专利名称：对虾转录激活反应rna结合蛋白及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及对奸转录激活反应RNA结合蛋白及用途。
背景技术：
虾是世界公认的高蛋白水产品，深为消费者所喜爱。近十多年对虾养殖业的飞速发展，使全球养殖虾类产量从1983年的10万余吨跃升至2011年的230多万吨。对虾主产区主要分布在东南亚、东亚以及拉丁美洲等国家和地区。我国经过近十年发展，已成为全球最大的对虾生产国，年产量134. 8万吨，占全球总量的40%。对虾养殖业已经成为我国沿海一些地区的支柱性产业。对虾养殖业在发展过程仍然存在着不少困难和问题，其中病害已成为对虾产业可持续发展的障碍。对虾常见的病害包括细菌病、病毒病和真菌病等，病毒病至今没有有效治疗手段。对虾RNA病毒有桃拉病毒(TSV)、传染性肌肉坏死病毒(IHHNV)、黄头病毒(YHV)·等。与哺乳动物RNA病毒感染过程相似，病毒的RNA-RNA聚合酶存在于髓核中，在该聚合酶的作用下病毒基因组转录正链RNA，它们自髓核逸出。它们既能作为mRNA，又能作为病毒基因组的模板。MRNA翻译结构蛋白，装配内层衣壳后，正链RNA进入，并形成双链RNA。然后又重复上述过程，最后获得了外层衣壳。在此过程中，转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)发挥重要作用。转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)首先作为艾滋病病毒-I反式激活应答RNA结合蛋白被分离鉴定出来，随后证明其属于双链RNA( dsRNA)结合蛋白家族，含有3个双链RNA结合结构域(dsRBD)。其中位于dsRBD 2内部的KR-螺旋模序负责RNA结合，第3个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用。转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)具有多种生物学功能，是蛋白激酶受体(PKR)的强抑制物，使病毒蛋白表达恢复，从而增强了 HIV复制；TRBP作为细胞内RNaseIII家族成员Dicer的伴侣，参与了 RNA干扰的生物学过程。此外，TRBP还参与了精子生成与发育的调控过程。因此，转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)是一个与病毒等微生物感染相关的多功能基因，目前该基因在斑节对虾中尚未报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是要提供一种转录激活反应RNA结合蛋白。本发明所要解决的第二个技术问题是要提供含有上述转录激活反应RNA结合蛋白的表达载体。本发明所要解决的第三个技术问题是要提供一种重组转录激活反应RNA结合蛋白的制备方法。本发明所要解决的第四个技术问题是要提供一种重组转录激活反应RNA结合蛋白。本发明所要解决的第五个技术问题是要提供一种能与上述重组转录激活反应RNA结合蛋白特异性结合的抗体。本发明所要解决的最后一个技术问题是要提供上述重组转录激活反应RNA结合蛋白的用途。本发明的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的一种转录激活反应RNA结合蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。上述转录激活反应RNA结合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明的目的是通过以近源物种转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到斑节对虾转录激活反应RNA结合蛋白基因的全表达序列。转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)基因全长1548bp，包括249bp 5’ -非翻译区序列，519bp3’ -非翻译区序列。该基因编码343个氨基 酸组成的蛋白，分子量为36. Skd0该基因在免疫器官中高表达，并在微生物感染早期具有重要功能，该基因可应用于对虾的病害控制。本发明发现了斑节对虾转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)基因，利用分子生物学技术首次获得其全长cDNA及生物学功能。本发明的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的一种表达载体，所述的表达载体含有上述转录激活反应RNA结合蛋白。本发明的第三个技术问题是通过如下技术方案来实现的一种重组转录激活反应RNA结合蛋白的制备方法，包括用上述表达载体转化原核或真核宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组转录激活反应RNA结合蛋白。本发明的第四个技术问题是通过如下技术方案来实现的一种重组转录激活反应RNA结合蛋白，包括用上述表达载体转化原核或真核宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组的转录激活反应RNA结合蛋白。本发明的第五个技术问题是通过如下技术方案来实现的一种能与上述重组转录激活反应RNA结合蛋白特异性结合的抗体。本发明的最后一个技术问题是通过如下技术方案来实现的上述转录激活反应RNA结合蛋白在制备具有控制虾类病害作用药物中的应用。以及上述转录激活反应RNA结合蛋白在制备具有促进虾类精子生成与发育作用药物中的应用。
图I具体实施例中斑节对虾转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)基因在创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、白斑综合征病毒(WSSV)刺激下的表达特征分析；图2具体实施例中TRBP blastP结果，含有双链RNA识别结构域(DSRM)；图3是具体实施例中斑节对虾转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)基因在不同组织中的表达。
具体实施例方式下面通过以下具体实施方式
对本发明作进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。I.总RNA的提取和肝胰腺全长cDNA文库构建
