专利名称：佐剂配制的包含细胞因子诱导剂的流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于用佐剂配制疫苗来提供保护以抵御流感病毒感染的领域。
背景技术：
目前常规使用的流感疫苗一般不含佐剂。参考文献I的第17和18章详细描述了这些疫苗。它们基于活病毒或灭活的病毒，灭活疫苗可以基于完整的病毒、“裂解(split)” 病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)。血凝素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考HA水平标准化疫苗剂量，疫苗通常含有约15 μ gHA/毒株。流感爆发期需要大量流感疫苗，但难以增加疫苗供应从而满足如此巨大的需求。因此，除了生产更多疫苗抗原，有人提出可以使用较低含量的抗原/毒株，同时使用佐剂来弥补减少的抗原剂量。还有人提出在流行间期采用相同的方案，从而例如能覆盖更多人群而无需提高生产水平。有人提出可将铝盐佐剂用于流感疫苗(例如，见参考文献2-5)。利用MF59水包油乳液也已见报道[6]，希龙疫苗公司(Chiron Vaccines)的商品化FLUAD 产品中也用了该乳液。本发明的目的是提供佐剂配制的其它改进流感疫苗(对于流行期和流行间期使用)和它们的制备方法。
发明内容
现已发现虽然水包油乳液是流感疫苗的优良佐剂，但仍可通过额外加入一种或多种其它免疫刺激剂来提高它们的效率。所述其它试剂不仅增加血凝滴度或抗-血凝素ELISA滴度(二者衡量免疫应答的数量)，其还起到提高应答质量的作用。具体地说，现已发现所述其它试剂能改善流感疫苗引发的细胞因子应答，例如干扰素-Y应答，改善水平远胜于只使用佐剂或该试剂时所见的。已知细胞因子应答涉及宿主抵御流感(病毒)感染的防御早期和决定阶段[7]。因此，本发明提供包含⑴流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；和(iii)细胞因子诱导剂的免疫原性组合物。本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；和(iii)细胞因子诱导剂的步骤。本发明提供装有以下组分的试剂盒(i)包含流感病毒抗原的第一试剂盒组分；和(ii)包含水包油乳液佐剂的第二试剂盒组分，其中(a)所述第一组分和所述第二组分包含细胞因子诱导剂，或(b)所述试剂盒装有包含细胞因子诱导剂的第三试剂盒组分。
水包油乳液佐剂已发现水包油乳液特别适用于佐剂配制的流感病毒疫苗中。已知各种这样的乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中一种或多种油和一种或多种表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴通常直径低于5 μ m，甚至可具有亚微米直径，用微流化仪可实现这些小尺寸，从而能提供稳定的乳液。优选尺寸小于220nm的油滴，因为能对它们进行过 滤灭菌。本发明可使用诸如动物来源(例如鱼)或植物来源的油。植物油来源包括坚果、种子和谷物。坚果油的例子是最常购得的花生油、大豆油、椰油和橄榄油。例如，可利用从霍霍巴豆(jojoba bean)获得的霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易购得的，但其它谷物如小麦、燕麦、黑麦、大米、画眉草(teff)、黑小麦等的油也可利用。通过水解、分离和酯化合适的坚果和种子油起始物质可制备种子油中天然不存在的甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于实施本发明。本领域熟知从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其它方法。大多数鱼含有不难回收的可代谢油。例如，本发明可用的几种鱼油的例子是鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油，如鲸蜡。可以5-碳异戊二烯单位通过生物化学方法合成许多支链油，这些支链油通常称为类萜。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10, 14, 18，22-二十四己烯(tetracosahexaene))的支链不饱和类職,这是本发明特别优选的。角鲨烷是角鲨烯的饱和类似物，其也是优选的油。包含角鲨烯和角鲨烷的鱼油不难从商业来源购得，或可通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可利用油的混合物。可根据表面活性剂的“HLB” (亲水/亲油平衡)将其分类。优选的本发明表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。本发明可用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80 ;环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以D0WFAX 为商品名出售，例如线形Ε0/Ρ0嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基团数目可能不同的辛苯聚醇，其中特别感兴趣的是辛苯聚醇_9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，例如磷脂酰聚胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如Tergit0lTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙烯乙二醇单月桂基醚(triethyleneglycol monoIauryI ether) (Brij30);聚氧乙烯-9-月桂基醚；和失水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中所含的优选表面活性剂是吐温80 (聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可利用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也适用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性剂的优选用量(重量％)是聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐温80)0. 