专利名称：核-壳型纳米药物颗粒、其制备方法及应用的制作方法
核-壳型纳米药物颗粒、其制备方法及应用
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体涉及一种靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，其制备方法及应用。
背景技术：
传统的肿瘤治疗手段主要有手术切除、放疗及化疗。手术切除与放疗主要应用于切除或杀死肿瘤的原发病灶以及其它可见的肿瘤组织。由于肿瘤发展晚期获得的肿瘤细胞转移侵袭能力，使得肿瘤细胞的全身分布变得难以跟踪，极大地限制了手术切除与放疗方法对晚期癌症的治疗效果。以化疗为基础的药物治疗方法具有无创、可全身治疗的特点，对扩散的肿瘤细胞同样具有杀伤效果，无疑是最具潜力的治疗手段。可是尽管近年来新的化疗药物不断出现，化疗方案不断改进，但临床化疗效果并不理想。虽然部分癌症目前通过药物治疗可以完全治愈，部分癌症通过药疗可延长生存期，但是大部分常见实体瘤如肺癌、肝癌、结肠癌等还无法通过药物得到有效治疗。肿瘤病人总生存率和生活质量改善还不理想。化疗效果不佳的原因主要有两方面。其一在于肿瘤组织和肿瘤组织的特殊的生理结构和性质。肿瘤组织血管少，而肿瘤周围致密的纤维结构和肿瘤病灶内渗透压过高致使药物难以达到肿瘤中心区，而肿瘤的多药耐药性(Multdrug resistance, MDR)使得药物无法在肿瘤细胞内聚集，进而导致药疗失效，这也是导致化疗失败的主要障碍之一。另一方面在于化疗药物的作用机制，是对细胞生长进行抑制或直接杀死细胞，目前的化疗药物无法有效区分正常细胞与肿瘤细胞，因而具有较强的毒副作用，在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常细胞与组织造成较强的损伤，给病人带来一些额外的痛苦。因此肿瘤药物治疗的关键科学问题在于如何在化疗过程中有效克服这些肿瘤治疗领域的难题和障碍，将抗肿瘤药物准确有效地输送到肿瘤部位和转移病灶。基于纳米包裹的药物传递技术相较传统的给药方式有众多优点，已成为一种新兴的有效治疗手段。例如纳米药物传递技术可通过EPR效应(enhanced permeability andretention effect)实现药物在肿瘤组织中的特异聚集；纳米包裹可保护药物免除体内清除系统的作用，以延长药物的作用时间与效果；纳米包裹技术还可实现多重药物包裹，可同时包裹多种不同性质的治疗药物，包括用基因治疗药物如SiRNA等，以实现综合治疗与降低耐药性等目的；纳米药物表面可根据需要进行多种修饰，可连接多种蛋白配体或小分子物质以实现纳米药物的特异性定位，并可经表面修饰在时间与空间上控制药物的释放过程。因此，纳米颗粒介导的药物传输载体系统是一种极具潜力的癌症治疗手段，目前已有多个应用纳米技术包裹常规化疗药物的研究正在进行中，然而目前的研究仍不能很好的克服肿瘤细胞的耐药性以及常规化疗药物的毒副作用等重要问题。现今人们已认识到， 肿瘤细胞中由表观遗传学修饰引起的多个抑癌基因失活对肿瘤发生发展有重要作用。其中一些重要基因失活也直接导致了肿瘤细胞对常规药物的耐药性，例如DNA错配修复蛋白hMLHl与促凋亡蛋白CASP8。表观遗传学修饰引起的基因表达失活主要包括DNA甲基化引起的表达失活与组蛋白的去乙酰化引起的染色体重构，对应的具抗肿瘤潜力的药物包括DNA甲基化抑制剂(如5-氮-2'-脱氧胞苷)与抗组蛋白去乙酰化抑制剂(如TSA)。这类表观遗传学药物相比常规化疗药物具有更小的毒性，可同时激活多个抑癌基因的表达。抗DNA甲基化药物与常规化疗药物联用后，可有效地逆转肿瘤耐药细胞对常规化疗药物的耐药性，例如抗甲基化药物5-氮-2'-脱氧胞苷(以下亦可用Aza表示)可有效提高耐药细胞A2780/cp70对顺钼的敏感性。此外，肿瘤组织内的基因甲基化标志物在不同肿瘤与肿瘤的不同发展阶段的甲基化情况均有所不同，在癌症病人中检测甲基化标志物的甲基化状况还可应用于指导针对具体病人的个性化治疗方式，以及作为治疗后的预后恢复指标。目前纳米包裹常规化疗药物方面有较多研究，但仍不能很好克服肿瘤细胞耐药性的问题与常规化疗药物尤其是在高剂量时对正常细胞的杀伤问题。化疗药物与表观遗传学药物联用后可大大提高肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性，但是将二者同时包载在纳米载体中形成纳米载药传递系统的研究还尚未有报道，如何将二种药物同时有效地运送到肿瘤组织仍有待解决。
