专利名称：一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料fret靶向复合探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学及药物交叉领域，特别是一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针。
背景技术：
癌症是一类严重危害人类健康的重大疾病，在对癌症患者的治疗过程中，化学药物治疗是对癌症患者手术后彻底杀灭体内癌细胞的有效方法。但抗癌药在抑制或杀灭肿瘤癌细胞的同时，对机体内的某些正常器官细胞，如骨髓造血细胞、消化道粘膜上皮细胞和生殖细胞等同样造成严重伤害，并且对某些组织器官如肝、肾、心、肺等也造成严重损害，影响到癌症患者的治愈效果和生活质量。同时，传统的抗癌药对实体瘤治疗疗效评价方法一般采用治疗前后肿瘤最长径尺 度变化评价疾病的发展情况。通过胸部X片(适用于肺部)，计算机断层扫描(CT )及核磁共振成像(MRI)，超声波检查(适用于体表或浅层，不适合腹腔)，内窥镜及腹腔镜，肿瘤标记，细胞学及组织学检查等手段实现。这些方法是肿瘤变化过程中的一种状态的静态刻画，难于原位实时评价抗癌药对患者肿瘤变化情况及抗癌药与癌病灶作用过程的动力学，对化疗药物与癌病灶的作用程度和药效评价具有一定的滞后性。向肿瘤癌细胞病灶靶向投递药物是有效治疗癌症的有效方法之一，它可克服化学药物治疗所带来的副作用。这一系统可将药物最大限度地运送到靶区，使药物在靶区浓集，可超出普通试剂的数倍乃至数百倍，直接作用于病变组织、器官和细胞，延长药物与靶部位的作用时间，治疗效果明显提高；同时可减少药物用量，降低了药物在其他部位的浓度，达到高效低毒的治疗效果。而在众多实体瘤治疗疗效评价方法中，荧光探针法较传统的同位素检测法相比，表现出速度快、重复性好、用量少及无辐射等优点，在疾病诊断、抗癌药分析、抗体免疫分析等方面已经得到广泛应用。与叶酸分子偶联的荧光体通过叶酸受体的特异性作用进入肿瘤细胞，使肿瘤组织明显区别于临近正常组织。与放射成像技术相比，荧光成像无创伤，也使人体免受粒子辐射。研究如何将肿瘤癌细胞病灶靶向药物投递系统和荧光探针技术有机结合，同时实现抗癌药对癌病灶的靶向投递和抗癌药在机体内的传输过程以及与癌细胞作用的原位信息传感，对实现化疗药与癌细胞作用的电子输运本质规律的揭示、药效评价、提高化疗药疗效并减少患者正常组织损伤均具有重要意义。荧光共振能量转移(FRET)是一种新型荧光研究方法，由于FRET对于距离和荧光基团的空间取向高度灵敏，可以通过FRET效率的测量，观察生物分子间相互作用的改变情况，反应两分子团的距离信息。从理论上讲，在分子水平上研究任何生物学机制都可以通过FRET技术，关键在于找到合适的荧光探针。阿霉素是治疗乳腺癌等癌症的广谱化疗药，药物本身具有一定的突光强度，表现出一定的突光表达特性，其激发波长为490nm,发射波长为545nm。但是，由于其荧光量子产率低，荧光强度不高，不具有同时实现抗癌药效和与癌细胞作用的荧光原位表达特性。因而，将适当波长的荧光染料与具有荧光特性的阿霉素耦合在叶酸修饰的载体上，利用抗癌药与荧光染料之间的FRET特性研究，可实现在阿霉素杀灭癌细胞的同时，实时荧光表达癌细胞作用形态，实现阿霉素与肿瘤癌细胞作用过程及药物疗效原位影像评价。
发明内容
本发明的目的提供壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，该探针将具有一定波长的有机荧光染料与抗癌药阿霉素相耦合，形成具有荧光共振能量转移(FRET)特性的复合结构，在紫外光或可见光量激发下表达FRET特性的复合探针。采用叶酸对该探针进行修饰构建成一种靶向作用于肿瘤癌细胞的阿霉素-有机荧光染料FRET复合探针。利用叶酸-受体的介导作用实现该探针对肿瘤癌细胞靶向投递作用，利用探针的FRET特性，通过对探针与癌病灶相互作用过程中，FRET现象结构变化信息的监控，实现探针与肿瘤癌细胞的相互作用过程的原位影像评价特性。