一种载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球及其制备方法和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明设计一种载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球及其制备方法和以 其为活性成分的药物组合物应用。
【背景技术】：
[0002] 烧伤是目前所有疾病中痛苦最大、治疗难度最高的疾病之一。目前在烧伤治疗领 域占有统治地位的治疗体系是以促进创面干燥结痂，再进行切痂植皮的局部治疗，结合抗 休克、抗感染、营养支持等全身治疗。这种治疗方法大大降低了大面积烧伤的死亡率，但存 在着患者痛苦大、瘢痕发生率高、医疗费用高等严重的弊端。因此，寻找新的治疗方法和药 物有着积极意义。在烧伤等所导致的皮肤严重缺损及创面的愈合中，以适宜的敷料(含药或 不含药）对创面进行迅速覆盖是非常重要的，可以起到减少创面的体液和蛋白质流失，防止 细菌感染及继发的组织损伤的作用，在某些情况下，还可为增殖细胞提供支架，促进创面愈 合。最近20年来，这已成为严重烧伤等创伤修复领域的研究热点方向。
[0003] 表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF)是创伤修复中涉及的多种生长因 子之一。已有的研究表明，EGF是多种细胞分裂增殖的刺激原，可以促进创面细胞迁移，使 肉芽组织生长加快，肉芽内DNA、RNA、胶原纤维、透明质酸等成分增多。EGF能够刺激创伤愈 合所依赖的角蛋白细胞的增殖和迁移。动物和临床研究均表明，EGF可以明显促进创面愈 合，尤其对一些难愈合创面作用更佳。国内外已有的EGF给药系统包括软膏、喷雾剂、注射 剂及缓控释系统等。由于表皮生长因子的半衰期短，在创伤面其与细胞的接触时间较短，而 且加上其本身的不稳定性和创面存在的蛋白酶的降解作用，往往会使表皮生长因子失活较 快，实际作用时间有限。因此，临床上采用多次给药的方式，但这样不利于患者的顺应性又 增加了经济负担。而由多孔可降解基质包封表皮生长因子形成的微球，既可达到表皮生长 因子的持续释放，刺激创面细胞增殖，又可为增殖细胞提供吸附介质，是表皮生长因子给药 系统的首选。
[0004] 目前制备蛋白或多肽类药物的缓释微球的方法有乳化溶剂挥发法、交联聚合法、 喷雾干燥法等。对于乳化溶剂挥发法、交联聚合法，在制备时需用到有机溶剂或者交联剂， 一方面会造成环境污染，另一方面成品中存在有机溶剂或者交联剂残留。喷雾干燥法虽然 可以不使用有机溶剂，但是干燥温度一般较高，易引起蛋白或多肽药物变性。
[0005] 壳聚糖和透明质酸都为天然可降解高分子材料，均具有良好的生物相容性，因此 常被用于制备各种给药系统的载体。在烧伤早期外敷壳聚糖粉末，能够阻止烧伤早期的损 伤加重，对烧伤创面组织有显著的保护作用，能够明显减轻甚至逆转损伤程度。以透明质 酸配以适量辅料制成的散剂能够吸收烧伤创面渗出液，有效地保护、封闭创面，减轻创面水 肿，具有抑制疤痕组织形成及促进烧伤创面愈合的功能。
【发明内容】
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[0006] 本发明提供一种环保、简便的表皮生长因子缓释微球制备方法，制备的载有表皮 生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，可实现表皮生长因子在烧烫伤创面的持续释放，促进 创面细胞增殖，同时也发挥玻璃酸钠和壳聚糖对烧烫伤组织的保护作用及促创伤愈合作 用，并为创面增殖细胞提供支架，从而获得一种良好的烧烫伤治疗药物。
[0007] 本发明所提供的载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，通过在保护剂作用 下离子聚合、离心沉淀、纯化、冻干而得，具体制备方法如下：
[0008] ( 1)将透明质酸、三聚磷酸钠、表皮生长因子溶解于水中。
[0009] (2)将壳聚糖溶解于水中。
[0010] (3)将步骤（1)和步骤（2)中得到的溶液进行搅拌混合，得到含有透明质酸-壳聚 糖微球的混悬液。
[0011] (4)将上述步骤（3)中得到的混悬液离心，弃去上清液，收集沉淀。
[0012] (5)将上述步骤（4)得到的沉淀加入纯化水，振摇分散。
[0013] (6)将上述步骤（5)得到的混悬液离心，弃去上清液，收集沉淀。
[0014] (7)将沉淀冻干除去水分，得成品。
[0015] 所述的载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，表皮生长因子在微球中的质 量百分比为0. 01%~10%。
[0016] 所述的载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，透明质酸和壳聚糖的质量比 例为透明质酸：壳聚糖=1:3~1:9。
[0017] 所述的载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，壳聚糖具有分子量低、脱乙 酰度高的特点。
