阴性菌的内膜或革兰氏阳性菌的膜上。一旦通过Sec系统位于膜，所述脂蛋白质就在共有序列位点被信号肽酶II切割，暴露的N-末端半胱氨酸残基被甘油酸化(glycerated)和酸化。Hayashi 等，1990, “细菌中的脂蛋白 ”, J. Bioenerg. Biomembr.Jun ；22(3) :451-71 ;0udega等，1993，“一种小的脂蛋白一细菌素释放蛋白的表达和膜插入所需的大肠杆菌 SecB、SecA 和 SecY 蛋白，，,J. Bacteriol. Mar ； 175 (5) : 1543-7 ；Sankaran等，1995，“细菌脂蛋白的修饰”，Methods Enzymol. 250:683-97。在革兰氏阴性菌中，脂质化蛋白质转运到外膜是由独特的具有膜特异性的ABC转运蛋白系统介导的，这种特异性取决于脂蛋白位置2上的分选信号。Yakushi等，2000, “一种新的ABC转运蛋白介导从膜中分离脂质修饰的蛋白质”，Nat Cell Biol. Apr ；2(4) : 212-8。与细菌脂蛋白及其信号序列融合已被用于在细菌表面展示重组蛋白。美国专利号5，583，038和6，130,085。交换脂蛋白信号序列可增加脂蛋白的产生。De等，2000，“在大肠杆菌中表达的肺炎链球菌棕榈酰化的肺炎球菌性非表面粘附素A的纯化和鉴定”，Vaccine，Mar 6 ；18(17):1811-21。已知蛋白质的细菌脂质化可增加或改变对蛋白质的免疫应答。Erdile等，1993，“附加的脂质在布氏疏螺旋体OspA免疫原性中的作用”，Infect. Immun. Jan ；61 (I) :81-90 ；Snapper等，1995，“在对T细胞依赖型II抗原的体液免疫应答中细菌脂蛋白可替代细胞因子”，J. Immunol. Dec 15 ; 155 (12) : 5582-9。然而，细菌脂蛋白的表达可因加工的严格而复杂化。Pollitt等，1986，“大肠杆菌主要外膜脂蛋白的信号肽切割位点氨基酸取代的效果”，J. Biol. Chem. Feb 5 ；261 (4) : 1835-7 ;Lunn等，1987，“脂蛋白质信号肽突变对大肠杆菌中杂交体前脂-0 -内酰胺酶分泌的作用”，J. Biol. Chem. Jun 15 ；262(17) :8318-24 ；Klein等，1988，“细菌脂蛋白信号序列的特殊性质”，Protein Eng. Apr ;2 (I) : 15-20。细菌脂蛋白的表达也可因其它问题而复杂化，如毒性和低表达水平。Gomez等，1994，“当在大肠杆菌中表达时枯草芽孢杆菌脂蛋白LplA核苷酸使细胞裂解”，Microbiology. Aug ；140 (Pt 8) : 1839-45 ；Hansson等，1995，“截短和全长形式的莱姆病疏螺旋体外表面蛋白A在大肠杆菌中的表达”，Protein Expr. Purif. Feb ；6 (I) : 15-24 ；Yakushi 等，1997, “错误定位的主要外膜脂蛋白和大肠杆菌的肽聚糖之间共价连接的致死率”，J. Bacteriol. May ；179(9):2857-62。非可分型流感嗜血杆菌表达称为P4的脂蛋白(也称为蛋白质“e”)。采用天然P4信号序列P4蛋白的重组形式在大肠杆菌中高度表达。美国专利号5，955，580。当用天然P4信号序列取代大肠杆菌表达载体中的天然ORF 2086信号序列时，0RF2086的表达水平增加。用异源P4信号序列增加表达的概念可延伸到其它细菌脂蛋白。特别地，分析细菌基因组能够鉴定许多可能感兴趣的ORF试图。在异源宿主细胞如大肠杆菌中表达各个带有其天然信号序列的ORF将产生各种使用多种信号序列固有的问题，包括稳定性、相容性等等。为使这些问题最小化，P4信号序列被用来表达各个感兴趣的0RF。如上所述，P4信号序列可改进异源20860RF的表达。通过删除感兴趣的ORF的天然信号序列并将P4信号序列连接到ORF构建了表达载体。然后用表达载体转化、转染或感染合适的宿主细胞，与使用ORF的天然信号序列进行表达相比，ORF的表达增加了。用缺少原始前导序列的蛋白质或是用未指定宿主细胞中脂肪酸酰化位点的部分序列代替的前导序列产生了非脂质化的形式。除非另有说明，本发明2086蛋白的各种形式在这里被称为“2086”蛋白。同样，除非另有说明，“2086多肽”是指2086蛋白以及上述免疫原性部分或其生物学等价物。