发明内容本发明要解决的技术问题是改善化疗药物的靶向性，减小细胞毒性；提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药性，以促进化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力。为此，本发明一方面提供靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，包括:疏水性内核，所述疏水性内核包括疏水性多聚物，以及吸附在所述疏水性多聚物上的至少一种化疗药物和至少一种表观遗传学药物；包裹所述疏水性内核的单层脂类分子层，所述脂类分子具有面向所述疏水性内核的疏水部分和面向所述核-壳型纳米药物颗粒外部的亲水部分；以及靶向肿瘤细胞的亲水性外壳，所述亲水性外壳由具有脂端和与所述脂端共价交联的亲水端的两亲性大分子化合物构成，所述脂端可帮助所述两亲性大分子化合物插入所述单层脂类分子层，并且所述亲水端延伸在所述纳米药物颗粒外部。所述疏水性多聚物可选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚已内酯等。所述化疗药物可选自多柔比星、表柔比星、紫杉醇、去甲长春花碱、顺钼等。所述表观遗传学药物可选自5-氮杂-胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、RG108、曲古抑菌素A、付立诺他、帕比司他、N-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺、缩酚酸肽、丙戍酸、丁酸苯酯、AN-9、恩替诺特、Mocetinostat、4-乙酰氨基-N-(2'-氨基苯基)-苯甲酰胺等。所述脂类分子可选自卵磷脂、脑磷脂。所述两亲性大分子化合物的所述脂端可为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺，所述亲水端可为羧基修饰的聚乙二醇。所述化疗药物和所述表观遗传学药物的质量之和可为所述疏水性聚合物质量的5%至 50%。所述化疗药物和所述表观遗传学药物的重量比率可为0.05:1至2:1。
本发明另一方面提供一种制备该靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒的方法，包括:于疏水溶剂中，将所述疏水性多聚物与所述化疗药物和所述表观遗传学药物混合溶解，得到疏水液；于亲水溶剂中，将所述脂类分子与所述两亲性大分子化合物混合溶解，得到亲水液；于50-80°C温浴亲水液，伴随温和搅拌添加疏水液至亲水液中，得到混合液；温浴条件下，混匀所述混合液，再温和搅拌，以得到所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液。该制备方法还可包括:以可截留纳米药物的滤膜，用重蒸水超滤离心所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液，并用PH7.4的磷酸盐缓冲液回收所述核-壳型纳米药物颗粒。本发明再一方面提供该核-壳型纳米药物颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的有益效果在于，通过将纳米包裹技术、化疗药物及表观遗传学药物三者相结合，实现了基于纳米药物包裹技术的、可降低常规化疗药物细胞毒性、提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性、抑制肿瘤细胞耐药性等多重目的的有效药物传递与治疗方法。该方案综合了纳米包裹技术、化疗药物与表观遗传学药物三者的优点，可以有效抑制肿瘤细胞的生长。
图1为根据本发明一实施例的核-壳型纳米药物颗粒结构的示意图。图2为根据本发明另一实施例，制备图1的核-壳型纳米药物颗粒的流程图。图3图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒与肿瘤细胞的作用。图4图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒在抑制肿瘤细胞生长中的作用。图5图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒在促进肿瘤细胞调亡中的作用。图6图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒在抑癌基因表达激活中的作用。