01-1%，特别是约0. 1% ;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100或曲通系列的其它洗涤剂)0. 001-0. 1%，特别是O. 005-0. 02% ;聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0. 1-20%,优选O. 1_10%，特别是O. 1-1%或约O. 5%。本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于 角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。以体积计，所述乳液的组成可以是约5%角鲨烯，约O. 5%聚山梨醇酯80和约O. 5%司盘85。以重量计，这些比例可以是4. 3%角鲨烯，O. 5%聚山梨醇酯80和O. 48%司盘85。该佐剂称为“MF59” [8_10]，如参考文献11的第10章和参考文献12的第12章所详述的。MF59乳液优选包含柠檬酸离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲液。 角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸缓冲盐 水。其还可包含司盘85 (例如，1%)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10%角鲨烯、2-10%生育酚和O. 3-3%吐温80，角鲨烯生育酚的重量比优选彡1，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5:2。可将吐温80溶解于PBS中获得2%的溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳液。得到的乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180nm。 角鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸缓冲液。 含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液所包含的这三种组分的质量比约为75:11:10(例如，750 μ g/ml 聚山梨醇酯 80，110 μ g/ml 曲通 X-100 和 100 μ g/ml α -生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括这些组分与抗原的任何比例。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。水相可含有磷酸缓冲液。 角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(〃PluroniCTML121 ")的乳液。可以用磷酸缓冲盐水，PH7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用"SAF-I"佐剂(O. 05-l%Thr-MDP、5% 角鲨烯烷、2. 5%Pluronic L121 和 O. 2% 聚山梨醇酯 80)配制的苏氨酰-MDP联用[13]。也可不与Thr-MDP联用，例如用"AF "佐剂(5%角鲨烷、
I.25%PluronicL121和O. 2%聚山梨醇酯80)配制[14]。优选微流体化。 乳液可具有O. 5-50%的油、O. 1-10%磷脂和O. 05_5%非离子表面活性剂。如参考文献15所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。 不可代谢的油(例如，轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如，卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(例如，参考文献16所述的GPI-0100，)、二甲基二(十八烷基)溴化铵和/或N，N- 二(十八烷基)-N，N- 二(2-羟乙基)丙二胺。 其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，胆固醇)结合成螺旋状胶束的乳液[17]。 包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[18]。 包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[18]。
这些乳液优选在递送之时与抗原临时混合。因此，在包装或分发的疫苗中，佐剂和抗原通常分开存放，最后在使用时即时配制。抗原一般存在水性形式，从而最终可通过混合两种液体来制备疫苗。用于混合的两种液体的体积比可以不同(例如，在5:1和1:5之间)，但通常是约1:1。抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常维持在水溶液中，但其自身可能分配在油/水界面附近。进入乳液的油相的血凝素通常极少(如果有的话)。如果组合物包含生育酚，α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚均可用，但优选α -生育酚。生育酚可采取几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚均可用。老年患者(例如，60岁或更大)所用的疫苗中优选包含生育酚，因为据报道维生素E在该患者组中对免疫应答有正面影响。它们还具有抗氧化特性，从而有助于稳定溶液[21]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。现已发现琥珀酸盐在体内能与TNF-相关的配体协作。此外，已知α-生育酚琥珀酸盐与流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐剂[88]。 细胞因子诱导剂本发明组合物可包含细胞因子诱导剂，现已发现该试剂与水包油乳液混合能得到出乎意料有效的免疫原性组合物，对T细胞应答有协同作用。有报道说，就耐受流感病毒抗原性漂移而言，T细胞应答优于抗体应答。