[0018] 所述的载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，壳聚糖的脱乙酰度大于70%， 优选80%~95%。
[0019] 所述的载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，壳聚糖的平均相对分子质量 小于0.2父10 6，优选小于0.1父106。
[0020] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（1)中的透明 质酸浓度为〇· lmg/ml~0· 5mg/ml。
[0021] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（1)中的三聚 憐酸钠浓度为〇· 〇lmg/ml~0· lmg/ml。
[0022] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（2)中的壳聚 糖浓度为 〇· 5mg/ml ~3. Omg/ml。
[0023] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（3)中的两种 溶液的混合体积比例为步骤（1)得到的溶液：步骤（2)中得到的溶液=1:0. 5~1:2。
[0024] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（3)中的两 种溶液的加入顺序为将步骤（1)得到的溶液加入到步骤（2)中得到的溶液，加入时间为 IOmin ~30min〇
[0025] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（3)中的两种 溶液的搅拌混合时间为IOmin~60min，混合转速为60转/分钟~1000转/分钟，混合温 度为室温。
[0026] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（4)和步骤（6) 中的离心过程中离心力为5000g~20000g。
[0027] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（4)和步骤（6) 中的离心时间为15min~60min。
[0028] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（5)中加入纯 化水的数量为步骤（4)中收集沉淀质量的10倍~50倍。
[0029] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（5)和步骤（6) 中的目的为纯化所得透明质酸-壳聚糖微球，去除未反应的底物。
[0030] 所述载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备方法，步骤（5)和步骤（6) 中可重复操作2次~4次。
[0031] 本发明的以载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的药物组合物均为外用 制剂，一般为凝胶剂、膜剂、粉末剂和软膏剂等，均为采用常规辅料和常规方法制备而得。本 发明的以载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的药物组合物，也可以与其他药物组 合形成复方制剂。
[0032] 本发明的以载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的药物组合物，制成烧烫 伤药物制剂施用于烧烫伤创面，表皮生长因子可缓慢持续的释放，达到保护创面、加快愈 合速度、改善愈合质量等目的，从而获得一种良好的烧烫伤治疗药物。
【具体实施方式】：
[0033] 以下通过具体实施例对本发明加以详细说明：
[0034] 实施例1 :
[0035] 载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球的制备
[0036] (1)将分别将透明质酸(平均相对分子质量0. 12X106)0. 2g、三聚磷酸钠0. 05g、 表皮生长因子0.1 g溶解于1000ml纯化中。
[0037] (2)将壳聚糖(平均相对分子质量0.08X 106,脱乙酰度88%) I. 2g溶解于1000 ml 纯化水中。
[0038] (3)将步骤（1)得到的溶液加入到步骤（2)得到的溶液中并用电磁搅拌器不断搅 拌混合，加入速度50ml/min，加入时间20min，搅拌转速：300转/min,搅拌时间30min，得到 含有透明质酸-壳聚糖微球的混悬液。
[0039] (4)将上述步骤（3)中得到的混悬液离心，离心力1000 Og,离心时间30min ;弃去上 清液，收集沉淀。
[0040] (5)将上述步骤（4)得到的沉淀加入到纯化水中，纯化水的质量为沉淀的30倍，并 用振荡器将其振摇分散。
[0041] (6)将上述步骤（5)得到的混悬液离心，离心力1000 Og,离心时间30min ;弃去上清 液，收集沉淀。
[0042] (7)将沉淀冻干除去水分，得成品。
[0043] 实施例2 :
[0044] 载有