具体实施方式本发明综合了纳米包裹技术、化疗药物与表观遗传学药物三者的优点，有效抑制肿瘤细胞的生长。利用纳米药物递送的EPR效应，提高药物对肿瘤细胞的靶向性，降低细胞毒性，并延长药物的作用时间和效果；通过表观遗传学药物与化疗药物的组合，激活抑癌基因的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性，逆转肿瘤细胞耐药性；从而利用三者之间的协同作用，更有效地抑制肿瘤细胞的生长，并杀死肿瘤细胞。本发明的纳米药物颗粒为靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，其内核为疏水性的，由疏水性多聚物构成，该疏水性多聚物能够将化疗药物和表观遗传学药物同时吸附于其上。例如，本发明的疏水性多聚物可为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚已内酯等，但不排除其他可用的疏水性聚合物。内核中含有的药物可以为至少一种化疗药物与至少一种表观遗传学药物的组合，但不排除还包括其他药物，如siRNA、miRNA、抗癌基因等基因药物、或抗肿瘤辅助治疗药物，如昂丹司琼、亚叶酸钙等。常用的化疗药物包括抗肿瘤抗生素类，如多柔比星、表柔比星；抗肿瘤动植物成分药类，如紫杉醇、去甲长春花碱等；抗代谢药，如5-氟尿嘧啶等；烷化剂，如环磷酰胺等；抗肿瘤激素类，如阿他美坦等；杂类,如顺钼等。常用的表观遗传学药物主要包括DNA甲基化抑制剂，如5-氮杂-胞苷、5_氮杂-2 '-脱氧胞苷、Zebularine, RG108、曲古抑菌素A、付立诺他、帕比司他、N-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺、缩酚酸肽、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、恩替诺特、Mocetinostat、4_乙酸氨基N-(2 '-氨基苯基)_苯甲酰胺(N-Acetyldinaline)等。表观遗传学药物可以激活抑癌基因的表达，激活对肿瘤细胞的抑癌活性，以及抑制肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，因此其与化疗药物同时存在时可大大提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤。包裹疏水性内核的为一单层脂类分子，该脂类分子可为卵磷脂(大豆磷脂酰胆碱)、脑磷脂，或是其他可与多聚物内核相互作用形成脂类单分子层的脂类分子。脂类分子的疏水部分面向疏水性内核，并将疏水性内核包裹起来；其亲水部分则与水相环境相互作用，以形成稳定的纳米药物颗粒。核-壳型纳米药物颗粒外壳由两亲性大分子化合物构成，用于提高纳米药物颗粒的水相稳定性，保护纳米药物颗粒在体内的作用时间，并可以化学修饰以提供纳米药物的靶向性等功能。两亲性大分子化合物的亲水端靶向肿瘤细胞，其脂端则可帮助将分子插入单层脂类分子层，亲水端与脂端共价交联，靶向肿瘤细胞。例如，两亲性大分子可为DSPE-PEG2000-C00H,其脂端为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，其亲水端为羧基修饰的聚乙二醇2000 (PEG2000-C00H)。两亲性大分子化合物的脂端部分和亲水端部分可进一步修饰，如用叶酸、或可特异性结合肿瘤表面受体的配体分子修饰，以提高对肿瘤细胞的靶向性。本发明的核-壳型纳米药物颗粒中，化疗药物和表观遗传学药物的各自的量依多聚物的药物结合效率，以及治疗需要的药物浓度来决定。通常，化疗药物和表观遗传学药物的重量比率可为0.05:1至2:1。它们的总量可为所述疏水性聚合物质量的5%至50%，例如可为10%。脂类分子、两亲性大分子的摩尔比率可根据具体的分子、药物、多聚物的种类，以及所需的纳米颗粒性质来调整，通常可在6:1至6: 5的范围，例如可为6: 4。图1所示为根据本发明一实施例的核-壳型纳米药物颗粒的结构示意图。从图中可见，该核-壳型纳米药物颗粒的内核部分为PLGA聚合物，以及化疗药物多柔比星、表观遗传学药物5-氮-2’ -脱氧胞苷。多柔比星(DOX)和5-氮-2’ -脱氧胞苷(Aza)吸附在PLGA聚合物上，形成疏水性内核。包覆内核的是单层卵磷脂分子层，卵磷脂的疏水部分包裹内核，形成纳米颗粒；卵磷脂的亲水部分则处于纳米颗粒外层，促使纳米颗粒得以稳定形成。在卵磷脂层外部的是亲水性外壳，其由两亲性大分子(DSPE-PEG2000-C00H)构成，脂端(DSPE，二硬酯酰磷脂酰乙醇胺)因其疏水性，而可帮助将PEG部分插入到卵磷脂单分子层的疏水部分中，亲水端(PEG2000-C00H，羧基修饰的聚乙二醇2000)延伸在纳米药物颗粒之夕卜。羧基部分的亲水性有助于进一步提高纳米药物颗粒的水相稳定性，并促使纳米药物颗粒靶向于肿瘤细胞。本发明还提供制备该核-壳型纳米药物颗粒的方法，如图2所示，主要包括以下步骤: 首先，制备疏水液I。疏水液I中包含混合在疏水溶剂(如乙腈)中的疏水性多聚物、至少一种化疗药物，以及至少一种表观遗传学药物，即用于形成核-壳型纳米药物颗粒内核部分的组分。药物的加入顺序没有限制。可通过搅拌、震荡、超声等方式来帮助均匀混合 。
