专利名称：喹硫平在制备治疗胶质瘤的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及化合物的制药新用途。
背景技术：
胶质瘤是临床上常见的恶性肿瘤之一，具有复发率高、病程进展快、死亡率高的特点，目前仍缺乏安全、有效的治疗手段。最近研究发现，胶质瘤复发率高可能与胶质瘤干细胞密切相关，胶质瘤干细胞存在于脑胶质瘤组织中，对放疗和化疗均不敏感，是胶质瘤复发的根源。因此，靶向胶质瘤干细胞的治疗药物的研发，可能提高胶质瘤的治愈率。非典型精神病药物一喹硫平主要用于治疗精神分裂症，且副反应较少。迄今为止，尚未见喹硫平具有抗胶质瘤作用的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于考察喹硫平是否具有抗胶质瘤和胶质瘤干细胞的作用，从而提供喹硫平在制药领域中的新用途。为达到上述目的，本发明通过在体和离体实验，对喹硫平的抗胶质瘤和胶质瘤干细胞的作用进行了考察。在体实验结果显示，喹硫平能通过抑制胶质瘤细胞的增殖来抑制胶质瘤的生长，并促进胶质瘤细胞向少突胶质样细胞分化；离体实验结果显示，喹硫平能抑制胶质瘤干细胞的增殖，并促进其向少突胶质样细胞分化成熟。从而证实了喹硫平具有抗胶质瘤作用并能够以胶质瘤干细胞为作用靶点发挥抗胶质瘤作用，可用于制备治疗胶质瘤的药物，对胶质瘤的治疗及预后起到良好的效果。本发明的有益效果在于本发明公开了喹硫平在制备治疗胶质瘤的药物中的新用途，不仅拓宽了喹硫平的应用范围，提升了其市场价值，而且为胶质瘤的治疗提供了一种新的药物。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对喹硫平的抗胶质瘤作用作进一步描述，其中
图I显示了喹硫平抑制胶质瘤生长，其中A为喹硫平治疗组和对照组在21天时的胶质瘤大小对比(每组各3只动物，重复实验2次)，B为喹硫平治疗组和对照组的胶质瘤生长曲线。图2显示了抑制胶质瘤细胞增殖，并促进其向少突胶质样细胞分化，其中A为免疫组织化学检测喹硫平治疗组和对照组胶质瘤中增殖细胞核抗原(PCNA)和GFAP阳性细胞数，B为RT-PCR检测喹硫平治疗组和对照组胶质瘤中细胞增殖相关基因和少突胶质细胞相关基因的表达，C为Western blotting检测喹硫平治疗组和对照组胶质瘤中少突胶质相关蛋白和星形胶质细胞标志物GFAP的表达。图3显示了喹硫平抑制胶质瘤干细胞增殖，其中A为CCK-8比色法检测喹硫平对细胞活性的影响，B为流式细胞检测喹硫平对细胞周期的影响。图4显示了喹硫平促进胶质瘤干细胞向少突胶质样细胞分化，其中A为喹硫平处理组(左)和对照组(右)胶质瘤干细胞在分化培养4天后的显微视图，B为喹硫平处理组和对照组胶质瘤干细胞在分化培养4天后的少突胶质样细胞百分率，C为qRT-PCR检测喹硫平处理组和对照组胶质瘤干细胞在分化培养4天后的MBP和GFAP mRNA水平。上述各图中，QUE表示喹硫平治疗组或喹硫平处理组，CTL表示对照组。
具体实施例方式下面将通过具体实验例对喹硫平的抗胶质瘤作用进行详细的描述。一、实验材料及仪器 I.实验动物和生物材料 6-8周成年裸鼠(雄性)20只，体重18-22克，由中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供。小鼠成胶质瘤细胞株GL261由中国人民解放军第三军医大学附属第一医院病理研究所提供。2.实验试剂
喹硫平(阿斯利康公司)，Trizol试剂盒(Invitrogen公司),RIPA裂解液和PMSF(申能博彩生物科技有限公司)，小鼠抗PCNA (Dako公司)，兔抗GFAP (博士德公司)，DMEM/ F12、胎牛血清、青霉素、链霉素和B27 (Gibcol公司)，多聚甲醛、重组人EGF (rhEGF)和Accutase溶液(Sigma公司)，bFGF (Upstate公司)，CCK-8试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，SYBRprimescript RT-PCR 试剂盒(TaKaRa 公司)。3.实验仪器
