专利名称：利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法
技术领域：
本发明属于生物体复杂组织器官的人工制造技术领域，特别涉及利用合成高分子材料、细胞基质材料制备组织器官前体的工艺方法，超出了目前组织工程技术领域。
背景技术：
组织工程学是由美国国家科学基金委员会于1987年正式提出和确定的，是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学。Wolter在1984年正式提出“组织工程” 一词，1987年美国国家科学基金委员会正式确定组织工程学成为一门新学科。在现今的医疗过程中，器官移植术已经成为一种重要的治疗手段，但是移植器官来源的短缺长久困扰该项技术的应用。以我国为例，近年来，每年需要进行各种器官移植的 患者约有150万人，但可移植器官数量不到I. 5万份。除开供源的不足，器官移植术亦面临一定的道德与法律等非医学因素困境。移植器官来源问题以及非医学因素困境，即使从长期来看，亦是不易解决的，但是，通过复杂组织器官制造技术，以自体干细胞生成供移植的器官，从理论上来讲，可以克服器官移植中供源不足以及排异反应等问题，同时，也可以规避现阶段器官移植所需面对的非医学因素困境。申请号为201110448154. 3的发明专利《基于一种组合模具的复杂器官前体的制备方法》中提供了一种多分支及多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，也是利用组合模具的分层灌注来成形含多分支结构的复杂组织器官前体。该发明的缺点在于采用直接拆模的方式对模具的内部形状及表面粗糙度要求较高，同时在成形过程中由于高分子溶液充满型腔，交联剂或聚合剂与材料接触面过少，容易影响交联或聚合效果，继而影响细胞基质层的成形效果。
发明内容
本发明的目的是利用旋转组合模具的方法制备纺锤状复杂器官前体，以克服目前组织工程领域存在的细胞很难渗入到三维支架中、含多种细胞的支架成形不易等缺点；同时避免模具的内部形状及表面粗糙度对成形的影响，使成形过程更加稳定、可靠。本发明的技术方案如下一种利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤进行I)将不同天然高分子溶液与不同动物体细胞悬浮液分别按I 9 :9 I体积比混合制成多种细胞基质溶液；天然高分子溶液的质量百分浓度为1% 30% ;2)将内模具底部插入阵列孔板的孔洞中，阵列孔板镶嵌在底座模具底层，底座模具采用从下至上的多层台阶结构，内模具采用多级分支结构，且各级内环模具厚度与底座模具对应的台阶宽度相同；将第一级内环模具套在底座模具的第一级台阶上，之后将其中一种细胞基质溶液灌注到内模具和第一级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转并使第一级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中采用物理或化学交联或聚合方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除第一级内环模具，形成稳定的第一层细胞基质层；3)将第二级内环模具套在底座模具的第二级台阶上，将另一种细胞基质溶液灌注到第一层细胞基质层和第二级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转并使第二级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中采用物理或化学交联或聚合方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除第二级内环模具，形成稳定的第二层细胞基质层；4)重复步骤2)与步骤3)，得到含不同动物体细胞的多层细胞基质层结构；5)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为5% 30%的合成高分子溶液； 6)将外环模具套在底座模具的最外级台阶上，将合成高分子溶液灌入步骤4)中得到的多层细胞基质层结构与外环模具的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转并使外环模具保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用细胞培养液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层，然后依次去除外环模具、底座模具和内模具，制成含多分支通道的半纺锤状复杂器官前体；7)将两个半纺锤体通过天然或合成高分子溶液渗透粘连合并在一起，形成具有内分支管道的完整纺锤状复杂器官前体。所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的细胞基质层与合成高分子材料层在成形过程中，底座模具连同内模具与阵列孔板的旋转速度为 5 IOOr /min。所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的内模具由尼龙、合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯或聚氨酯软性材料制成的实心管组合而成，内模具级数为I 10，每级分支数为2 100 ;内模具最末级分支的直径范围在O. Imm 5mmο所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于底座模具的台阶从各级台阶宽度相同或不同，台阶的级数为2 20 ;底座模具外形及各级台阶截面为圆型；底座模具的材料为金属或是硬质合成高分子材料。所述的一种利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入细胞生长因子及抗凝血因子。所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的细胞生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子；抗凝血因子采用肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖。所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、聚乳酸、聚酯和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的一种或几种材料的复合物。