I. I总RNA的提取取鲜活健康斑节对虾(体重约150g)在实验室内暂养3d后(水温约24°C，气泵充气)，解剖奸体取出肝胰腺约IOOmg,放入ImL RLT Buffer (Qiagen, USA)中进行低温研磨，按照Qiagen Mini试剂盒使用说明提取总RNA,并使用DNase消化除去基因组。I. 2肝胰腺全长cDNA模板的制备按照GeneRacer kit (Invitrogen, USA)制备全长 cDNA 模板。取 3 μ g 总 RNA 经过小牛碱性磷酸酶(CIP)反应去除RNA 5’磷酸基团，经过烟草焦磷酸酶(TAP)去除RNA 5’帽子结构，利用RNA连接酶连上GeneRacer RNA Oligo，再利用GeneRacer OligodT引物在逆转录酶Superscript III的作用下50°C反应60min,从而获得全长cDNA的模板。2.转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)基因cDNA全序列的克隆 2. I兼并引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、小鼠、斑马鱼、果蝇等)TRBP同源基因⑶S序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物。引物设计后采用β —乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成，得到以下引物序列F:5，-GTCNGGAGCHCTGCCHTCCRAA-3’R : 5，-AAGGTYCACGNTGCTCVGCGWGAT-3，。2. 2TRBP基因片段的获取以近源物种TRBP基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为819bp0以上述合成的cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为=IOxPCR反应缓冲液 5μ L，25mmol/L MgCl23 μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，lOnmol/L 弓丨物 F 和 R 各 2 μ L，Taq酶I. 25U，用超纯水将反应体系补充至50 μ L。反应条件为1个循环，94°C变性5min ；35个循环94°C变性45s, 56°C退火45s, 72°C延伸45s ;1个循环，72°C延伸IOmin ;4°C保温。所扩增的PCR产物用I %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega，USA)中，转化大肠杆菌DH-5 α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经兼并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用Μ13通用引物进行测序。2. 3TRBP 全长 cDNA 的获得根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增(RapidAmplification of cDNA ends, RACE)技术对目的基因的3 ,和5,末端进行PCR扩增。依据序列合成5’ RACE 引物 5’ -ACTCTTGGAGAAGTGAAACAGGGGTT-3’ 和 3’ -RACE 弓丨物5’ -GACGATGAGATTGCCCAGAAGT-3’，采用上述合成的全长cDNA为模板，按照GeneRacer Kit(Invitrogen，USA)进行5’RACE PCR扩增。第一次反应体积为20ul，反应条件为个94°C变性2min ;5个循环94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸Imin ;25个循环94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸Imin ;1个循环，72°C延伸IOmin; 4°C保温。利用5’RACE巢式引物 5，-AACAGGGGTTTTGGAGGGCAGA-3 ’和 3 ’ RACE 巢式引物 5 ’ -CCACAAGAACCTAAAGCAGTCTCC-3，进行巢式PCR，反应体积为50ul，反应条件为94°C变性2min ；30个循环94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸Imin ; I个循环，72 °C延伸IOmin; 4°C保温。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离，亚克隆PGEM-T载体，T7、SP6进行测序反应获得约5’ RACE片段349bp以及3’ RACE片段489bp的核酸序列，拼接后获得全长cDNA为1548bp。2. 4TRBP的生物信息学分析用Blast (http://www. ncbi. nim. nih. gov/)讲行同源件分析，结果如图 I 所示,该基因与凡那滨对虾、中国对虾、按蚊等的TRBP蛋白有高度同源性，揭示该基因是TRBP基因。利用DNAstar等工具进行生物信息学分析，揭示起始密码ATG位于250-252核苷酸，终止密码子位于1282-1284核苷酸，开放读码框为1029个核苷酸，推测编码一个343个氨基酸的蛋白(图2)。5，UTR为249bp，3’ UTR为519bp，3’ UTR存在mRNA快速降解信号ATTTA(图2)。推测编码一个分子量大小为36. 8kDa、等电点为7. 41的氨基酸。利用SMART在线生物信息学分析该蛋白在27-92氨基酸，130-196氨基酸，272-338氨基酸存在典型的DSRM结构域(附图I )，揭示其属于双链RNA结合蛋白家族成员。表ITRBP的blast分析结果
权利要求
1.一种转录激活反应RNA结合蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一种转录激活反应RNA结合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—种表达载体，其特征是所述的表达载体含有权利要求I或2所述的转录激活反应RNA结合蛋白。
4.一种重组转录激活反应RNA结合蛋白的制备方法，其特征是包括用权利要求3所述的表达载体转化原核或真核宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组转录激活反应RNA结合蛋白。
5.一种重组转录激活反应RNA结合蛋白，其特征是包括用权利要求3所述的表达载体转化原核或真核宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组的转录激活反应RNA结合蛋白。
6.一种能与权利要求5中所述的重组转录激活反应RNA结合蛋白特异性结合的抗体。
7.权利要求I或2所述的转录激活反应RNA结合蛋白在制备具有控制虾类病害作用药物中的应用。
8.权利要求I或2所述的转录激活反应RNA结合蛋白在制备具有促进虾类精子生成与发育作用药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种对虾转录激活反应RNA结合蛋白(以下称TRBP)基因序列及其用途，该基因mRNA全长为1548核苷酸，TRBP基因由343氨基酸组成，该基因在淋巴、鳃、肠等免疫组织高丰度表达，并在微生物感染早期具有重要功能，该基因可应用于对虾的病害控制。
文档编号A61P31/04GK102816768SQ201210284939
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者杨丽诗, 江世贵, 周发林 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所