冰冻切片机(Leica公司)、共聚焦激光扫描显微镜(Olympus公司)、酶标仪(Bio_rad公司)、Rotor-Gene 6000 实时遗传分析仪(Corbett Life Science 公司)。二、实验方法和结果 (一)在体实验
I.喹硫平抑制胶质瘤生长
取6-8周成年雄性裸鼠20只，每只腹股沟皮下接种IO5个小鼠成胶质瘤细胞株GL261，随机分为对照组和喹硫平治疗组，喹硫平治疗组给予腹腔内注射喹硫平生理盐水溶液治疗，剂量为10mg/kg体重，每日给药I次，连续给药21天；对照组同法腹腔内注射等体积生理盐水；每两日称量一次小鼠体重，并观察小鼠皮下肿瘤生长情况。结果发现，整个实验过程中两组小鼠的体重变化无明显差异；治疗第9天，对照组小鼠皮下可见明显肿瘤生长，体积4. 0±0. 2 _3，而喹硫平治疗组小鼠皮下肿瘤明显较小，体积1.9±0. I mm3 ;治疗第19天，喹硫平治疗组小鼠皮下肿瘤大小为60. 5± 10. 2 mm3，仅为对照组小鼠皮下肿瘤(580±24 mm3)的10%，差异显著(P〈0. 01)(图I)。2.喹硫平抑制胶质瘤细胞增殖，并促进其向少突胶质样细胞分化
上述治疗结束后(治疗第21天)，将两组小鼠用1%戊巴比妥钠溶液麻醉，每组5只用0. OlM PBS进行心脏灌注冲洗，取出皮下肿瘤，一部分用Trizol试剂盒提取肿瘤组织总RNA,然后RT-PCR检测少突胶质细胞相关基因(01ig2、MBP)和细胞增殖相关基因(Ki67、Sox2)的表达，以Actin为内参照；另一部分用RIPA裂解液加上新鲜的1% PMSF提取肿瘤组织蛋白，然后Western blotting检测少突胶质细胞相关蛋白(01ig2、MBP> CNPase)和星形胶质细胞标志物(GFAP)的表达；每组另5只用O. OlM PBS进行心脏灌注冲洗，再用4%多聚甲醛溶液进行灌注固定，取出皮下肿瘤，用含30%蔗糖和4%多聚甲醛的混合液脱水24小时，行冰冻切片(厚20 μ m)，切片用10%牛血清白蛋白溶液封闭，分别用小鼠抗PCNA、兔抗GFAP孵育过夜，再用相应的第二抗体室温孵育I小时，DAB显色后封片，显微镜下观察并拍照，用图像分析软件Image-Pro Plus5. O计数阳性细胞。结果见图2，RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，喹硫平治疗组细胞增殖相关基因Ki67和Sox2的表达明显下降，而少突胶质细胞相关基因01ig2和MBP的表达明显上调(图2B);Western blotting检测结果显示,与对照组比较，喹硫平治疗组少突胶质相关蛋白01ig2、MBP和CNPase的表达明显上调，而星形胶质细胞标志物GFAP的表达未见明显差异(图2C);免疫组织化学检测结果显示，与对照组比较，喹硫平治疗组胶质瘤中PCNA阳性细胞数明显减少，而GFAP阳性细胞数未见明显差异(图2A)。 (二)离体实验
I.成胶质瘤细胞株诱导形成胶质瘤干细胞
将小鼠成胶质瘤细胞株GL261在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的DMEM/F12培养液中培养12-18小时，吸弃一半培养液，另加入等量无血清神经干细胞培养液(即含有lXB27、10ng/ml rhEGF和10ng/ml bFGF的DMEM/ F12培养液)，然后每24小时半量更换新鲜培养液I次，直至在相差显微镜下可见原代胶质瘤干细胞球形成，将培养液全部换成无血清神经干细胞培养液以维持胶质瘤干细胞的生长。2.喹硫平抑制胶质瘤干细胞增殖