所述的一种利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于步骤I)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化钠、3 —羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液；步骤5)中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或1，4-二氧六环。本发明利用旋转成形时非牛顿流体的Weissenbery效应可形成天然的半纺锤状结构，同时避免了模具的内部形状及表面粗糙度对成形的影响，增加了交联剂或聚合剂与材料的接触面积、使成形过程更加稳定、可靠。本发明可成形含不同细胞与合成高分子支架的复杂含多分支通道的纺锤状三维结构，克服了目前组织工程领域存在的细胞很难渗入到三维支架中、含多种细胞的支架成形不易等缺点。
图I是成形第一层细胞基质层时的模具剖面图(以单级分支双层结构为例)。图2成形合成高分子材料层时的模具剖面图(以单级分支双层结构为例)。图3是成形后的半纺锤状前体剖面图(以单级分支双层结构为例)。图4是内模具的三维效果图(以三级分支为例)。图5a是是底座模具的俯视图；图5b是底座模具的侧视剖面图(以二级台阶为例)。图6是阵列孔板的俯视图(以16孔为例)。图7内环模具的侧视剖面图(外环模具结构相似)。图8a是转速为a的成形效果图；图8b是转速为b的成形效果图；图8c是转速为c的成形效果图(a〈b〈c)。在图I至图8中I 一内模具；2 —阵列孔板；3 —底座模具；4 一内环模具；5 —细胞基质层；6 —外环模具-J 一合成高分子材料层。具体实施方法本发明提供的一种利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体，其具体工艺步骤如下I)将不同天然高分子溶液与不同动物体细胞悬浮液按I 9 :9 I体积比混合制成多种细胞基质溶液；天然高分子溶液的质量百分浓度为1% 30% ;2)将内模具I底部插入阵列孔板2的孔洞中，阵列孔板2镶嵌在底座模具3底层，底座模具3采用从下至上的多层台阶结构，内模具I采用多级分支结构，且各级内环模具
(4)厚度与底座模具(3)对应的台阶宽度相同；将第一级内环模具4a套在底座模具3的第一级台阶上，之后将其中一种细胞基质溶液灌注到内模具I和第一级内环模具4a之间的缝隙中，使底座模具3、内模具I和阵列孔板2 —起旋转并使第一级内环模具4a保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中采用物理或化学交联或聚合方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除第一级内环模具4a，形成稳定的第一层细胞基质层5a;具体成形过程示意图如图I所示(以单级分支双层结构为例)；3)将第二级内环模具4b套在底座模具3的第二级台阶上，将另一种细胞基质溶液灌注到第一层细胞基质层5a和第二级内环模具4b之间的缝隙中，使底座模具3、内模具I和阵列孔板2 —起旋转并使第二级内环模具4b保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中采用物理或化学交联或聚合方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除第二级内环模具4b，形成稳定的第二层细胞基质层5b ；4)重复步骤2)与步骤3)，得到含不同动物体细胞的多层细胞基质层结构；5)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为5% 30%的合成高分子溶液；6)将外环模具6套在底座模具3的最外级台阶上，将合成高分子溶液灌入步骤4) 中得到的多层细胞基质层结构与外环模具6的缝隙中，使底座模具3、内模具I和阵列孔板
2一起旋转并使外环模具6保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用细胞培养液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层7，具体成形过程示意图如图2所示(以单级分支双层结构为例)；然后依次去除外环模具6、底座模具3和内模具1，制成含多分支通道的半纺锤状复杂器官前体，结构如图3所示(以单级分支双层结构为例)；7)将两个半纺锤体通过天然或合成高分子溶液渗透粘连合并在一起，形成具有内分支管道的完整纺锤状复杂器官前体。本发明的优选方案是在细胞基质溶液中加入冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物；在细胞基质溶液中加入细胞生长因子及抗凝血因子，所述的细胞生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子，抗凝血因子采用肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖；合成高分子材料采用聚氨酯、聚乳酸、聚酯和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物；天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的一种或几种材料的复合物；步骤I)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化钠、3 —羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液；步骤5)中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或I，4-二氧六环。内模具I由尼龙、合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯或聚氨酯软性材料制成的实心管组合而成，内模具)级数为I 10，每级分支数为2 100 ;内模具I最末级分支的直径范围在O. Imm 5mm,如图4所示(以三级分支为例)。底座模具3的台阶各级台阶宽度相同或不同，台阶的级数为2 20 ;底座模具3外形及各级台阶截面为圆型；底座模具3的材料为金属或是硬质合成高分子材料；底座模具3的俯视图如图5a所示,侧视剖面图如图5b所示(以二级台阶为例)。