用10%_20%梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)测得全长分离和纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌2086蛋白的表观分子量约为28-35kDa。更具体的，用质谱测得这种蛋白质的分子量约为26，000-30, 000道尔顿。优选地，所述2086多肽和编码这种多肽的核酸被用于预防或减轻脑膜炎奈瑟氏球菌和/或其它菌种引起的感染。抗体本发明的蛋白质，包括氨基酸序列SEQ ID N0S:2_252，其片段及其类似物或表达它们的细胞，也被用作免疫原以产生对本发明的多肽免疫特异的抗体。本发明包括免疫特异性多肽的抗体以及使用所述抗体来检测脑膜炎奈瑟氏球菌的存在情况，提供被动保护或测量细胞、细胞或组织提取物、或生物液体中多肽的量或浓度。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和抗独特型抗体。多克隆抗体是来自用抗原免疫的动物血清的不同群体的抗体分子。单克隆抗体是特定抗原的大体均一群体的抗体。单克隆抗体可用精通此领域的技术人员已知的方法获得，例如Kohler和Milstein, 1975,Nature 256:495-497和美国专利号4，376，110。这种抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA, GILD及其任何亚类。嵌合抗体是一种分子，其不同部分来自不同的动物种类，例如那些具有鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体及其生产方法在本领域已知(Cabilly等，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81: 3273-3277 ；Morrison 等，1984, Proc. Natl. Acad.Sci. USA81:6851-6855 ;Boulianne 等，1984，Nature312:643-646 ;Cabilly 等，欧洲专利申请125023 (1984年11月14日公开)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496 (1985年2月19日公开)；Morrison等，欧洲专利申请173494 (1986年3月5日公开)；Neuberger等，PCT申请WO 86/01533 (1986年3月13日公开)；Kudo等，欧洲专利申请184187 (1986年6月11日公开)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开);Sahagan等，1986,J. Immunol. 137:1066-1074 ；Robinson 等，PCT/US86/02269 (1987 年 5 月 7 日公开)；Liu等，1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:3439-3443 ；Sun 等，1987, Proc. Natl. Acad. Sci.USA84:214-218 ;Better 等，1988，Science 240:1041-1043)。在此将其全文并入以供参考。抗独特型(抗-Id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点结合的独特决定子的抗体。抗-Id抗体通过用已制备抗-Id的单克隆抗体免疫作为单克隆抗体来源的相同种类和基因型的动物(如小鼠品系)来制备。被免疫的动物将通过产生这些同种型决定子的抗体(抗-Id抗体)识别并响应免疫抗体的独特型决定子。因此，所产生的抗本发明多肽的单克隆抗体可用于在合适的动物中诱导抗-Id抗体。来自这种免疫小鼠的脾细胞可用于产生分泌抗-Id单克隆抗体的抗-Id杂交瘤。此外，所述抗-Id抗体可与载体 如匙孔纖 血蓝蛋白(KLH)结合以及用于免疫其它BALB/c小鼠。这些小鼠的血清将含有抗-抗-Id抗体，它具有最终对R-PTP酶表位特异的mAb的结合特性。因此可评价这种抗-Id抗体的独特型表位，或与表位结构类似的一些“独特型表位”，如酿脓链球菌(Streptococcus pyogene功多肽。术语“抗体”还包括完整的分子以及片段，如能够结合抗原的Fab片段。Fab片段缺乏完整抗体的Fe片段，能够更迅速地从循环中清除，且与完整抗体相比有更小的非特异性组织结合(Wahl等，1983，J. Nucl.始d 24:316—325)。按照用于完整抗体分子的方法，Fab和用于本发明的其它抗体片段也可用来检测和定量脑膜炎奈瑟氏球菌多肽。本发明的抗体，如抗独特型(“抗-Id”)抗体，可用于在哺乳动物宿主中治疗或预防奈瑟氏球菌属感染的方法，包括给予免疫有效量的抗体，如上所述对多肽特异的抗体。所述抗-Id抗体也可用作“免疫原”以诱导另一动物中的免疫应答，产生所谓抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id可与诱导抗-Id的原始mAb有相同的表位。因此，通过使用mAb的独特型决定子的抗体就可以鉴定表达相同特异性的抗体的其它克隆。抗体被用于多种方法，例如用来确定蛋白质被表达，或用来确定蛋白质在哪里被表达。例如，可将标记的抗体(例如FACS的荧光标记)与完整的细菌一起培养，细菌表面上标记的存在确定了蛋白质的位置。可采用常规方法将多肽或带有表位的片段、类似物或细胞用于动物以获得所产生的抗本发明多肽的抗体。为制备单克隆抗体，可使用任何技术，这些技术可提供由连续细胞系培养物产生的抗体。多核苷酸和本发明的蛋白质一样，本发明的多核苷酸可包含与任何奇数编号的SEQ IDN0S: 1-253的参考序列相同，即100%同一的核酸序列，或者，与参考序列相比，它可包含许多核苷酸改变。