此外，T细胞效应机理可能是老年患者中疫苗诱导抵御严重疾病的保护作用的重要决定因素[22]，还可能通过更强的干扰素-Y应答来降低对流感的年龄相关易感性[23]。给予患者时，本发明组合物中所包含的细胞因子诱导剂能引发免疫系统释放细胞因子，包括干扰素和白介素。优选的细胞因子诱导剂能引发以下一种或多种细胞因子的释放干扰素-Y ;白介素-I ;白介素-2 ;白介素-12 ;TNF-a JNF-β ;和GM-CSF。优选的细胞因子诱导剂引发与Th-I型免疫应答有关的细胞因子释放，例如干扰素-Y、TNF_ a、白介素-2。优选刺激干扰素-Y和白介素_2。因此，接受本发明组合物使得患者的T细胞在用流感抗原刺激时能以抗原特异性方式释放所需细胞因子。例如，从他们的血液纯化的T细胞在体外接触流感病毒血凝素时会释放Y-干扰素。本领域已知检测外周血单核的细胞(PBMC)中这种应答的方法，包括ELISA、ELISP0T、流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献24报道了一项研究，该项研究监测了针对破伤风类毒素的抗原特异性T细胞介导免疫应答，特别是Y -干扰素应答，发现ELISP0T是区分抗原特异性TT诱导应答与自发应答的最灵敏方法，但采用流式细胞术检测胞质内细胞因子是检测再刺激作用(re-stimulating effect)的最有效方法。合适的细胞因子诱导剂包括但不限于 免疫刺激性寡核苷酸，例如含CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA，或含回文序列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸。· 3-0-脱酰基单磷酰脂质 A ( “3dMPL”，也称为 “MPL ” ) [25-28]。 咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特(“R837”)[29、30]、瑞喹莫德(“R-848”)和它们的类似物；和它们的盐(例如，盐酸盐)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它细节见参考文献32-36。
缩氨基硫脲化合物，例如参考文献37披露的那些。参考文献37还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。 色胺酮化合物，例如参考文献38披露的那些。参考文献38还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。 核苷类似物，例如(a)艾沙托拉滨(Isatorabine) (ANA-245 ;7_硫杂_8_氧代鸟
苷)及其前药
N N lJj
o^°iH
H
OO(b) ΑΝΑ975 ； (c) ANA-025-1 ； (d) ANA380 ； (e)参考文献 39-41 所述的化合物；(f)下
式所示化合物
R1
JL
R2-^N R4
Ra式中R1和R2各自独立为H、卤素、_NRaRb、-OH、C1^6烷氧基、取代的C^6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C6_10芳基、取代的c6_1(l芳基、CV6烷基或取代的Cu烷基；R3不存在，或是H、CV6烷基、取代的Cu烷基、C6_10芳基、取代的C6,芳基、杂环基或取代的杂环基；R4和R5各自独立为H、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C (O) -RdX1^6烷基、取代的C1^
烧基，或结合在一起形成5元环，如R4_5
)尸rS
Kf 在_ 所示键处实现结合。X1和X2各自独立为N、C、O或S ;R8 是 H、卤素、-OHXh 烷基、C2_6 烯基、C2_6 炔基、_0H、-NRaRb、-(CH2)n-O-Rc'-0-((^烧基)、-S (O) pRe 或-C (O) -Rd ；R9是H、CV6烷基、取代的Cu烷基、杂环基、取代的杂环基或R9a，其中R9a是
R1fl R”
在^所示键处实现结合。R10和R11各自独立为H、卤素、CV6烷氧基、取代的Cu烷氧基、-NRaRb或-OH ；Ra和Rb各自独立为H、C1^6烷基、取代的Cp6烷基、-C (O) Rd、C6_10芳基；Rc各自独立为H、憐酸酷基、_■憐酸酷基、二憐酸酷基、CV6烧基或取代的Cu烧基；Rd各自独立为H、齒素、C1^烧基、取代的Cu烧基、C1^烧氧基、取代的CV6烧氧基、-NH2、-NH((V6烷基)、-NH(取代的C1^烷基)、-N(C1^6烷基)2、-N(取代的C^6烷基)2、C6,芳基或杂环基；Re各自独立为H、(V6烷基、取代的Cu烷基、C6,芳基、取代的C6_1(l芳基、杂环基或取代的杂环基；Rf各自独立地为H、C1^6烷基、取代的Cp6烷基、-C(O) Rd、磷酸酯基、二磷酸酯基或
三磷酸酯基；η各自独立为0、1、2或3 ;P各自独立为0、1或2 ;或者(g) (a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或该互变异构体的药学上可接受的盐。籲罗唑利宾(Loxoribine) (7_烯丙基_8_氧代鸟苷)[42]。 参考文献43披露的化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮(Indoledione)化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮(Benzocyclodione)化合物、氨基氮杂乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(Aminobenzimidazole quinolinone)(ABIQ)化合物[44、45]、轻邻苯二甲酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异曙唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(Quinazilinone)化合物、批咯化合物[46]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、卩比唑卩密唳(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮却(Benzazole)化合物[47]。· polyoxidonium聚合物[48、49]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。 参考文献50披露的化合物。 式I、II或III所示化合物，或它们的盐
