抗猪圆环病毒和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物及制备方法

抗猪圆环病毒和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗猪圆环病毒2型及猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物及制备方法。该二联疫苗组合物含有猪圆环病毒2型抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，免疫程序简单，能同时有效的防治猪圆环病毒2型相关疾病和猪传染性胸膜肺炎。与单苗相比，该二联疫苗组合物并没有产生免疫干扰现象，疫苗免疫效果没有下降，而且猪胸膜肺炎放线杆菌可以增强猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。该二联疫苗组合物的制备工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。
【专利说明】抗猪圆环病毒和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物及制备
【技术领域】
[0001]本发明属于畜牧类生物制药【技术领域】，涉及一种抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种呼吸系统重要传染病。本病主要引起猪的一种伴有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速死亡，发病率和死亡率均在50%以上，它可发生于任何年龄的猪只，尤其是在集约化养猪场，一旦发生会造成重大经济损失。
[0003]临床上一般分为最急性、急性、亚急性和慢性。最急性型多发生在断奶仔猪群中，一头或几头猪突然发病，病猪体温高达41.5°C，精神沉郁，食欲不振，有短暂的腹泻或呕吐，剖检后病理变化主要存在于呼吸系统，最急性或急性迅速死亡的猪只气管和支气管内充满泡沫状血样粘性渗出物、肺充血、水肿，肺炎病灶变暗，变硬，质地脆弱，纤维素性胸膜炎区呈现暗红色或发黑。
[0004]猪胸膜肺炎放线杆菌最早被称为副溶血嗜血杆菌(H.parahaemoIyties),该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。该病原菌血清型众多，根据辅酶I(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD)依赖性，可以分为生物I型和生物II型,其中依赖NAD的猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物I型(Biovar I),不依赖NAD的猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物II型(Biovar II)，采用传统血清型方法，又可细分为15个血清型。其中生物I型包括血清广12型和15型，生物II型包括血清13型和14型。
[0005]目前该病的预防主要是对流行区域进行病原菌的分离鉴定，确定流行的优势血清型，研制具有特异性保护作用的灭活疫苗，并制订相应的防治对策，是许多国家所采用的方法。但是该病原血清型众多，给该病的`预防与控制带来了困难，因此，血清型的划分及其所采用的方法显得非常重要。
[0006]猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS),而且还与猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, FONS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease syndrome, PRDC)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从20世纪90年代发现可致病猪以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群中感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大爆发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国在2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50%，给我国的养猪业也造成了严重的打击。
[0007]PCV2为单股环状的DNA病毒，无囊膜，20面体对称，基因组全长1767bp或1768bp，整个基因组包括11个开放阅读框(Open reading frame, 0RF)，其中ORFl和0RF2为两个主要阅读框。ORFl与同属的猪圆环病毒I型(PCVl)高度同源，编码与病毒复制相关的酶类。而0RF2在PCVl和PCV2之间差异相对较大，编码分子量约为30kDa的主要结构蛋白(衣壳蛋白)(Capsid protein，CP)能够与PCV2感染的猪血清特异性结合，并且具有中和活性。
[0008]目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，国外只有梅里亚动物保健公司(Merial)生产全病毒灭活苗，但只适用于母猪免疫；国内均为全病毒灭活苗，且应用的佐剂均含有一定量的矿物油；PCV2亚单位疫苗目前有两家公司生产，勃林格殷格翰动物保健有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.，美国)的 FLEX 系列茵格发(Ingelvac)猪圆环病毒疫苗和英特威/先灵德雅动物保健公司(intervet/schering-plough)的PCV2疫苗；富道动物保健公司(Fort Dodge)研制的PCV2疫苗属于嵌合病毒灭活苗。
[0009]专利CN 102058880A披露了一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法。该方法以胸膜肺炎放线杆菌I型HT株菌、5型SZ株菌和7型DY株菌为疫苗制备菌株，经培养，收获培养物，再经灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗。该方法所采用的APP1、5、7型抗原毒力较弱，免疫原性不够强，并且，制备的疫苗为油佐剂疫苗，会对免疫猪只造成一定程度的应激，采用该方法制得的疫苗免疫成本较高。
[0010]专利CN 101549155A公开了一种猪圆环病毒II型(PCV2)灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是以猪圆环病毒II型DBN-SX07株为毒种，经烷化剂灭活后作为抗原，再加入油佐剂乳化配制而成。该方法采用细胞转瓶培养技术生产种毒，使抗原效价很难突破IO5 5TCID5tl/ml，使生产成本提升。其所制备的猪圆环病毒II型灭活疫苗使用油佐剂，会对免疫猪只造成一定程度的应激。所制得的疫苗用于商品猪需要免疫2次，影响免疫效果及相关免疫成本。
