专利名称：布鲁氏菌鞭毛蛋白bmeii1112在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白的新用途，特别是涉及一种布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。
背景技术：
布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病(简称布病)是典型的人畜共患传染病，给我国畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活。布鲁氏菌病是一种慢性传染性疾病，预防该病的发生是控制该病的重要措施。目前，布鲁氏菌病的预防主要是通过接种疫苗来实现。用灭活和减毒布鲁氏菌病原体制备的疫苗，免疫动物后虽收到了有效免疫应答及免疫保护效果，但存在着接种后过敏反应强烈、免疫与感染难以鉴别诊断以及个别情况下出现菌毒恢复等难题，至今难以给人接种。因此，寻找安全、有效的新一代布鲁氏菌病疫苗 已成为近几年的研究热点。和减毒活疫苗相比，亚单位疫苗具有靶向性、安全性的特点，其批量制作容易、费用低，并可解决传统疫苗的安全性问题；另外，亚单位疫苗可在诊断学上区分免疫接种和自然感染。为了发展亚单位疫苗，对保护性抗原的筛选和评价成为了最主要的任务。鉴定和筛选新的保护性抗原，是布鲁氏菌亚单位疫苗研究的基础。BMEII1112位于布鲁氏菌Brucella melitensis的II号染色体上，可编码布鲁氏菌的鞭毛蛋白，其编码序列与Yersinia pestis和Shigella flexneri的III型分泌系统的分泌蛋白序列有明显的同源性。已有的研究报道，BMEII1112可能具有鞭毛运动开关的功倉泛([l]Fretin, D. , Fauconnier, A. , Kohler, S. , Hailing, S. , Leonard, S. , Nijskens, C.,Ferooz, J. ,Lestrate, P. ,Delrue, R. M. ,Danese,I. ,Vandenhaute, J. ,Tibor, A. ,DeBolle,X. ,Letesson,J. J. ,2005,The sheathed flagellum of Brucella melitensis is involvedin persistence in a murine model of infection. Cell Microbiol 7，687-698.),在布鲁氏菌的不同生长时期表达有差异([2]Rossetti, C. A.，Galindo, C. L.，Lawhon, S. D.，Garner, H. R. , Adams, L. G. , 2009, Brucella melitensis global gene expression studyprovides novel information on growth phase-specific gene regulation withpotential insights for understanding Brucella:host initial interactions. BMCMicrobiol 9，81.)。目前，尚未见任何有关BMEII1112免疫保护性方面的报道。在本发明中，发明人克隆了布鲁氏菌的BMEII1112基因，利用表达载体获得了原核表达的重组蛋白，并对该重组蛋白的免疫保护性进行了评价。
发明内容
本发明提供了一种布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的新用途。实验证明，布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112具有免疫保护性，可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。
所述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的氨基酸序列如序列表中序列I所示，编码该蛋白的基因如序列表中序列2所不。序列表中的序列I由106个氨基酸组成；序列表中的序列2由321个碱基组成，编码序列表中序列I所示的蛋白(序列2自5 ‘端第1-318位碱基编码序列I所示蛋白，自5 ‘端第319-321位碱基编码终止密码子)。
需要的时候，以布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112制备的布鲁氏菌亚单位疫苗中还可以融入免疫佐剂，包括弗氏佐剂、微生物佐剂及其产物(常用的微生物有分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等)、多聚核苷酸佐剂(如多聚肌苷酸胞苷酸(polyl:C)，多聚腺苷酸(polyl:A:iO等)、无机物佐剂(如明矾及氢化铝等)、以及颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-Y (IFN-y)、白介素2 (IL-2)、TGF-￠4等一种或多种细胞因子作为分子免疫佐剂。本发明的疫苗可以制成注射液、微球体、干粉针剂或气雾剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。上述亚单位疫苗的用量可采用药学领域中亚单位疫苗的常规剂量，并可根据实际情况调整。本发明还提供了一种重组表达布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的方法。