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，其中该复合探针包括有叶酸修饰壳聚糖、有机荧光染料和抗癌药阿霉素；所述有机荧光染料为具有一定波长，并能与抗癌药阿霉素相耦合，形成具有荧·光共振能量转移(FRET)特性的复合探针结构，在紫外光或可见光激发下，能有效地产生振荡偶极子，并与阿霉素的偶极子产生共振，通过偶极子与偶极子之间的相互作用将能量非放射性地转移到阿霉素上而表达FRET特性的一类有机荧光染料。本发明的效果为I.本发明一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，构建了阿霉素-有机荧光染料FRET复合探针结构，有机荧光染料的能量转移到阿霉素上，阿霉素的荧光强度增强，使其具有与癌细胞作用的荧光原位表达特性。2.本发明一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，通过叶酸-受体介导作用靶向投递至肿瘤癌细胞并对其进行染色，根据荧光行为观察复合探针在肿瘤癌细胞各区域的作用过程及分布规律；在阿霉素释放并与肿瘤癌细胞作用过程中，复合探针的FRET复合结构发生变化，通过复合探针荧光强度变化大小和荧光强度变化速率等信息的实时监控，可实现阿霉素与肿瘤癌细胞作用过程的原位影像评价。
图I为本发明的复合探针的组成结构及作用示意图。图中I、壳聚糖 2、有机荧光染料 3、叶酸 4、阿霉素5、肿瘤癌细胞6、药物释放过程
具体实施例方式结合附图对本发明的一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针结构及作用过程加以说明。本发明的一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，该复合探针包括有叶酸修饰壳聚糖、有机荧光染料和抗癌药阿霉素；所述有机荧光染料为具有一定波长，并能与抗癌药阿霉素相耦合，形成具有荧光共振能量转移(FRET)特性的复合探针结构，并在紫外光或可见光激发下能表达FRET特性的一类有机荧光染料。所述复合探针结构在紫外光或可见光激发下，有机荧光染料会有效地产生振荡偶极子，与阿霉素的偶极子产生共振，通过偶极子与偶极子之间的相互作用将有机荧光染料的能量非放射性地转移到阿霉素上，表达FRET特性，增强阿霉素荧光强度。所述壳聚糖为两亲性壳聚糖，其分子量为200(T4000。所述FRET复合结构中，有机荧光染料为能量供体，阿霉素为能量受体。有机荧光染料的发射波长为48(T500nm。如图I所示，本发明所涉及的一种壳 聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针功能是这样实现的本发明的一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，该探针由抗癌药阿霉素4、有机荧光染料2和叶酸3修饰的壳聚糖I构成。所选抗癌药阿霉素4是一种广谱化疗药，其激发波长为490nm，发射波长为545nm ;所选有机荧光染料2为具有一定波长，能与阿霉素4形成具有荧光共振能量转移FRET复合结构，并在紫外光或可见光激发下能表达FRET特性；所选叶酸3修饰的壳聚糖I为两亲性壳聚糖，其分子量大小为200(T4000 ;有机荧光染料2通过键合的方式接于壳聚糖I表面，阿霉素4通过包裹方式组装在壳聚糖I内部。将具有一定波长的有机荧光染料2与抗癌药阿霉素4耦合，使有机荧光染料2的发射波长与阿霉素的激发波长相匹配，形成具有荧光共振能量转移FRET复合结构。在紫外光或可见光激发下，有机荧光染料会有效地产生振荡偶极子，与阿霉素的偶极子产生共振，通过偶极子与偶极子之间的相互作用将有机荧光染料的能量非放射性地转移到阿霉素上，表达FRET特性，增强阿霉素荧光强度。该探针载体选择为壳聚糖1，壳聚糖为两亲性并用叶酸3进行了修饰。利用叶酸-受体的介导作用实现该探针对肿瘤癌细胞5靶向投递作用；利用该复合探针的FRET特性，通过对探针与癌病灶相互作用过程中，FRET现象结构变化信息的监控，实现复合探针与肿瘤癌细胞5的相互作用过程的原位影像评价特性。