将上述胶质瘤干细胞球用Accutase溶液消化成单细胞，以2X 105/ml的密度分别接种于96孔板(100 μ I/孔)和6孔板(Iml/孔)，随机分为对照组和喹硫平处理组。96孔板，喹硫平处理组在细胞接种12小时后给予不同终浓度(I、10、50、100 μ Μ)的喹硫平处理2天，对照组不给予任何物质，然后采用CCK-8试剂盒检测药物对细胞活性的影响每孔加入10 μ ICCK-8试剂，继续培养4小时，酶标仪于波长450nm检测吸光值。6孔板，喹硫平处理组在细胞接种12小时后给予终浓度100 μ M的喹硫平处理3天，对照组不给予任何物质，然后细胞用0. OlM PBS洗2次，用冰预冷的70%乙醇溶液于4°C固定I小时以上，再用PBS洗2次，力口入PBS IOOul和10g/L Rnase溶液2μ 1，37°C水浴30min，400目尼龙滤网过滤，滤液加入10 μ g/ml碘化丙啶的PBS溶液100μ 1，避光放置30min，流式细胞仪(激发波长488nm)检测药物对细胞周期的影响。结果见图3，用不同浓度的喹硫平处理胶质瘤干细胞2天，50和100 μ M浓度组的细胞存活率较对照组明显下降(ρ〈0. 05，图3Α);用100 μ M的喹硫平处理胶质瘤干细胞3天，胶质瘤干细胞在S期的细胞数较对照组明显减少，在Gl期的细胞数较对照组明显增多(Ρ〈0· 05，图 3Β)。3.喹硫平促进胶质瘤干细胞向少突胶质样细胞分化成熟
将胶质瘤干细胞以2 X 105/ml的密度分别接种于直径35mm培养皿和底部预设多聚赖氨酸包被盖玻片的培养皿中(Iml/皿)，随机分为对照组和喹硫平处理组，对照组在培养基中加入终浓度为10%的胎牛血清，喹硫平处理组在培养基中加入终浓度为10%的胎牛血清和终浓度为50 μ mo I的喹硫平，培养4天后收集细胞。直径35mm培养皿中培养的细胞一部分用Trizol试剂盒提取细胞总RNA,再用SYBR primescript RT-PCR试剂盒在Rotor-Gene6000实时遗传分析仪上通过qRT-PCR检测MBP和GFAP mRNA水平；另一部分用RIPA裂解液加上新鲜的1% PMSF提取细胞蛋白，再采用Western blotting检测CNPase和GFAP的表达水平。多聚赖氨酸包被盖玻片上培养的细胞用4%多聚甲醛溶液固定后进行免疫荧光染色，检测CNPase和GFAP的表达水平。结果见图4，相差显微镜下观察，胶质瘤干细胞在分化培养4天后，喹硫平处理组较对照组有更多的少突胶质样细胞(P〈0. 05，图4A, B) ;qRT_PCR检测结果显示，胶质瘤干细胞在分化培养4天后，喹硫平处理组的MBP mRNA水平明显较对照组高(P〈0. 05)，而GFAPmRNA水平两组无明显差异(图4C);Western blotting和免疫荧光染色检测结果均显示，喹硫平处理组的CNPase表达水平明显较对照组高(P〈0. 05)，而GFAP的表达两组无明显差异。以上在体实验结果显示喹硫平能够通过抑制胶质瘤细胞的增殖来抑制胶质瘤的 生长，并促进胶质瘤细胞向少突胶质样细胞分化；离体实验结果显示喹硫平能抑制胶质瘤干细胞的增殖，并促进其向少突胶质样细胞分化成熟；从而证实了喹硫平具有抗胶质瘤作用并能够以胶质瘤干细胞为作用靶点发挥抗胶质瘤作用，可用于制备治疗胶质瘤的药物。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.喹硫平在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于，所述治疗胶质瘤的药物是能够抑制胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞增殖并促进其向少突胶质样细胞分化的药物。
全文摘要
本发明公开了喹硫平在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。在体实验结果显示喹硫平能通过抑制胶质瘤细胞的增殖来抑制胶质瘤的生长，并促进胶质瘤细胞向少突胶质样细胞分化；离体实验结果显示喹硫平能抑制胶质瘤干细胞的增殖，并促进其向少突胶质样细胞分化成熟，证实了喹硫平具有抗胶质瘤作用并能够以胶质瘤干细胞为作用靶点发挥抗胶质瘤作用，可用于制备治疗胶质瘤的药物，对胶质瘤的治疗及预后起到良好的效果。本发明不仅拓宽了喹硫平的应用范围，提升了其市场价值，而且为胶质瘤的治疗提供了一种新的药物。
文档编号A61P35/00GK102755326SQ20121026713
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者李成仁, 李红丽, 汪云, 肖岚 申请人:中国人民解放军第三军医大学