本发明所提供的重组表达布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的方法，是利用Gateway技术使BMEII1112基因在宿主细胞获得表达，具体方法可包括以下步骤I)构建入门克隆(即BP反应)将BMEII1112基因和入门载体在Gateway BPClonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因克隆进入门载体中，得到入门克隆；2)构建表达克隆载体(即LR反应)将步骤I)构建的包含BMEII1112基因的入门克隆和目的载体在Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因转移进目的载体，得到表达克隆载体；3)将步骤2)构建的表达克隆载体导入宿主细胞，经表达、纯化，得到高活性的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112。在上述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的重组表达方法中，所述步骤I)中的BMEII1112基因可采用PCR的方法获得，具体方法包括以下步骤(I)先以布鲁氏菌(优选为羊布鲁氏菌B. melitensis 16M)的基因组DNA为模板，用5’端含搭桥序列的引物BMEII1112-E-F (序列表中序列5)和BMEII1112-E-R (序列表中序列6)扩增BMEII1112基因，目的是使PCR扩增产物带上搭桥序列；(2)再以步骤I)的PCR扩增产物为模板，在通用引物AttBl (序列表中序列7)和AttB2 (序列表中序列8)的引导下进行PCR扩增，目的是使BMEII1112基因的PCR扩增产物带上AttB序列，得到BMEII1112基因。所述步骤I)中的入门载体优选为PD0NR201 ;其中，以pD0NR201为入门载体构建的包含BMEII1112基因的入门克隆为pDONR-1112。所述步骤I)中的I 反应体系为目的基因扩增纯化产物(IOOng/ill) 0.5 ill、Gateway BP Clonase酶0. 2 ii I、入门载体(50ng/ii I) 0. 3 ii I ;反应条件为先在室温下反应4_6h，然后用0. 2 ill蛋白酶K在37°C下灭活Gateway BP Clonase酶。
所述步骤2)中的目的载体优选为pHXGWA ;其中，以pHXGWA为目的载体构建的包含BMEII1112基因的表达克隆载体为pHXG-1112。所述步骤2)中的Iiil反应体系为包含BMEII1112基因的入门克隆(150ng/iil)0. 5iil、目的载体(100ng/iil) 0. 3iil、Gateway LR Clonase 酶 0. 2 ;反应条件为先在室温下反应4_6h,然后用0. 2 ii I蛋白酶K在37°C下灭活Gateway LR Clonase酶。
所述步骤3)中的宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体可为E. coli ER2566 (DE3)、E. coli BL21 (DE3)、E.coli BL21(DE3,plysS),E. coli JM109,E. coli HBlOl 或 E. coli ToplO 等，优选为 E. coliER2566 (DE3)。所述步骤3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0. 2-1. Ommol/L，优选为0. 5mmol/L，诱导温度为35-39°C，优选为37°C，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。所述步骤3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表达后还需对表达蛋白进行纯化，具体方法如下用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化的具体方法为用5倍柱体积的细胞裂解液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 10mmol/L imidazole (中文名称咪唑)，pH 8. 0)平衡Ni-NTA凝胶柱过夜，然后取样品上清加入平衡好的Ni-NTA柱中，置于摇床上，4°C结合2h，静置，去上清，再用5倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl,50mmol/L imidazole (中文名称:咪唑)，pH 8.0)进行洗涤，用60微升洗脱缓冲液(50mmoI /T, NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 250mmol/L imidazole (中文名称:咪唑),pH 8. 0)洗脱目的蛋白，收集洗脱后的样品，得到纯化的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112。本发明还提供了一种布鲁氏菌亚单位疫苗，包括布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112，或包括布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112和免疫佐剂。所述布鲁氏菌亚单位疫苗的制备方法，包括按上述方法在宿主细胞获得重组表达布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112，将布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112制成布鲁氏菌亚单位疫苗的过程。本发明提供了一种布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的新用途。可利用Gateway技术使BMEII1112基因在宿主细胞获得表达。