[0011]专利CN 102174086A公开了一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白和亚单位疫苗。该重组猪圆环病毒Cap蛋白为大肠杆菌表达，该蛋白系截除N端富含精氨酸的核定位信号区域，该蛋白克隆入原核表达载体得到重组表达载体，该重组表达载体转染大肠杆菌BL21(DE3)表达获得。该疫苗利用大肠杆菌表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白，所得到的蛋白多为包涵体形式存在，不具备天然蛋白的活性，其免疫原性也会大打折扣。该疫苗的抗原蛋白纯化是减少疫苗副反应的重要一环，同时也是提高疫苗成本的因素，此方式难以大规模推广和应用。该疫苗配制采用弗氏完全佐剂或不完全佐剂，会影响疫苗吸收，对疫苗效果产生副反应。
[0012]上述疫苗均为只能防治一种疾病的疫苗，联苗是未来疫苗发展和应用的趋势，应用新技术、新材料研制出可与其它疫苗联合应用的猪圆环病毒疫苗，同时预防两种或多种疾病，这样既能降低动物应激，提高动物福利，又能减少员工免疫的工作量，降低免疫相关成本。
[0013]因此，目前存在的问题是需要研究开发一种免疫成本低廉，采用畜类易于接受的佐剂，可以同时预防猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型两种传染病，并能避免多次接种造成免疫应激反应及免疫效果降低的疫苗及其制备方法。

【发明内容】

[0014]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗猪圆环病毒2型(PCV2)及猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物及制备方法。该二联疫苗组合物含有猪圆环病毒2型抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，免疫程序简单，能同时有效的防治猪圆环病毒2型病和猪传染性胸膜肺炎。与单苗相比，该二联疫苗组合物并没有产生免疫干扰现象，疫苗免疫效果没有下降，而且猪胸膜肺炎放线杆菌可以增强猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。该二联疫苗组合物的制备工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。
[0015]为此，本发明提供了一种抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
[0016]根据本发明，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原中的一种或几种，并且，所述猪圆环病毒2型抗原选自猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分。
[0017]本发明中所述用语“猪圆环病毒2型全病毒抗原”是指猪圆环病毒2型病毒在其受体细胞内寄生并以复制方式增殖后达到所需的病毒量，该病毒经灭活、减毒等方式处理后获得的抗原，该抗原包含病毒本身所具备的核酸和蛋白质，只是其存在形式会有差异。
[0018]本发明中，所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为IO5 5TCID5tlt5优选所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为4.5 X 15 0TCID50^16-0TCID50 0进一步优选所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为9X 105_°TCID5Q。
[0019]在本发明的一个优选实施例中，所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株、PCV2LG株、PCV2DBN-SX07-2的抗原或疫苗和/或PCV2亚单位抗原。优选所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株(保藏编号为CGMCC N0.23890，公开于专利文献CN101240264A)和/或PCV2 0RF2蛋白。
[0020]也就是说，由于PCV2基因组大小为1767bp或1768bp,不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90%以上，因此PCV2SH株(`GenBank登录号为AY686763)、PCV2LG株(GenBank登录号为HM038034)、PCV2DBN-SX07-2 (GenBank登录号为HM641752)的抗原或疫苗均在本发明保护范围之内。
[0021]本发明中，所述猪圆环病毒2型0RF2蛋白为序列表SEQ N0.1的DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N0.2的氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75%以上的氨基酸序列的蛋白。优选所述猪圆环病毒2型0RF2蛋白为与序列表SEQN01.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白同源性在80%以上的氨基酸序列的蛋白。进一步优选所述猪圆环病毒2型0RF2蛋白为与序列表SEQ N01.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白同源性在90%以上的氨基酸序列的蛋白。
[0022]本发明中，所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型0RF2蛋白的含量为0.5^20 μ g/头份。优选所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型0RF2蛋白的含量为5~10μ g/头份。
[0023]本发明中，所述猪圆环病毒2型抗原还包含至少一种猪圆环病毒2型灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。所述PCV2抗原还可以选自，例如，梅里亚公司(Merial)的Circovac-PCV2 ;辉瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn_PCV2 ;哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株);福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亚单位疫苗，如勃林格殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的猪圆环病毒疫苗(Ingelvac CircoFLLX[0024]同样的，根据本发明，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为猪胸膜肺炎放线杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪胸膜肺炎放线杆菌细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的全菌体。
[0025]本发明中所述用语“全菌体”，是指具有完整细胞壁、细胞膜、细胞质、核体等基本结构的细菌完整细胞体。而全菌体抗原则是指由上述细菌完整细胞体经灭活或减毒的处理后获得的抗原。
[0026]本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌”或“胸膜肺炎放线杆菌”(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。