阵列孔板2镶嵌在底座模具3最内级台阶底层；阵列孔板2上的孔洞数量为2 400个，孔洞阵列排布，孔洞直径与内模具I的末端分支直径相吻合；阵列孔板2材料为金属或是硬质合成高分子材料；阵列孔板2的俯视图如图6所示(以16孔为例)。内环模具4及外环模具6外形与底座模具3中各自对应的台阶形状相吻合；内环模具4及外环模具6为中空的外壳结构，其外壳厚度与底座模具3中各自对应的台阶宽度相吻合，底部全部开口，顶部部分开口 ；内环模具4及外环模具6的材料为金属或是硬质合成高分子材料；内环模具4的侧视剖面图如图7所示。细胞基质层(5)与合成高分子材料层(7)在成形过程中，底座模具(3)连同内模具⑴与阵列孔板⑵的旋转速度为5 100r/min。由于非牛顿流体的Weissenbery效应，细胞基质溶液与合成高分子溶液在旋转作用下向中轴爬杆呈半纺锤状，从而使成形后的细胞基质层(5)与合成高分子材料层(7)形成半纺锤状外形；整体纺锤状器官前体的外形曲率与底座模具(3)的旋转速度正相关，如图8a、图8b与图8 c所示，图中a〈b〈c。实施例I :I)使用黄铜制备含三级台阶的底模具，内环模具与外环模具，用尼龙制备含一级分支的内模具；2)配制1%纤维蛋白原溶液，将内模具底部插入底座模具的阵列孔板中，阵列孔板镶嵌在底座模具底层，将第一级内环模具套在底座模具的第一级台阶上，在内模具与第一级内环模具间注入纤维蛋白原与内皮细胞的混合物，细胞密度为I X IO7个/mL，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为5r/min)并使第一级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用凝血酶溶液(20IU/mL)浸泡成形物2分钟聚合，去除第一级内环模具，形成稳定的第一层细胞基质层；3)将第二级内环模具套在底座模具的第二级台阶上。将纤维蛋白原/脂肪干细胞混合物(细胞密度为I X IO5个/mL)，加入肝细胞生长因子(HGFO. 5ng/mL)、人血小板衍化生长因子(BB或TOGF-BB 50ng/mL)、转化生长因子β (TGF0 110ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF 2. 5ng/mL)，灌注到第一层细胞基质层和第二级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为5r/min)并使第二级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用凝血酶溶液(20IU/mL)使细胞基质溶液中的纤维蛋白原聚合，去除内环模具，形成稳定的第二层细胞基质层；(4)配备浓度为10% (W/V)的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入1% (W/W)的肝素，外环模具套在底座模具的最外级台阶上，将复合肝素的PLGA/四乙二醇溶液灌入多层细胞基质层结构与外环模具的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为5r/min)并使外环模具保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用细胞培养液萃取溶剂，形成纺锤状的外层合成形成PLGA外支架层，然后依次去除外环模具、底座模具与内模具，制成含多分支通道的半纺锤状人工血管前体；(5)将两个半纺锤体通过PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液渗透粘连合并在一起,形成具有内分支管道的完整纺锤状人工血管前体。实施例2 :( I)用硅橡胶制备含四级台阶的底模具，内环模具与外环模具，用聚乙烯制备含二级分支的内模具；(2)配制5%纤维蛋白原溶液，将内模具底部插入底座模具的阵列孔板中，阵列孔板镶嵌在底座模具底层，将第一级内环模具套在底座模具的第一级台阶上，在内模具与第一级内环模具间注入含1%紫杉醇的纤维蛋白原/内皮细胞混合物(细胞密度为I X IO7个/mL)，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为10r/min)并使第一级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分钟聚合，去除第一级内环模具，形成稳定的第一层细胞基质层；(3)将第二级内环模具套在底座模具的第二级台阶上，将纤维蛋白原与脂肪干细胞的混合物，细胞密度为I X IO6个/mL，灌注到第一层细胞基质层和第二级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为lOr/min)并使第二级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分钟，使细胞基质溶液中的纤维蛋白原聚合，去除第二级内环模具，形成稳定的第二层细胞基质层；(4)将第三级内环模具套在底座模具的第三级台阶上，将纤维蛋白原/肝细胞混合物(细胞密度为IXlO7个/mL)灌注到第二层细胞基质层和第三级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为lOr/min)并使第三级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分钟，使细胞基质溶液中的纤维蛋白原聚合，去除第三级内环模具，形成稳定的第三层细胞基质层；(5)将外环模具套在底座模具的最外级台阶上，将5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇，搅拌均匀，灌入三层细胞基质层结构与外环模具的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为lOr/min)并使外环模具保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成半纺锤状的外层聚氨酯层，然后依次去除外环模具、底座模具与内模具，制成含多分支通道的半纺锤状人工肝脏前体；(6)将两个半纺锤体通过5%的聚氨酯/乙二醇溶液渗透粘连合并在一起，形成具有内分支管道的完整纺锤状人工肝脏前体。