实验结果表明，BMEII 1112蛋白可在体外明显刺激Rev. I免疫小鼠的脾细胞分泌IFN-Y，说明BMEII1112蛋白可刺激产生T细胞免疫反应；将BMEII1112重组蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠，观测其体液免疫和细胞免疫能力，结果显示，免疫小鼠可以刺激机体产生布鲁氏菌特异的IgG抗体，这说明，BMEII1112和佐剂混合免疫可以刺激机体产生体液免疫反应；由于布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，细胞免疫反应在机体抵御布鲁氏菌的侵染中起着主要作用，尤其是Thl型细胞免疫因子IFN-Y在体内外的抗菌作用中发挥了重要作用，为进一步评价BMEII1112重组蛋白的细胞免疫能力，在体外用纯化的BMEII1112蛋白刺激BMEII1112重组蛋白联合佐剂免疫小鼠的脾细胞，并测定了脾细胞的IFN-Y分泌量，结果显示，BMEII1112蛋白免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-Y量远远高于PBS组，这表明BMEII1112和佐剂混合免疫可以刺激机体产生Thl细胞免疫反应；最后，为了评价BMEII1112重组蛋白的免疫保护性，对BMEII1112和佐剂联合免疫小鼠进行了攻毒实验，结果显示，BMEII1112和佐剂联合免疫小鼠的免疫保护性明显高于用PBS对照组，与已知保护性较好的BMEI0748 (L7/L12)阳性对照组具有相同的免疫保护力。综上所述，BMEII1112重组蛋白和弗氏佐剂联合免疫可诱导产生特异性的抗体，激发细胞免疫，并对布鲁氏菌具有较好的免疫保护效果，可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。本发明将在布鲁氏菌的防疫中发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图I为纯化的可溶形式表达的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112和阳性对照BMEI0748蛋白的12% SDS-PAGE检测结果图2为BMEII1112和BMEI0748蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平图3A为IFN- y试剂盒测定的标准曲线
图3B为BMEII1112和BMEI0748刺激Rev. I免疫小鼠及PBS免疫小鼠产生的IFN-Y的含量图4为BMEII1112蛋白诱导BMEII1112蛋白免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-Y量
具体实施例方式本发明提供了一种布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的新用途。实验证明，布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112具有免疫保护性，可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。所述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的氨基酸序列如序列表中序列I所示，编码该蛋白的基因如序列表中序列2所不。序列表中的序列I由106个氨基酸组成；序列表中的序列2由321个碱基组成，编码序列表中序列I所不的蛋白。需要的时候，以布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112制备的布鲁氏菌亚单位疫苗中还可以融入免疫佐剂，包括弗氏佐剂、微生物佐剂及其产物(常用的微生物有分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等)、多聚核苷酸佐剂(如多聚肌苷酸胞苷酸(polyl:C)，多聚腺苷酸(polyl:A:iO等)、无机物佐剂(如明矾及氢化铝等)、以及颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-Y (IFN-Y )、白介素2 (IL-2)、TGF-￠4等一种或多种细胞因子作为分子免疫佐剂。本发明的疫苗可以制成注射液、微球体、干粉针剂或气雾剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。上述亚单位疫苗的用量可采用药学领域中亚单位疫苗的常规剂量，并可根据实际情况调整。本发明还提供了一种重组表达布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的方法。本发明所提供的重组表达布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的方法，是利用Gateway技术使BMEII1112基因在宿主细胞获得表达，具体方法可包括以下步骤I)构建入门克隆(即BP反应)将BMEII1112基因和入门载体在Gateway BPClonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因克隆进入门载体中，得到入门克隆；2)构建表达克隆载体(即LR反应):将步骤I)构建的包含BMEII1112基因的入门克隆和目的载体在Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因转移进目的载体，得到表达克隆载体；3)将步骤2)构建的表达克隆载体导入宿主细胞，经表达、纯化，得到高活性的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112。在上述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的重组表达方法中，所述步骤I)中的BMEII1112基因可采用PCR的方法获得，具体方法包括以下步骤(I)先以布鲁氏菌(优选为羊布鲁氏菌B. melitensis 16M)的基因组DNA为模板，用5’端含搭桥序列的引物BMEII1112-E-F (序列表中序列5)和BMEII1112-E-R (序列表中序列6)扩增BMEII1112基因，目的是使PCR扩增产物带上搭桥序列； (2)再以步骤I)的PCR扩增产物为模板，在通用引物AttBl (序列表中序列7)和AttB2 (序列表中序列8)的引导下进行PCR扩增，目的是使BMEII1112基因的PCR扩增产物带上AttB序列，得到BMEII1112基因。