[0027]同样，本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌抗原”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原”或“胸膜肺炎放线杆菌抗原”。
[0028]在本发明的一个具体的实施例中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，其选自目前已鉴定的f 15个血清型中的一种或几种。
[0029]本发明的一个优选实施例中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原是灭活的血清型为I型、5型和7型的混合抗原。优选所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌体。
[0030]所述胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株(ActinobaciIIusPIeuropneumoniaeserotypeI strain LC, APP-1)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011458 ；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype5strainYC, APP-5)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011459 ;所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清 7 型 YS 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7strain YS, APP-7)的保藏编号为:CCTCCN0:M 2011460 ;上述菌株均保藏于中国典型培养物保藏中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期:2011年12月9曰。
[0031]正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。因此，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的副猪嗜血杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。
[0032]因此，本发明中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在80%以上的菌株。优选所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在90%以上的菌株。更为优选的，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在95%~99%以上的菌株。也就是说，不改变猪传染性胸膜肺炎三株菌株(LC株、YC株和YS株)16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪胸膜肺炎放线菌，获得与本发明猪胸膜肺炎放线菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。
[0033]本发明中，所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型的含量至少为1.0X IO7CFU/头份，优选血清I型的含量为2.0XlOlX IO7CFU/头份，进一步优选的是血清I型的含量为3.0X 1(T5X IO7CFU/头份，更为优选的是血清I型的含量为
4.0 X 107^5X107CFU/头份，最为优选的是血清I型的含量为5.0X IO7CFU/头份。
[0034]所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型的含量至少为1.0X IO7CFU/头份，优选血清5型的含量为2.0X 1(T5X IO7CFU/头份，进一步优选的是血清5型的含量为3.0X IO7~5 X IO7CFU/头份，更为优选的是血清5型的含量为4.0 X IO7~5 X IO7CFU/头份，最为优选的是血清5型的含量为5.0X IO7CFU/头份。
[0035]所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的含量至少为1.0X IO7CFU/头份，优选血清7型的含量为2.0X 1(T5X IO7CFU/头份，进一步优选的是血清7型的含量为3.0 X 107~5 X IO7CFU/头份，更为优选的是血清7型的含量为4.0 X IO7~5 X IO7CFU/头份，最为优选的是血清7型的含量为5.0X IO7CFU/头份。
[0036]在本发明的一个实施例中，所述二联疫苗组合物还包含疫苗佐剂，所述佐剂为进口的新型水佐剂Montanide GEL PR聚合物(包括同系列佐剂)佐剂，并且，在所述疫苗组合物中，所述疫苗佐剂含量为10Wt9T25wt%。
[0037]新型水佐剂为畜类易于接受的佐剂，采用该佐剂配制疫苗，可以提高疫苗的可吸收性，同时可以避免油佐剂所具有的应激等副作用。
[0038]在本发明的一个优选实施方案中，所述二联疫苗组合物还含有疫苗总量0.01wt%的硫柳萊。
[0039]本发明还提供了一种根据本发明所述二联疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤:将两种以上的抗原混合后制得抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪圆环病毒2型抗原与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
[0040]根据本发明，所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗原。例如，所述其它猪的病原体的附加抗原可以选自猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪链球菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪流行性感冒抗原、副猪嗜血杆菌抗原中的一种或几种。
[0041]可任意选择的，在制备根据本发明所述二联疫苗组合物的配苗步骤中，所述抗原还包括其它猪的病原体的附加抗原。
[0042]根据本发明方法，本发明还包括在配苗步骤之前的制备猪圆环病毒2型抗原的步骤及制备猪胸膜肺炎 放线杆菌抗原的步骤。
[0043]在根据本发明的一个具体实施方案中，所述二联疫苗组合物包含抗原和佐剂；其中抗原包含已灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪圆环病毒2型SH株抗原；所述佐剂为进口的新型水佐剂Montanide GEL PR聚合物(包括同系列佐剂)佐剂。所述四种抗原的比例为:猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株:血清5型YC株:血清7型YS株:猪圆环病毒2型SH株=2:2:2:2 ;所述四种抗原总体积为所述疫苗总体积的75%~90%。在所述二联疫苗组合物中，猪胸膜肺炎放线杆菌含量为灭活前猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型、血清7型活菌数均不少于2.0X IO7CFU /头份，猪圆环病毒2型SH株抗原含量不少于IO6 tlTCID5ci/头份。所述二联疫苗组合物中还含有疫苗总量0.01wt%的硫柳萊。