构建的壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针进入活体组织后，通过叶酸-受体的介导作用运输至肿瘤癌细胞5的细胞膜上，壳聚糖I本身所带的正电荷与肿瘤癌细胞5的细胞膜上负电荷结合，形成内涵体，通过细胞的内吞作用进入肿瘤癌细胞5细胞浆中，ATP酶驱动的质子泵将质子转运进入内涵体，使内涵体表面呈酸性，pH值约为5，壳聚糖I构型发生变化，抗癌药阿霉素4得到释放，并作用于细胞核而发挥药效。在这一过程中，复合探针的FRET荧光特性表达可对肿瘤癌细胞5进行染色，通过荧光行为变化可观察复合探针在肿瘤癌细胞5的细胞膜、细胞浆、细胞核中作用过程及分布规律。在药物释放过程6中，由于FRET靶向复合探针对于距离和荧光基团的空间取向具有高度敏感性，阿霉素4与有机荧光染料2之间的距离变大(>10nm)，复合探针的FRET体系发生变化，其表达的荧光强度发生变化，通过荧光强度变化速率和荧光强度变化大小的实时监控，实现肿瘤癌细胞5的变化情况、阿霉素4与肿瘤癌细胞5作用过程和阿霉素4治疗疗效的原位影像评价。所述肿瘤癌细胞5为细胞膜上能表面高度表达叶酸受体的肿瘤癌细胞，如卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、鼻咽癌细胞。实施例I)用PEG和长链酸酐对壳聚糖进行改性，使其具有双亲性。用叶酸3对其进行修饰，并在其表面通过键合的方式接上发射波长在48(T500nm之间的吲哚咔唑类染料，最后包裹抗癌药阿霉素，组成阿霉素-吲哚咔唑类染料FRET靶向复合探针，其中阿霉素为能量供体，吲哚咔唑类染料为能量受体。用其治疗老鼠体内的肿瘤细胞发现，探针能够选择性地标记进入肿瘤细胞，其荧光图像清晰，随着阿霉素药效在肿瘤癌细胞内的发挥，复合探针的荧光强度逐渐下降。当阿霉素全部释放并发挥药效后，荧光强度下降309^50%，变化明显。 根据复合荧光强度的变化情况，很好地跟踪了阿霉素与肿瘤细胞的作用过程，实现了原位影像评价功能。
权利要求
1.一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，其特征是该复合探针包括有叶酸修饰壳聚糖、有机荧光染料和抗癌药阿霉素； 所述有机荧光染料为具有一定波长，并能与抗癌药阿霉素相耦合，形成具有荧光共振能量转移(FRET)特性的复合探针结构，在紫外光或可见光激发下，能有效地产生振荡偶极子，并与阿霉素的偶极子产生共振，通过偶极子与偶极子之间的相互作用将能量非放射性地转移到阿霉素上而表达FRET特性的一类有机荧光染料。
2.根据权利要求I所述一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，其特征是所述壳聚糖为两亲性壳聚糖，其分子量为200(T4000。
3.根据权利要求I所述一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，其特征是所述有机荧光染料的发射波长为48(T500nm。
全文摘要
本发明提供一种壳聚糖支载阿霉素-有机荧光染料FRET靶向复合探针，该探针将具有一定波长的有机荧光染料与抗癌药阿霉素相耦合壳聚糖上，形成具有荧光共振能量转移特性的复合结构，并在紫外光或可见光激发下表达FRET特性的荧光探针。有益效果是通过该复合探针结构的构建，将有机荧光染料的能量转移到阿霉素上，增强阿霉素的荧光强度，使其具有与癌细胞作用的荧光原位表达特性。通过复合探针靶向投递过程中荧光行为观察复合探针在肿瘤癌细胞各区域的作用过程及分布规律；在阿霉素释放并与肿瘤癌细胞作用过程中，通过复合探针荧光强度变化大小和荧光强度变化速率等信息的实时监控，可实现阿霉素与肿瘤癌细胞作用过程和药物疗效的原位影像评价。
文档编号A61K49/00GK102716502SQ20121021680
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者张宝莲, 曹凌云, 谷迎春, 费学宁 申请人:天津城市建设学院