所述步骤I)中的入门载体优选为PD0NR201 ;其中，以pD0NR201为入门载体构建的包含BMEII1112基因的入门克隆为pDONR-1112。所述步骤I)中的I 反应体系为目的基因扩增纯化产物(IOOng/ill) 0.5 ill、Gateway BP Clonase酶0. 2 ii I、入门载体(50ng/ii I) 0. 3 ii I ;反应条件为先在室温下反应4_6h，然后用0. 2 ill蛋白酶K在37°C下灭活Gateway BP Clonase酶。所述步骤2)中的目的载体优选为pHXGWA ;其中，以pHXGWA为目的载体构建的包含BMEII1112基因的表达克隆载体为pHXG-1112。所述步骤2)中的IiU反应体系为包含BMEII1112基因的入门克隆(150ng/iil)
0.5iil、目的载体(100ng/iil) 0. 3iil、Gateway LR Clonase 酶 0. 2 ;反应条件为先在室温下反应4_6h,然后用0. 2 ii I蛋白酶K在37°C下灭活Gateway LR Clonase酶。所述步骤3)中的宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体可为E.coli ER2566 (DE3)、E. coli BL21 (DE3)、E.coli BL21(DE3，plysS)，E. coli JM109，E.coli HBlOl 或 E.coli ToplO 等，优选为 E. coliER2566 (DE3)。所述步骤3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0. 2-1. Ommol/L，优选为0. 5mmol/L，诱导温度为35-39°C，优选为37°C，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。所述步骤3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表达后还需对表达蛋白进行纯化，具体方法如下用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化的具体方法为用5倍柱体积的细胞裂解液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 10mmol/L imidazole (中文名称咪唑)，pH 8. 0)平衡Ni-NTA凝胶柱过夜，然后取样品上清加入平衡好的Ni-NTA柱中，置于摇床上，4°C结合2h，静置，去上清，再用5倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl,50mmol/L imidazole (中文名称:咪唑)，pH 8.0)进行洗涤，用60微升洗脱缓冲液(50mmoI /T, NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 250mmol/L imidazole (中文名称:咪唑),pH 8. 0)洗脱目的蛋白，收集洗脱后的样品，得到纯化的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。材料羊布鲁氏菌强毒株B. melitensis 16M和疫苗株Rev. I为国家⑶C提供；大肠杆菌ER2566 (DE3)购自 New England Biolabs 公司；Gateway 入门载体 pN0NR201 与表达载体pHXGWA 购自 Invitrogen 公司。 DNA 聚合酶、dNTP、IPTG、蛋白 Marker、DNA Marker 购自 TAKARA 生物科技公司；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生物科技公司；Gateway克隆所用BP与LR反应试剂盒为Invitrogen公司产品；镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)购自Novagen公司，小鼠IFN-Y测定试剂盒购自R& D System公司。实施例I、重组表达布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112利用Gateway技术使布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112基因在大肠杆菌中获得表达，具体方法包括以下步骤一、PCR扩增布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112基因I、引物设计采用Primer 5. 0软件设计扩增布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112基因和作为阳性对照的BMEI0748 (L7/L12，已知的布鲁氏菌保护性抗原)ORF基因的引物，并在每对引物的5 ’端分别引入相应的搭桥序列，上游为5 ’ -AAAAAGCAGGCTTA-3 ’，下游为5’ -TGTACAAGAAAGCTGGGTC-3’，同时设计一对通用引物AttBl和AttB2，引物序列见表1，由北京奥科生物公司合成。表I引物序列
引物名_序列(5，-3’ )_