这种改变选自至少一种核苷酸缺失、取代(包括转换和颠换)或插入，其中，所述改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或那些末端位置之间的任何地方，独立地分散在参考序列的核苷酸中间或在参考序列的一个或多个毗连基团中。核苷酸改变的数目可将任何奇数编号的SEQ ID N0S: 1-253的核苷酸总数乘以各自的百分比同一性的数字百分比(除以100)来确定，并从所述序列中的所述核苷酸总数减去该乘积。例如，但不限于此，分离的脑膜炎奈瑟氏球菌多核苷酸包含与SEQ ID N0S: 1-253的任何核酸序列、其简并变异体或其片段有至少70%同一性的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列在核酸序列SEQ ID N0S: 1-253的整个多核苷酸区域最多可包含nn个核酸变化，其中nn是最大变化数，它通过以下公式计算nn=xn- (xn y)，其中，Xn是SEQ ID N0S: 1-253中的核酸总数，y的值为0. 70，其中任何非整数的xn y的乘积在从xn中减去之前都被减小到最接近的整数。当然，y也可以是0.80(表示80%) ,0. 85(表示 85%) ,0. 90(表示 90%)、0. 95 (表示 95%)等等。编码包含 SEQ IDNOS: 2-252中任何氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的改变可在此编码序列中产生无义、错义或移码突变，从而改变由经过这种变化的多核苷酸编码的多肽。本发明的一些实施方案涉及编码2086蛋白和抗2086蛋白的抗体的多核苷酸(这里称为“2086多核苷酸”或“0RF2086多核苷酸”)。在优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与选自奇数编号的SEQ ID NOil-SEQ ID N0S: 253之一的核苷酸序列有至少95%同一性的核苷酸序列，其简并变异体或其片段。“简并变异体”在这里指由于遗传密码的简并而与奇数编号的SEQ ID N0S:1-SEQ ID N0S: 253 (及其片段)的核苷酸序列不同的多核苷酸，但它仍编码与奇数编号的SEQ ID N0S: 1-253的核苷酸序列编码的相同的2086蛋白(即偶数编号的SEQ ID NOS:2-252) o在其它实施方案中，所述多核苷酸与选自奇数编号的SEQ ID N0S: 1-253之一的核苷酸序列、其简并变异体或其片段互补。在另一个实施方案中，所述多核苷酸选自DNA、染色体DNA、cDNA和RNA，还可包含异源核苷酸。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸在高严 格杂交条件下与选自SEQ ID N0S: 1-253之一、其补体、其简并变异体或其片段的核苷酸序列杂交。再在其它实施方案中，所述多核苷酸在中等严格杂交条件下发生杂交。所述2086多核苷酸可获自天然、合成或半合成来源；此外，所述核苷酸序列可以是天然产生的序列，或者可以通过突变与这种天然产生的序列发生关系，包括单个或多个碱基取代、缺失、插入和倒位，只要所述核酸分子包含能够作为上述2086免疫原性多肽进行表达的序列。所述核酸分子可以是单链或双链、线性或共价闭合环状形式的RNA、DNA。所述核苷酸序列可包含位于其附近的表达控制序列，这种控制序列通常来自异源来源。通常，本发明核酸序列的重组表达将在所述核酸序列末端使用终止密码子序列，如TAA。本发明还包括能够在降低的严格条件下，更优选在严格条件下，最优选在高严格条件下与这里所述多核苷酸杂交的多核苷酸。严格条件的例子显示在下面的严格条件表中高严格条件是至少和例如条件A-F—样严格的条件；严格条件是至少和例如条件G-L一样严格的条件；降低的严格条件是至少和例如条件M-R —样严格的条件。严格条件一表I
权利要求
1.一种组合物，该组合物含有至少ー种蛋白质，所述蛋白质含有一氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:248,250和252中任一的氨基酸序列具有大于60%的序列同一性。
2.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述至少ー种蛋白质 (a)含有一氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQID NO: 248、250和252中任一的氨基酸序列具有大于90%的序列同一‘注；或 (b)由具有SEQID NO =247,249和251中任一的核酸序列的多核苷酸编码。
3.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述至少ー种蛋白质含有SEQIDNO:248,250和252中任一所示的氨基酸序列。
4.化的或非脂质化的。
5.如权利要求I一 4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述至少ー种蛋白质是重组蛋白质。