[0044]在根据本发明的一个进一步具体的实施方案中，所述抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物的制备方法，包含如下步骤:
[0045](I)分别将猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪圆环病毒2型SH株菌(毒)种繁殖培养，得到猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和猪圆环病毒2型SH株病毒液。
[0046](2)分别将步骤(1)培养得到的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液中按各自总量加入0.3% (v/v)的甲醛溶液，放置37°C灭活24h，期间搅拌3飞次，根据计数结果浓缩菌液；猪圆环病毒2型SH株病毒液中加入0.2% (v/v)的甲醛溶液，放置37°C灭活18h，期间搅拌3飞次，根据毒力测定结果调整病毒液含量。
[0047](3)将上述已灭活、浓缩的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪圆环病毒2型SH株病毒液，按2:2:2:2比例混合，并加入疫苗总量0.01wt%的硫柳汞，然后和佐剂进行乳化，佐剂含量为10Wt9T25wt% ;成品猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗抗原含量为灭活前猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型、血清7型活菌数均不少于2.0 X IO7CFU /头份，灭活前猪圆环病毒2型SH株抗原含量不少于IO6 0TCID50/ 头份。
[0048](4)以适量体积分装新型猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗，盖上瓶盖，并压招盖。
[0049]在上述抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物的制备过程中，从步骤(1)培养好的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和猪圆环病毒2型SH株病毒液取样，进行`纯粹性检验和活菌计数；从步骤(2)已灭活好的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和猪圆环病毒2型SH株病毒液取样进行灭活检验和安全性检验；对步骤(3)得到的新型猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗进行无菌检验、安全检验和效力检验，以确保疫苗的安全性、可靠性。
[0050]本发明基于现有技术不足而提供一种可以同时预防由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒2型引起的猪圆环病毒2型相关疾病及二者的混合感染的新型猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗(LC株+YC株+YS株+SH株)；临床上达到一针多防的效果，降低成本，并可以满足不同用户的要求。
[0051]本发明中预防和治疗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物中，两种抗原成分混合后，彼此之间不仅未产生互相免疫干扰的现象，而且意外发现猪胸膜肺炎放线杆菌可以增强猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。正如本发明实施例所证明，在猪圆环病毒2型抗原量减半的情况下仍旧可以维持猪圆环病毒2型抗原的免疫效果，这在本领域技术人员看来是出乎意料的。
[0052]本发明还进一步采用畜类易于接受的水佐剂代替传统的油佐剂用于配制疫苗，在避免佐剂造成的副反应的同时，也提高了疫苗的可吸收性。[0053]本发明中抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的抗原效价高，免疫方便快捷，与现有疫苗中的分次免疫，至少需要打2针或者3针才能防治以上2种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。通过本发明中抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物与常规单苗的效力比较发现，本发明的二联苗安全性更佳，避免了多次免疫接种出现的不良反应。
【专利附图】

【附图说明】
[0054]图1是实施例5中PCV2-0RF2目的片段大小图；
[0055]图1中附图标记的含义如下:1PCV2-0RF2目的片段；2DL2000Marker
[0056]图2是实施例5中重组猪圆环病毒2型0RF2蛋白SDS-PAGE电泳图；
[0057]图2中附图标记的含义如下:1预染低分子量蛋白质Marker; 2pPIC9K_0RF2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清；3pPIC9K-0RF2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清；4pPIC9K-0RF2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清；5细胞阴性对照。
[0058]图3是实施例5中重组猪圆环病毒2型0RF2蛋白Western blotting (蛋白印迹)图；
[0059]图3中附图标记的含义如下:1预染低分子量蛋白质Marker ;2pPIC9K_0RF2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；3pPIC9K-0RF2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；4pPIC9K-0RF2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；5细胞阴性对照与阳性血清反应结果。
[0060]菌种保藏
[0061]胸膜肺炎放线杆菌血清I 型 LC 株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotypelstrain LC, APP-1),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏编号:CCTCC NO:M2011458。
[0062]猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype5strain YC, APP-5),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保减中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区洛咖山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏编号:CCTCCN0:M 2011459。