BMEII1112-E-F (上游引物)(;17\CAAAAAA(.;CAGGCTTAATGCAGCAGGAACTGAA (序列表中序列5)BMEIIil 12-E-R (下游引物)TGTACAAGA.姑(,aGGGTCCTTGCCGATGATTTCGGT C序列表屮丨t:列6)BMEI0748-E-F (上游引物)(ri'AC'AMMAGCAGGCTTACTCGCMAGATCGTTGAAGACBMRT0748-F-R (下游引物)"I (;TA(:AAGAAA(;n (i(；(ST((TTGAGTTCAACCTTGGCAttBl (上游引物)GGGGACAAGTTTGTACMMMGCAGGCT (序列表中序列7)
AttB2 (下游引物)_GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT (序列表中序列8)_注和AttB2为通用序列。2、PCR 扩增分两步扩增BMEII1112基因和作为阳性对照的BMEI0748基因第一步以羊布鲁氏菌B. melitensis 16M的基因组DNA为模板，用含搭桥序列的引物BMEII1112-E-F和BMEII1112-E-R扩增BMEII1112基因，用含搭桥序列的引物BMEI0748-E-F 和 BMEI0748-E-R 扩增 BMEI0748 基因。PCR 扩增体系为基因组 DNA (20ng/U I) 0. 5 U I,Taq polymerase (5U/u I) 1U, 10XPCR Buffer 5 U l，dNTP (2. 5mM) 4u 1，上游引物(20iiM)0. 5iil，下游引物(20iiM)0. 5iil，补充无菌水至50u I0 PCR扩增条件为先 94°C 5min ;然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2min,共 10 个循环；最后 72°C 7min。第二步以第一步的PCR扩增产物IOii L为模板，用通用引物AttBl和AttB2进行第二步扩增。PCR扩增体系为第一步的PCR扩增产物10 iil，Taq polymerase (5U/u I)1U，10XPCR Buffer 4u l，dNTP (2. 5mM) 4u I,AttBI (20uM) 2u l，AttB2 (20uM) 2u 1，补充无菌水至 50u I0 PCR 扩增条件先 94 °C 5min ;然后 94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 2min,共30个循环；最后72 °C 7min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果获得了356bp的BMEII1112基因条带和401bp的BMEI0748基因条带，与预期结果相符，用DNA回收试剂盒(购自天根公司)对目的基因进行回收及纯化。二、Gateway技术构建表达载体I、构建入 门克隆(即BP反应)用购自Invitrogen公司的Gateway BP反应试剂盒将BMEII1112基因(或阳性对照BMEI0748基因)和入门载体在Gateway BP Clonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因(或阳性对照BMEI0748基因)克隆进入门载体中，得到入门克隆，Iu I反应体系为目的基因扩增纯化产物(100ng/iil)0.5iil、Gateway BPClonase 酶0. 2 U I、入门载体pD0NR201(购自 Invitrogen 公司，50ng/ u 1)0. 3 u I0 反应条件为室温作用4_6h,然后用0. 2 ii I蛋白酶K在37°C下作用IOmin灭活Gateway BP Clonase酶。反应结束后，将反应产物转化40 ill大肠杆菌DH5 a化学感受态细胞，加150 LB液体培养基复苏45min，涂含50 u g/mL Kan的抗性平板。每个平板随机挑取3_6个菌落用相应弓I物进行PCR鉴定，鉴定结果表明获得了序列正确的入门克隆，分别命名为pDONR-1112和 pD0NR-0748。2、构建表达克隆载体(即LR反应)用购自Invitrogen公司的Gateway LR反应试剂盒将步骤I构建的包含BMEII1112基因(或阳性对照BMEI0748基因)的入门克隆和目的载体在Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因(或阳性对照BMEI0748基因)转移进目的载体，得到表达克隆载体，Iiil反应体系为含目的基因的入门克隆(pENTR-1112 或pENTR-0748，150ng/ii 1)0. 5 u I、目的载体pHXGWA(购自 Invitrogen 公司，100ng/li 1)0. 3 ii l、Gateway LR Clonase 酶 0. 2 ii I。反应总体积为先室温作用 4_6h,然后用0.2lil蛋白酶K在37°C下作用IOmin灭活Gateway LR Clonase酶。反应结束后，将反应产物转化到40 ii I大肠杆菌ER2566 (DE3)(购自New England Biolabs公司)化学感受态细胞中，加150 ill LB液体培养基复苏30min，涂含100 y g/mL Amp的抗性平板。每个平板随机挑取3-6个菌落用相应引物进行PCR及测序鉴定，测序结果表明扩增的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，序列表中序列2由321个碱基组成，编码序列表中序列I所示的蛋白序列(序列2自5 ‘端第1-318位碱基编码序列I所示蛋白，自5 ‘端第319-321位碱基编码终止密码子)，序列表中的序列I由106个氨基酸组成；扩增的BMEI0748基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示，序列表中序列4由375个碱基组成，编码序列表中序列3所示的蛋白序列(序列4自5 ‘端第1-372位碱基编码序列3所示蛋白，自5 ‘端第372-375位碱基编码终止密码子)，序列表中的序列3由124个氨基酸组成，鉴定结果表明获得了序列及插入位置正确的表达克隆载体，分别命名为pHXG-1112 和 pHXG-0748。三、目的蛋白的诱导表达、纯化I、目的蛋白的诱导表达挑取步骤二获得的携带pHXG-1112 (或阳性对照pHXG-0748)的阳性单克隆菌接入含100 u g/mL Amp抗性的LB培养基中，用0. 5mmol/L的IPTG在37°C下诱导表达3小时，同时设阴性对照(未诱导表达)。表达结束后，超声处理表达菌株，分别收集上清和沉淀进行12% SDS-PAGE检测。与未诱导的蛋白相比，诱导后的目的蛋白BMEII1112在28KDa处有一条明显的条带，BMEII1112蛋白主要以可溶形式表达。12% SDS-PAGE检测结果表明阳性对照BMEI0748也获得了表达，在30KDa处有一条明显的条带。2、目的蛋白的纯化
