专利名称：鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶活性作用的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体内环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂在机体的生理活动中扮演着重要的角色，如激活酶原、释放激素的前体物、参与机体免疫反应、血液凝固、补体形成、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于人类也已成为国际研究的热点。而其研究与开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV),顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在羞里首次发现。它是一种感染人类免疫系统迦胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病，自1988年Kohl等的实验证明HIV蛋白酶是HIV感染和复制的必需酶，可以作为抗AIDS药物的靶点以来，人们已合成和筛选到近百种有抗病毒活性的化合物。通过与逆 转录酶抑制剂的联合治疗来减少HIV阳性患者体内携带的病毒；然而，即使在单一治疗中仍具有很强的效力。HIV蛋白酶在Phe-Pro，Phe-Leu，Phe-Thr的特异性剪切，使得抑制剂的设计必须具备高度可变性。目前，有8类蛋白酶抑制剂用于HIV治疗，包括替拉那韦，印地那韦，沙奎那韦，洛匹那韦。新一代的抑制剂正在被开发以发挥最大的疗效，来治疗病患。目前治疗HIV的第二代蛋白酶抑制剂TMC-114已进入临床III阶段测试中。据国内外文献报道,丝氨酸蛋白酶抑制剂如aprotinin除已在临床上广泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治疗外，也在胸外科手术中用于抗纤溶，抑制接触性激活、抗炎症等。丝氨酸蛋白酶类似物如Kallikrein, tryptase在风湿性关节炎以及许多炎症中(如鼻炎、结膜炎、哮喘、胃肠炎、心血管系统炎症)发生中起着重要的作用。临床试验证明其抑制剂是有效地治疗药物。另一方面。目前临床上还没有有效地治疗疱疹病毒感染的药物，近年来发现，抑制疱疹病毒丝氨酸蛋白酶是有效的治疗手段。鲫鱼鱼卵作为一种丰富的水产资源，其综合利用潜力有待进一步开发，以提高其附加值。研究表明，鱼卵中存在多种蛋白酶抑制剂成分，在鱼卵中除执行生理调节功能外，在病原生物防御中也起到了重要作用。然而，截止目前为止只对少数鱼卵中的蛋白酶抑制剂进行了研究，且大多集中于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究。因此，对其进行研究显得极为必要，既可以进一步揭示鱼类的自身防御机制，探讨其在鱼卵中生理、防御功能，又可为其在食品医药等领域的应用提供基础数据。发明人降本发明的鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂全序列氨基酸结构经蛋白质数据进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现任何相同基因。
发明内容
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有强烈的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，同时具有较强的肿瘤细胞生长抑制活性和免疫调节活性的鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制其基因和在制药中的应用。为实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂成熟蛋白质序列:鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于从鲫鱼卵中分离得到的一种环状蛋白酶抑制剂，分子量42651. 9Da,等电点5. 61,无酶活性，鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂成熟序列为谷氨酸-丙氨酸-组氨酸-脯氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-组氨·酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-脯氨酸-组氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-酪氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-组氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-赖氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-脯氨酸-缬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-甲硫氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸-亮氨酸-丝氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸-酪氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-甘氨酸-酪氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-缴氨酸-天冬酰胺-谷氨酸-甘氨酸-酪氨酸-谷氨酸-组氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-组氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-甘氨酸-组氨酸-丝氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-丝氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-精氨酸-谷氨酸_甘氨酸_苯丙氨酸_赖氨酸_纟颜氨酸_纟颜氨酸_天冬氨酸_谷氨酰胺_苯丙氨酸_売氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-组氨酸-酪氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-谷氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-赖氨酸-脯氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-苯丙氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-蛋氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-酪氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-赖氨酸-色氨酸-天氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-苏氨酸-组氨酸-赖氨酸-丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-天氨酸-赖氨酸-天氨酸-苏氨酸-苏氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-天氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-赖氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-精氨酸-酪氨酸-天氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-天氨酸-脯氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-苏氨酸-苏氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-脯氨酸-酪氨酸-赖氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-亮氨酸-脯氨酸-天氨酸-谷氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-赖氨酸-天氨酸-缬氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-组氨酸-组氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰胺-色氨酸-组氨酸-天氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-苏氨酸-丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-苏氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸-苏氨酸-谷氨酸-谷氨酸-亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丝氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-缬氨酸-组氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-亮氨酸-丝氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-苏氨酸-谷氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-苏氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-苏氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-苏氨酸-缬氨酸。鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂的serpin基因克隆包括鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂鲫鱼卵总RNA提取，RNA浓度测定，RNA反转录，引物设计及PCR扩增筛选鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂，RACE扩增鲫鱼卵中serpin基因3’端和5’端的引物设计等。扩增引物长度23个核苷酸，其序列为5’ ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT3’，PCR另一扩增引物为CL0NTECH公司 SMART cDNALibrary Construction Kit 中的 3’PCRPrimer引物，其序列为5’ ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂基因核苷酸序列，其特征=CDNA由1230个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为
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图1 :鲫鱼卵中CaSPI抑制CaSPI与trypsin结合比抑制曲线具体实施例方式1、鲫鱼卵总RNA提取提取所用离心管、枪头、枪盒等均经O. 1% DEPC水浸泡过夜并高压灭菌处理，所用研钵、玻璃匀浆器、镊子及剪刀均经180°C高温处理2. 5h。具体操作步骤为 取鲫鱼卵样品，约lOOmg，加入液氮研磨成粉术，倒入玻璃匀浆器中丨加入Iml Trizol Reagent进一步研磨样品将匀浆样品转移至1. 5mlEP管(DEPC管)15_30°C放置5minI 加入 200 μ I 氯仿,剧烈振荡 3min, 4°C, 12000 X g 离心 15min吸取上清至新离心管并加入与上清等体积的异丙醇，室温静置IOmin丨 4 , 12000 X g 离心 IOmin弃上清并加入Iml 75%的乙醇清洗沉淀丨 4 , 7500Xg 离心 IOmin弃上清，室温放置干燥，加DEPC水20-50 μ I溶解，_70°C保存备用。2、RNA浓度测定取I μ I上述溶于DEPC水的总RNA置于Nanodrop 2000c测定RNA浓度。根据所测RNA浓度调整反转录时所加RNA模板用量为I μ g。3、RNA 反转录按照如下配制cDNA合成反应体系并进行反转录反应。
权利要求
1.鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于该鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂从鲫鱼卵中分离得到的一种环状蛋白酶抑制剂，分子量42651. 9Da，等电点为pH 5. 61 ±0.02，鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质全序列为SEQ NO :1。
2.鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，其特征在于核苷酸序列cDNA由1230个核苷酸组成，其序列为SEQ NO :2。
3.权利要求2所述的鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，其特征在于，编码鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂成熟序列的为85-1230位核苷酸，其对应的氨基酸序列为SEQ NO :1。
4.权利要求1所述鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备抑菌、肿瘤、胃炎、胰腺炎和/或癌症等疾病的药物应用。
全文摘要
本发明涉及鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用，属于生物医学技术领域。本发明通过常规的生物化学手段，从鲫鱼卵中分离纯化得到丝氨酸蛋白酶抑制剂，分子量42651.9Da，等电点5.61，鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂具有对丝氨酸蛋白酶强烈的抑制活性的特点，且不易产生耐药性，可以为制备肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病的药物应用。
文档编号A61P1/04GK103044542SQ20121029651
公开日2013年4月17日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者韩曜平, 郭强, 刘晶晶, 徐建荣, 顾志良, 梁化亮, 吴杰, 薛飞, 王立 申请人:常熟理工学院