[0063]猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype7strain YS, APP-7),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保减中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区洛咖山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏编号:CCTCCN0:M 2011460。
[0064]为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保存并保藏。
【具体实施方式】
[0065]为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0066]实施例
[0067]实施例1:抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物的制备和检验
[0068]1.生产用菌(毒)种的制备
[0069]猪圆环病毒2型SH株的制备:将毒种用MEM培养基(Gibco?，Invitrogen公司)作10倍稀释，按5%体积接种于PK15 (ATCC，保藏编号为CCL-33)细胞培养，37°C吸附30min，加入含4%犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37°C培养4日，冻融2~3次,收获病毒,病毒滴度为106_5TCID5(l/ml。
[0070]猪胸膜肺炎放线杆菌菌种的制备:将猪胸膜肺炎放线杆菌I型LC株、5型YC株和7型YS株划线接种于含5% (v/v)新生牛血清的TSA/NAD平板，37°C培养24h，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级菌种挑取单个菌落，接入含5% (v/v)新生牛血清的TSB/NAD液体培养基中，37°C摇床180rpm振荡培养16h，同时取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合猪胸膜肺炎放线杆菌的形态特征，应无任何杂菌生长，作为二级种子。
[0071]其中:含5%(v/v)血清的TSA/NAD平板的制备方法:胰蛋白大豆琼脂(TrypticSoyAgar, TSA, BD Difico产品)40克加入949ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121°C高压蒸汽灭菌15min，温度降至60°C左右，加入50ml过滤除菌的牛血清，Iml过滤除菌的1%NAD,充分摇匀后倒平皿。
[0072]含5% (v/v)新 生牛血清的TSB/NAD液体培养基:胰大豆蛋白肉汤(TrypticSoyBroth, TSB, BD Difico产品)30克加入949ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121°C高压蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的牛血清，Iml过滤除菌的1%NAD即成。
[0073]2.病毒液或菌液的培养制备
[0074]猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞(购自ATCC)，倒去细胞培养液，将毒种液按0.1~0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附30min，加入细胞维持液，置37°C旋转(10-?2转/h)培养。每日观察广2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存，应不超过2个月。
[0075]猪胸膜肺炎放线杆菌(I型LC株、5型YC株和7型YS株)菌液的制备:将鉴定合格的猪胸膜肺炎放线杆菌I型LC株、5型YC株和7型YS株的二级种子菌液分别按1:1000(v/v)接种于TSB/NAD液体培养基，置37°C摇床180rpm培养。培养至12~16h，收获。
[0076]3.病毒液或菌液的处理
[0077]猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理:将病毒液用中空纤维滤柱(孔径ΙΟμπι与0.45 μ m)过滤，除去细胞碎片。
[0078]猪胸膜肺炎放线杆菌(I型LC株、5型YC株和7型YS株)菌液的处理:将三种菌液分别以连续离心机(10000转/min)离心后再以PBS (0.01mol/L, ρΗ7.2~7.4)复溶至原体积。
[0079]4.病毒液或菌液的灭活
[0080]猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活:将检验合格的步骤3处理的病毒液加入甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2% (V/V)，随即充分摇匀升温，当温度升至37°C时开始计时，保持18h灭活完毕，加入0.2% (w/v)的焦亚硫酸钠终止灭活，置2~8°C保存。
[0081]猪胸膜肺炎放线杆菌(I型LC株、5型YC株和7型YS株)菌液的灭活:将步骤3中三种不同血清型的菌液，按培养基体积比，缓慢加入终浓度为0.3% (v/v)的甲醛溶液，置37°C灭活，其间每隔4h搅拌一次，24h后取出，进行灭活效果和纯粹检验。
[0082]5.含量测定
[0083](I)猪圆环病毒SH株病毒含量测定
[0084]将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10_5、10' 10^3个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml,同时设立阴性对照，在37°C含5% CO2的温箱中继续培养24h，换含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24h ；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID5(I。每ml病毒含量应≥106_°TCID5(I。
[0085](2)猪胸膜肺炎放线杆菌I型LC株、5型YC株和7型YS株活菌数测定
[0086]将取样按10倍系列稀释至Kr5~10'接种于TSA/NAD固体培养基，37°C培养24h后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数，活菌数应为3.0X IO9飞X 109CFU/ml。
[0087](3)抗原含量测定结果:
[0088]3批猪圆环病毒2型SH株、猪胸膜肺炎放线杆菌LC株、YC株和YS株分别培养三批，分别为K001，K002和K003。抗原的含量见表1，PCV2SH病毒液含量均在106_°TCID5(l/ml以上。
[0089]表1抗原含量测定(滴度)
[0090]
【权利要求】
1.一种抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