用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化的方法为用5倍柱体积的细胞裂解液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 10mmol/L imidazole (中文名称咪唑)，pH 8. 0)平衡Ni-NTA凝胶柱过夜，然后取样品上清加入平衡好的Ni-NTA柱中，置于摇床上，4°C结合2h，静置，去上清，再用5倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl,50mmol/L imidazole (中文名称咪唑)，pH 8. 0)进行洗涤，用60微升洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 250mmol/L imidazole (中文名称咪唑),pH 8. 0)洗脱目的蛋白，收集洗脱后的样品，得到纯化的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112和阳性对照BMEI0748蛋白，对可溶性纯化蛋白进行12% SDS-PAGE检测，检测结果如图I所示(泳道M :Marker，分子量170KDa_26KDa ;泳道I =BMEII 1112蛋白；泳道2 BMEI0748蛋白)，结果经表达和纯化获得了纯度较高的28KDa的BMEII1112蛋白和30KDa的BMEI0748蛋白，与预期结果相符。用核酸蛋白微量定量仪(Nanodrop)测定蛋白浓度，结果BMEII1112蛋白的浓度为
I.67mg/mL, BMEI0748 蛋白的浓度为 0. 93mg/mL。以下实验中所用BMEII1112蛋白均为实施例I得到的纯化蛋白。试验一、BMEII1112蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平及抗体分型利用ELISA方法测定BMEII1112免疫小鼠在不同时间点的血清IgG抗体水平，同时以已经报道保护性抗原BMEI0748(L7/L12)蛋白作为阳性对照。免疫方案将6_8周龄雌性BALB/C小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分组，每组10只。第I天以30 y g纯化蛋白+弗氏完全佐剂乳化后腹膜内注射免疫，第15天以同样量的蛋白+弗氏不完全佐剂乳化加强免疫一次。PBS组为阴性对照，免疫方式同蛋白。然后，分别于免疫后的第O、15、30、45天小鼠尾静脉取血，通过间接ELISA反应来测定小鼠血清中的IgG效价，具体方法为:将纯化蛋白(BMEII1112蛋白或BMEI0748蛋白)用包被液(pH 9. 6)稀释成5 y g/mL，然后将稀释好的蛋白(100 u I/孔)4°C包被过夜，洗板，封闭；将稀释好的小鼠血清加入到酶联板中，孵育后洗板，加入兔抗鼠的辣根过氧化物酶标二抗(50 yl/孔)孵育30分钟后，洗板;每孔加入100 u I显色液(200 u mo I邻苯二胺和0. 04% H2O2)显色20分钟;终止液(2M硫酸溶液)终止反应后，酶标仪测定450nm处的吸光度值。所有的分析测定重复3次。结果如图2所示，BMEII1112蛋白可以诱导小鼠产生特异性抗体，在一免后15天，IgG的平均滴度为16000，在45天时抗体水平达到最高(IgG平均滴度为156000)，阳性对照BMEI0748蛋白可以诱导小鼠产生特异性抗体，在一免后15天，IgG的平均滴度为5500，在45天时抗体水平达到最高(IgG平均滴度为102400)，而阴性对照PBS免疫小鼠不能诱导小鼠产生抗体。同时还用间接ELISA反应对小鼠血清抗体水平最高时的抗体进行了抗体分型鉴定，检测了与Thl相关的IgG2a亚型和与Th2相关的IgGl亚型的比例。结果IgGl的抗体滴度低于IgG2a抗体滴度，说明BMEII1112主要刺激机体产生Thl型免疫反应。试验二、小鼠免疫、脾细胞刺激和IFN-Y测定由于布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，细胞介导的免疫反应在机体抵御布鲁氏菌的侵入中起着重要作用。为鉴定BMEII1112蛋白是否为布鲁氏菌的候选保护性蛋白，首先对BMEII1112的T细胞反应性进行了验证，以BMEI0748蛋白作为阳性对照。试验方法将6_8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为两组，每组6只，一组用位于对数生长期的Rev. I疫苗株进行腹膜内免疫(5 X IO6CFU/只，200 iil/只)，另一组免疫PBS作为阴性对照；28天以后，尾静 脉采血，分离血清利用ELISA测抗体效价；35天后，两组各取3只小鼠，颈椎脱位法处死小鼠，无菌取脾，以200目铜网研磨，分离单个脾细胞。将分离的脾细胞IOOOrpm离心lOmin，并用 IOmL 的红细胞裂解液(150mMNH4Cl，ImM KHCO3,0. ImM Na2EDTA [pH7. 3])避光裂解 5min，PBS洗涤3次后用1640完全培养基重悬细胞，并将脾细胞数量调整至5 X IO5细胞/孔；用目的蛋白BMEII1112或BMEI0748 (5 Ug/孔)、PBS (阴性对照)分别刺激脾细胞，37°C培养箱孵育72h后，IOOOrpm离心IOmin取细胞上清，冻存至_20°C ,用R & D System公司的MouseIFN- y免疫分析试剂盒测定细胞因子IFN- y的含量，实验重复3次。