权利要求
1.一种免疫原性组合物，其包含(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；(iii)细胞因子诱导剂，其中细胞因子诱导剂是人TLR4的激动剂。
2.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述流感病毒抗原 (a)是灭活病毒；或 (2)包含完整的病毒、裂解病毒或纯化的表面抗原。
3.如权利要求I或2所述的组合物，其特征在于，所述流感病毒是从 (a)用卵培养的流感病毒；或 (b)从用细胞培养物培养的流感病毒制备的。
4.如权利要求1、2或3任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物 (a)不含卵白蛋白、卵类黏蛋白和鸡DNA;和/或 (b)包含少于IOng细胞培养宿主的细胞DNA;和/或 (c)包含的100个核苷酸或更长的DNA少于10ng。
5.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于， (a)从具有A/PR/8/34流感病毒一个或多个RNA区段的流感病毒制备所述流感病毒抗原；和/或 (b)从通过反向遗传学技术获得的流感病毒制备所述流感病毒抗原。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其特征在于，所述细胞培养物是 (a)微载体培养物、贴壁培养物或悬浮培养物；和/或 (b)不含血清；和/或其中所述细胞培养物是MDCK细胞培养物。
7.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含O.1-20 μ g血凝素/病毒毒株。
8.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述乳液中的一种或多种油和一种或多种表面活性剂是生物可降解和生物相容的。
9.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述乳液的液滴具有亚微米直径。
10.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述乳液包含 (a)类萜；和/或 (b)角鲨烯；和/或 (C)生育酌■，例如DL- α -生育酌·；和/或 (d)聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂、辛苯聚醇表面活性剂和/或失水山梨糖醇酯。
11.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述细胞因子诱导剂 (a)引发干扰素-Y的释放；和/或 (b)选自免疫刺激性寡核苷酸；3-0-脱酰基单磷酰脂质A(3dMPL);咪唑并喹啉化合物；和/或氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐衍生物。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述细胞因子诱导剂)是3dMPL，并且 (a)以重量计，至少10%的3dMPL是六酰基链形式；和/或 (b)所述3dMPL为直径<150nm的颗粒形式；和/或 (c)所述3dMPL位于乳液的水相中。
13.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物(a)基本上不含汞物质；和/或 (b)包含l-20mg/ml氯化钠；和/或 (c)重量克分子渗透浓度在200-400m0sm/kg之间；和/或 (d)pH在5.0-8. I之间；和/或 (e)含有〈I内毒素单位；和/或 (f)不含谷蛋白；和/或 (g)包含一种或多种缓冲液，所述ー种或多种缓冲液包括磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸缓冲液。
14.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含两种甲型流感毒株和一种こ型流感毒株，其中所述组合物是抵御流行性流感病毒毒株的单价疫苗。
15.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合以下组分的步骤(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；和(iii)细胞因子诱导剂，其中细胞因子诱导剂是人TLR4的激动剂。
16.一种装有以下组分的试剂盒(i)包含流感病毒抗原的第一试剂盒组分；和(ii)包含水包油乳液佐剂的第二试剂盒组分，其中(a)所述第一组分和所述第二组分包含细胞因子诱导剂，或(b)所述试剂盒装有包含细胞因子诱导剂的第三试剂盒组分，其中细胞因子诱导剂是人TLR4的激动剂。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组分和所述第二组分装在不同容器中；例如所述第一组分和所述第二组分装在小瓶中，或其中所述第一组分和所述第ニ组分之一装在注射器中，另ー组分装在小瓶中，其中所述小瓶任选由玻璃或塑料材料制成和/或用无乳胶的塞子密封所述小瓶。
18.(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；(iii)细胞因子诱导剂的组合的用途，其中细胞因子诱导剂是人TLR4的激动剂，其特征在于，用于制备在患者体内产生免疫应答的药物。
全文摘要
虽然水包油乳液是流感疫苗的有效佐剂，但仍可通过额外加入其它免疫刺激剂来增强细胞因子应答，例如γ-干扰素应答而提高其效力。因此，疫苗包含(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；(iii)细胞因子诱导剂。
文档编号A61K47/22GK102755645SQ20121022612
公开日2012年10月31日 申请日期2006年11月6日 优先权日2005年11月4日
发明者D·奥黑根, G·德尔古迪斯, R·拉普奥里 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司