2.根据权利要求1所述的二联疫苗组合物，其特征在于: 所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原中的一种或几种，并且，所述猪圆环病毒2型抗原选自猪圆环病毒2型全病毒抗原,含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为猪胸膜肺炎放线杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪胸膜肺炎放线杆菌细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。
3.根据权利要求2所述的二联疫苗组合物，其特征在于: 所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为105.5TCID50 ； 所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的全菌体。
4.根据权利要求3所述的二联疫苗组合物，其特征在于: 所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为4.5 X IO5 0TCID50 ~106.ciTCID5tl ； 所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2 SH株、PCV2 LG株、PCV2 DBN-SX07-2的抗原组合物或疫苗组合物和/或PCV2亚单位抗原； 所述猪传染性胸膜肺炎抗原为灭活的血清型为I型、5型和7型的混合抗原； 所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型的含量至少为1.0X IO7CFU/头份，血清5型的含量至少为1.0X IO7CFU/头份，血清7型的含量至少为1.0X IO7CFU/头份。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于: 所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为9 X IO50TCID50 ； 所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型的含量为2.0 X IO7~5 X IO7CFU/头份，血清5型的含量为2.0XlO7~5X IO7CFU/头份，血清7型的含量为2.0XlO7~5 X IO7CFU/ 头份； 所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2 SH株和/或PCV2 ORF2蛋白； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌体； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株(Actinobacillus pIeuropneumoniaeserotypel strain LC)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011458 ;所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清 5 型 YC 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5strain YC)的保藏编号为=CCTCC NO:M 2011459 ;所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株(ActinobacillusP leuropneumoniae serotype7strain YS)的保藏编号为:CCTCCN0:M 2011460 ;上述菌株均保藏于中国典型培养物保藏中心。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于: 所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型0RF2蛋白的含量为0.5~20 μ g/头份； 所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型的含量为3.0 X IO7~5 X IO7CFU/头份，血清5型的含量为3.0XlO7~5X IO7CFU/头份，血清7型的含量为3.0XlO7~5X IO7CFU/ 头份； 所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为序列表SEQ N0.1的DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N0.2的氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75%以上的氨基酸序列的蛋白； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在80%以上的菌株。
7.根据权利要求6所述的二联疫苗组合物，其特征在于: 所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为5~10 μ g/头份； 所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型的含量为5.0X IO7CFU/头份，血清5型的含量为5.0X IO7CFU/头份，血清7型的含量为5.0X IO7CFU/头份； 所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NOl.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQN02.氨基酸序列的蛋白同源性在80%以上的氨基酸序列的蛋白； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在90%以上的菌株。
8.根据权利要求7所述的二联疫苗组合物，其特征在于: 所述猪圆环病毒2型0RF2蛋白为与序列表SEQ N01.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQN02.氨基酸序列的蛋白同源性在90%以上的氨基酸序列的蛋白； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在95%~99%以上的菌株。
9.一种根据权利要求1~8中任意一项所述二联疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤:将两种以上的抗原混合后制得抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪圆环病毒2型抗原与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
10.根据权利要求1~8中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于:所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗原。
【文档编号】A61P31/04GK103656634SQ201210314958
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月30日 优先权日:2012年8月30日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司