结果如图3A (IFN-Y试剂盒测定的标准曲线)和图3B (BMEII1112和BMEI0748刺激Rev. I免疫小鼠及PBS免疫小鼠产生的IFN-Y的含量)所示，当用BMEII1112蛋白刺激Rev. I免疫小鼠时，Rev. I免疫小鼠的脾细胞产生IFN-Y的水平显著高于PBS组，与阳性对照BMEI0748类似。实验结果表明，BMEII1112可诱导Rev. I免疫小鼠的脾细胞产生T细胞免疫反应。试验三、BMEII1112重组蛋白的细胞免疫特性分析在试验二中，发现BMEII1112蛋白可以诱导Rev. I免疫小鼠产生T细胞介导的免疫反应，这个对于抵抗布鲁氏菌感染具有重要的作用。为了进一步评价BMEII1112重组蛋白的细胞免疫能力，在体外用纯化的BMEII1112蛋白刺激BMEII1112重组蛋白联合佐剂免疫小鼠的脾细胞，并测定了脾细胞的IFN- y分泌量，具体实验方法将6-8周龄雌性BALB/C小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分组，每组10只。第I天以30y g纯化BMEII1112蛋白+弗氏完全佐剂乳化后腹膜内注射免疫，第15天以同样量的BMEII1112蛋白+弗氏不完全佐剂乳化加强免疫一次。PBS组为阴性对照，免疫方式同蛋白。在二免后30天，两组各取3只小鼠，颈椎脱位法处死小鼠，无菌取脾，以200目铜网研磨，分离单个脾细胞。将分离的脾细胞IOOOrpm离心lOmin，并用IOmL的红细胞裂解液(150mM NH4Cl, ImMKHCO3,0. ImM Na2EDTA [pH7. 3])避光裂解5min，PBS洗涤3次后用1640完全培养基重悬细胞，并将脾细胞数量调整至5X105细胞/孔，用目的蛋白BMEII1112 (511§/孔)、&)1^ (阳性对照，5 u g/孔)、1640 (全称1640细胞培养基，阴性对照)分别刺激脾细胞，37°C培养箱孵育72h后，IOOOrpm离心IOmin取细胞上清，冻存至-20°C ,用R & D System公司的MouseIFN- y免疫分析试剂盒测定细胞因子IFN- y的含量，实验重复3次。结果如图4所示，BMEII1112蛋白免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-Y量远远高于PBS组，这表明BMEII1112和佐剂混合免疫可以刺激机体产生细胞免疫反应。
试验四、小鼠免疫及攻毒实验为了评价BMEII1112重组蛋白的免疫保护性，对BMEII1112和佐剂联合免疫小鼠进行了攻毒实验，实验方法为将6-8周龄雌性BALB/C小鼠随机分两组，第I天以30 y g纯化蛋白BMEII1112或BMEI0748 (阳性对照蛋白)+弗氏完全佐剂乳化后腹膜内注射免疫，第15天以同样量的蛋白+弗氏不完全佐剂乳化加 强免疫一次，以Rev. I (IXlO5Cfu/只，200iU/只)+弗氏不完全佐剂作为阳性对照，PBS组为阴性对照，免疫方式同蛋白。免疫45天后进行小鼠攻毒实验，腹膜内注射2X 105CFU(200 u I/只)布鲁氏菌强毒株B. melitensis16M。攻毒后30天，处死小鼠，无菌取脾，用含有0. I % Triton X-100的PBS研磨脾脏，研磨液系列稀释后取100 涂TSA平板，37°C培养5天后进行菌落计数。结果如表2所示，与PBS组相比，BMEII1112免疫组具有明显的保护性(P〈0. 01)，其免疫保护力与已知保护性较好的BMEI0748阳性对照组具有类似的免疫保护力，且两组都明显高于PBS对照组，略低于Rev. I免疫组。实验结果显示BMEII1112蛋白对布鲁氏菌感染具有免疫保护性。表2BMEII1112蛋白的免疫保护性实验结果
权利要求
1.布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112的氨基酸序列如序列表中序列I所不，编码该蛋白的基因如序列表中序列2所不。
3.根据权利要求I或2所述的应用，其特征在于需要的时候，以布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112制备的布鲁氏菌亚单位疫苗中还可以融入免疫佐剂，包括弗氏佐剂、微生物佐剂及其产物(常用的微生物有分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等)、多聚核苷酸佐剂(如多聚肌苷酸胞苷酸(polyl:C)，多聚腺苷酸(polyl:A:y )等)、无机物佐剂(如明矾及氢化铝等)、以及颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-Y (IFN-γ)、白介素2 (IL-2)、TGF-β 4等一种或多种细胞因子作为分子免疫佐剂。
4.根据权利要求I或2或3所述的应用，其特征在于所述疫苗可以制成注射液、微球体、干粉针剂或气雾剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112可利用Gateway技术在宿主细胞获得重组表达，具体方法包括以下步骤 1)构建入门克隆(即BP反应)将BMEII1112基因和入门载体在GatewayBP Clonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因克隆进入门载体中，得到入门克隆； 2)构建表达克隆载体(即LR反应):将步骤I)构建的包含BMEII1112基因的入门克隆和目的载体在Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使BMEII1112基因转移进目的载体，得到表达克隆载体； 3)将步骤2)构建的表达克隆载体导入宿主细胞，经表达、纯化，得到高活性的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤I)中的BMEII1112基因可采用PCR的方法获得，具体方法包括以下步骤 (1)先以布鲁氏菌(优选为羊布鲁氏菌B.melitensis16M)的基因组DNA为模板，用5’端含搭桥序列的引物BMEII1112-E-F (序列表中序列5)和BMEII1112-E-R (序列表中序列6)扩增BMEII1112基因，目的是使PCR扩增产物带上搭桥序列； (2)再以步骤I)的PCR扩增产物为模板，在通用引物AttBl(序列表中序列7)和AttB2(序列表中序列8)的引导下进行PCR扩增，目的是使BMEII1112基因的PCR扩增产物带上AttB序列，得到BMEII1112基因。