其次，制备亲水液II。亲水液II中包含溶解在亲水溶剂(如乙醇或各浓度的乙醇水溶液，优选为4%乙醇水溶液)中的脂类分子和两亲性大分子化合物，即用于形成核-壳型纳米药物颗粒的脂类单分子层及亲水性外壳部分的组分。可通过搅拌、震荡、超声等方式来促进溶解。然后，在温浴环境中，伴随温和搅拌，将疏水液I添加到亲水液II中，以形成混合液。温浴温度可在50-80°C，优选为65°C。添加过程温和进行，可逐滴添加。温浴的作用是提供合适的溶剂挥发条件，促进多聚物与脂类相互作用。接着，继续在温浴条件下，混匀混合液，促进疏水液I与亲水液II的混合作用，以使吸附有药物的疏水性聚合物能够被亲水液中的脂类分子包裹。可采用多种方法来实现混匀，如剧烈震荡、搅拌、超声等。之后，温和搅拌一段时间，使得在溶液中形成稳定的纳米药物颗粒。形成在溶液中的纳米药物颗粒可以进一步纯化和浓缩。以可截留纳米药物的滤膜，例如通过在分子量截流的超滤离心管中用重蒸水洗涤，并离心，再用PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液回收该核-壳型纳米药物颗粒。截留的分子量根据所需获得的纳米药物粒径来选定，例如可为10kD，或其他分子量。超滤离心的目的是去除未被包裹的各种小分子与聚合物分子。在检测本发明的核-壳型纳米药物颗粒时，可用90% DMSO将其溶解，以检测所包裹药物的浓度。同时也可根据需要检测纳米颗粒的其它物理化学性质，如平均粒径，表面电荷等。实施例原料与试剂:乳酸-轻基乙酸共聚物:Sigma_Aldrich;多柔比星:Jinhe Bio-TechnologyC0.Ltd ;5_ 氮-2 '-脱氧胞苷:Sigma-AIdrich ；卵憐脂:Avanti ;DSPE-PEG_C00H:Avanti ;乙腈；乙醇；重蒸水；PBS缓冲液；DMS0 ;培养基:1640 (Hyclone) ；Hoechst染料:Sigma-Aldrich, 1:1000 稀释；Dio 突光染料:Life Technologies ；MTS (3_ (4,5 一二甲基噻唑-2)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐)=Promega ;Annexin V FITC 凋亡检测试剂盒:BD Pharmingen ;碘化丙唳:Sigma-Aldrich ;PCR 引物于 Invitrogen 合成；PCR 反应用 Taq Gold:Applied Biosystems ;逆转录(RT)试剂盒:Applied Biosystems ;实验中所用细胞系均来自ATCC细胞库。制备核-壳型纳米药物颗粒的制备实施例1-包裹DOX与Aza的纳米药物颗粒的制备制备疏水液1:将包含2mg/ml PLGA的乙腈溶液与多柔比星(DOX)、5_氮-2’-脱氧胞苷(Aza)相混合，DOX与Aza的质量之和为PLGA质量的10 %，DOX与Aza的比例0.2: 1，。制备亲水液I1:将分别包含lmg/ml卵磷脂与包含25mg/mlDSPE-PEG2000-C00H的水溶液按卵磷脂:DSPE-PEG2000-C00H摩尔比6:4混合，并稀释于4%的乙醇溶液中，卵磷脂与DSPE-PEG2000-C00H的总质量为PLGA质量的20%。制备混合液:将亲水液II在65°C温浴3分钟后，于温和搅拌下逐滴加入带有药物的PLGA疏水液I,混合完成后剧烈振荡3分钟，再于65°C混合搅拌4小时，得包裹药物的纳米颗粒的溶液。
纯化:将制备所得的纳米药物颗粒溶液在分子量截流10 kD的超滤离心管中用重蒸水洗涤3次，离心15分钟。用pH 7.4 PBS溶液回收纳米颗粒。对照实施例A-包裹DOX的纳米药物颗粒的制备制备方法与实施例1类似，区别在于疏水液I中仅使用多聚物总质量10%的D0X，而不使用Aza。对照实施例B-包裹Aza的纳米药物颗粒的制备制备方法与实施例1类似，区别在于疏水液I中仅使用多聚物总质量10%的Aza，而不使用DOX。纳米药物颗粒的表征1、包裹药物的浓度以90 % DMSO分别溶解包裹DOX、Aza、DOX+Aza的纳米药物颗粒(NPs+DOX、NPs+Aza、NPs+DOX+Aza)后，使用荧光光谱仪在480nm处检测DOX的吸收峰值，用紫外光谱仪在260nm处检测Aza的吸收峰值，在与DOX或Aza标准浓度样本的吸收标准曲线对照后可得出所包裹的药物浓度。三种包裹方式的包裹效率分别为NPs+Aza+Dox: 20-40 %，NPs+Aza: 20-40 %，NPs+DOX:20-40%。2、平均粒径表征方法:所得纳米药物用Zeta Pals instrument (Brookhaven, USA)检测颗粒粒径分布。3、表面电荷表征方法:所得纳米药物用DelsaTM Nano C(Beckman Instruments, USA)检测颗粒表面电势分布。以上表征结果示于下表中。
权利要求