6.如权利要求I一 5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、佐剂或载体。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是氢氧化铝或磷酸铝。
8.如权利要求I一 7中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有其它活性免疫原。
9.如权利要求I一 7中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有其它奈瑟氏球菌属免疫原性多肽。
10.如权利要求I一 7中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有至少ー种由奈瑟氏球菌属开放读框(0RF2086)编码的蛋白质，所述开放读框编码交叉反应免疫原性抗原，且所述交叉反应免疫原性抗原为患者提供针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B引起的感染的免疫原性。
11.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述由奈瑟氏球菌属开放读框0RF2086编码的至少ー种蛋白质属于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的亚科A。
12.如权利要求I一 11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有至少ー种PorA、PorB、运铁结合蛋白或混池蛋白或至少ー种额外的奈瑟氏球菌属表面抗原,所述额外的编码抗原是非-0RF2086蛋白质。
13.如权利要求I一 12中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有多糖。
14.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQ ID N0:247、249和251中的任一核苷酸序列具有至少90%的同一‘注。
15.—种组合物，该组合物含有 (a)至少ー种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少ー种含有SEQID N0:248、250和252中的任一氨基酸序列的蛋白质；或 (b)至少ー种多核苷酸,所述多核苷酸在严格条件下与(a)所述的任一多核苷酸杂交。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述至少ー种多核苷酸含有SEQIDNO:247,249和251中任一所示的核酸序列。
17.一种组合物，该组合物含有至少ー种抗体，所述抗体与含有SEQ ID N0:248、250和252中的任一氨基酸序列的蛋白质免疫特异性结合。
18.—种载体，该载体含有具有启动子序列和起始密码子序列的表达控制序列以及编码SEQ ID NO:248,250和252中的任一多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于3’至启动子和起始密码子序列。
19.ー种宿主细胞,该细胞含有权利要求18所述的载体。
20.一种转化的、转染的或感染的细胞系，含有表达ー种核酸序列的重组细胞，所述核酸序列编码至少ー种含有SEQ ID NO:248、250和252中的任一氨基酸序列的多肽。
21.—种制备组合物的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码至少ー种蛋白质的核酸序列，所述至少ー种蛋白质含有SEQ ID N0:248、250和252中的任一氨基酸序列。
22.权利要求I一 17中任一项所述的组合物，用作药物。
23.权利要求I一 17中任一项所述的组合物在制备在哺乳动物中诱导免疫应答或减轻或预防人中脑膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的药物中的用途。
全文摘要
一种预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物。本发明涉及奈瑟球菌属ORF2086蛋白、交叉反应免疫原性蛋白，可从奈瑟氏球菌属菌株分离或用重组方法制备，包括其免疫原性部分、其生物学等价物、免疫特异性结合上述蛋白质的抗体以及编码上述蛋白质的核酸序列，以及在有效对抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B感染的免疫原性组合物中的应用。
文档编号A61K39/395GK102755631SQ201210211368
公开日2012年10月31日 申请日期2002年10月11日 优先权日2001年10月11日
发明者B·J·麦特卡尔夫, G·W·泽洛特尼克, J·法利, L·A·伯恩非尔德, L·D·弗莱切, R·J·扎古斯基 申请人:惠氏控股有限公司