所述步骤I)中的入门载体优选为PD0NR201 ;其中，以pD0NR201为入门载体构建的包含BMEII1112基因的入门克隆为pDONR-1112。
所述步骤I)中的1μ I反应体系为目的基因扩增纯化产物(lOOng/μ 1)0. 5μ I、Gateway BP Clonase酶O. 2 μ I、入门载体(50ng/μ I) O. 3 μ I ;反应条件为先在室温下反应4_6h，然后用O. 2μ I蛋白酶K在37°C下灭活Gateway BP Clonase酶。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述步骤2)中的目的载体优选为pHXGWA ;其中，以pHXGWA为目的载体构建的包含BMEII1112基因的表达克隆载体为pHXG-1112。
所述步骤2)中的1μ I反应体系为包含ΒΜΕΙΙ1112基因的入门克隆(150ng/y I)O. 5 μ I、目的载体(lOOng/μ 1)0. 3 μ I、Gateway LR Clonase 酶 O. 2 μ I ;反应条件为先在室温下反应4_6h,然后用O. 2 μ I蛋白酶K在37°C下灭活Gateway LR Clonase酶。
8.根据权利要求5或6或7所述的应用，其特征在于所述步骤3)中的宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体可为 E. coli ER2566 (DE3)、E. coliBL21 (DE3)、E. coli BL21 (DE3, plysS), E. coli JM109,E.coli HBlOl 或 E. coli ToplO 等，优选为 Ε· coli ER2566 (DE3)。
所述步骤3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为O. 2-1. OmmoI/L,优选为O. 5mmol/L,诱导温度为35_39°C，优选为37°C，诱导时间为2_4小时，优选为3小时。
所述步骤3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表达后还需对表达蛋白进行纯化，用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化，具体方法为用5倍柱体积的细胞裂解液(50mmoI /T, NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 10mmol /T, imidazole (中文名称咪唑),pH 8. O)平衡Ni-NTA凝胶柱过夜，然后取样品上清加入平衡好的Ni-NTA柱中，置于摇床上，4°C结合2h，静置，去上清，再用5倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl, 50mmol/Limidazole(中文名称咪唑)，pH 8. O)进行洗涤，用60微升洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaCl, 250mmol/L imidazole (中文名称咪唑),pH 8. O)洗脱目的蛋白，收集洗脱后的样品，得到纯化的布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112。
9.一种布鲁氏菌亚单位疫苗，包括权利要求I至8任一所述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112，或包括权利要求I至8任一所述布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112和权利要求3所述的免疫佐剂。
10.一种权利要求9所述布鲁氏菌亚单位疫苗的制备方法，包括按权利要求5至9任一所述方法在宿主细胞获得重组表达布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112，将布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112制成布鲁氏菌亚单位疫苗的过程。
全文摘要
本发明提供了一种布鲁氏菌鞭毛蛋白BMEII1112在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的新用途。实验结果表明BMEII1112重组蛋白和弗氏佐剂联合免疫可诱导产生特异性的抗体，激发细胞免疫，并对布鲁氏菌具有较好的免疫保护效果，可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。本发明将在布鲁氏菌的防疫中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A61P31/04GK102772795SQ201210284710
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者宋宏彬, 杜昕颖, 柯跃华, 汪舟佳, 王玉飞, 袁静, 陈泽良, 黄留玉 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所