1.一种靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，包括: 疏水性内核，所述疏水性内核包括疏水性多聚物，以及吸附在所述疏水性多聚物上的至少一种化疗药物和至少一种表观遗传学药物； 包裹所述疏水性内核的单层脂类分子层，所述脂类分子具有面向所述疏水性内核的疏水部分和面向所述核-壳型纳米药物颗粒外部的亲水部分；以及 靶向肿瘤细胞的亲水性外壳，所述亲水性外壳由具有脂端和与所述脂端共价交联的亲水端的两亲性大分子化合物构成，所述脂端可帮助所述两亲性大分子化合物插入所述单层脂类分子层，并且所述亲水端延伸在所述纳米药物颗粒外部。
2.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述疏水性多聚物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚已内酯。
3.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述化疗药物选自多柔比星、表柔比星、紫杉醇、去甲长春花碱、顺钼。
4.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述表观遗传学药物选自5-氮杂-胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、Zebularine、RG108、曲古抑菌素A、付立诺他、帕比司他、N-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺、缩酚酸肽、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、恩替诺特、Mocetinostat、4_乙酸氛基-N-(2' _氛基苯基)-苯甲酸胺。
5.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述脂类分子选自卵磷脂、脑磷脂。
6.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述两亲性大分子化合物的所述脂端为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺，所述亲水端为羧基修饰的聚乙二醇。
7.根据权利要 求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述化疗药物和所述表观遗传学药物的质量之和为所述疏水性聚合物质量的5%至50%。
8.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述化疗药物和所述表观遗传学药物的重量比率为0.05:1至2:1。
9.制备权利要求1至8中任一项所述的靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒的方法，包括: 于疏水溶剂中，将所述疏水性多聚物与所述化疗药物和所述表观遗传学药物混合溶解，得到疏水液； 于亲水溶剂中，将所述脂类分子与所述两亲性大分子化合物混合溶解，得到亲水液； 于50-80°C温浴亲水液，伴随温和搅拌添加疏水液至亲水液中，得到混合液； 温浴条件下，混匀所述混合液，再温和搅拌，以得到所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，还包括: 以可截留纳米药物的滤膜，用重蒸水超滤离心所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液，并用pH7.4的磷酸盐缓冲液回收所述核-壳型纳米药物颗粒。
11.权利要求1至8中任一项所述的核-壳型纳米药物颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，包括吸附有化疗药物和表观遗传学药物的疏水性聚合物内核；包裹所述疏水性内核的单层脂类分子层；以及靶向肿瘤细胞的亲水性外壳。本发明还涉及该核-壳型纳米药物颗粒的制备方法，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明将纳米包裹、化疗药物和表观遗传学药物三者相结合，具有改善药物递送靶向性、提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，以及抑制肿瘤细胞耐药性等优势。
文档编号A61K47/34GK103099782SQ20121028471
公开日2013年5月15日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者蔡林涛, 王朝晖, 李力力, 苏献伟, 龚萍, 郑明彬 申请人:深圳先进技术研究院