实施例3 :( I)用聚四氟乙烯制备含五级台阶的底模具，内环模具与外环模具，用聚氨酯制备含三级分支的内模具；(2)配制10%胶原溶液，将内模具底部插入底座模具的阵 列孔板中，阵列孔板镶嵌在底座模具底层，将第一级内环模具套在底座模具的第一级台阶上，之后将1%柠檬酸钠的胶原/内皮细胞混合物(细胞密度为I X IO7个/mL)灌注到内模具和第一级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为20r/min)并使第一级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用物理交联方法在37°C下放置10分钟，使胶原/内皮细胞混合物结构稳定，去除第一级内环模具，形成稳定的第一层细胞基质层；(3)将第二级内环模具套在底座模具的第二级台阶上，将胶原/内皮细胞溶液灌注到第一层细胞基质层和第二级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为20r/min)并使第二级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用物理交联方法在37°C下放置10分钟，使胶原/内皮细胞混合物结构稳定，去除第二级内环模具，形成稳定的第二层细胞基质层；(4)将第三级内环模具套在底座模具的第三级台阶上，将胶原/平滑肌细胞混合物(细胞密度为I X IO7个/mL)灌注到第二层细胞基质层和第三级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为20r/min)并使第三级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用物理交联方法在37°C下放置10分钟，使胶原/平滑肌细胞混合物结构稳定，去除第三级内环模具，形成稳定的第三层细胞基质层；(5)将第四级内环模具套在底座模具的第四级台阶上，将胶原与脂肪干细胞/乳鼠心肌细胞(I :1)的混合物，细胞密度为I X IO6个/mL，灌注到第三层细胞基质层和第四级内环模具之间的缝隙中，，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为20r/min)并使第四级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用物理交联方法在37°C下放置10分钟，使胶原与脂肪干细胞/乳鼠心肌细胞的混合物结构稳定，去除第四级内环模具，形成稳定的第四层细胞基质层；(6)将外环模具套在底座模具的最外级台阶上并夹紧固定，将浓度为30%的聚乳酸/异丙醇溶液，加入30%的柠檬酸钠，搅拌均匀，灌入多层细胞基质层结构与外环模具的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为20r/min)并使外环模具保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成半纺锤状的聚乳酸层，然后依次去除外环模具、底座模具与内模具，制成含多分支通道的半纺锤状人工心脏前体；(6)将两个半纺锤体通过浓度为30%的聚乳酸/异丙醇溶液渗透粘连合并在一起，形成具有内分支管道的完整纺锤状人工心脏前体。实施例4 : (I)用聚四氟乙烯制备含二级台阶的底模具，内环模具与外环模具，用合成纤维制备含四级分支的内模具；(2)纤维蛋白原和明胶两种天然生物材料分别溶于磷酸缓冲液(PBS)溶液中制成10%和30%的高分子溶液，再按1:1 (v/v)比例混合均匀。然后按体积比加入10%的二甲基亚砜、5%葡聚糖；将脂肪干细胞与肾小球细胞按I :1比例混合均匀，加入高分子溶液中，得到脂肪干细胞一肾小球细胞-明胶一纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物(细胞密度为IX IO4个/mL)，将内模具底部插入底座模具的阵列孔板中，阵列孔板镶嵌在底座模具底层，将第一级内环模具套在底座模具的第一级台阶上，之后将脂肪干细胞一肾小球细胞-明胶一纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物灌注到内模具和第一级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为50r/min)并使第一级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用凝 血酶溶液(30IU/mL)浸泡2分钟，使细胞基质溶液中的纤维蛋白聚合，去除第一级内环模具，形成稳定的细胞基质层；(3)将外环模具套在底座模具的最外级台阶上，将30%PU/四乙二醇溶液灌入细胞基质层结构与外环模具的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为50r/min)并使外环模具保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成半纺锤状的外PU层，然后依次去除外环模具、底座模具与内模具，制成含多分支通道的半纺锤状人工肾脏前体；(4)将两个半纺锤体通过30%PU/四乙二醇溶液渗透粘连合并在一起，形成具有内分支管道的完整纺锤状人工肾脏前体。实施例5 : (I)用不绣钢制备含二级台阶的底模具，内环模具与外环模具，用聚碳酸酯制备含五级分支的内模具；制备不绣钢材质的旋转组合模具；(2)将纤维蛋白原溶于磷酸缓冲液(PBS)溶液中制成10%高分子溶液。然后按体积比加入20%的甘油、5%葡聚糖、O. 1%硫酸化壳聚糖；将脂肪干细胞与胰岛细胞按2 1比例混合均匀，加入高分子混合溶液中(细胞密度为I X IO7个/mL)，得到脂肪干细胞一胰岛细胞、明胶一纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物；将内模具底部插入底座模具的阵列孔板中，阵列孔板镶嵌在底座模具底层，将第一级内环模具套在底座模具的第一级台阶上，之后将脂肪干细胞一胰岛细胞、明胶一纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物灌注到内模具和第一级内环模具之间的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为lOOr/min)并使第一级内环模具保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡2分钟，使细胞基质溶液中的纤维蛋白聚合，去除第一级内环模具，形成稳定的细胞基质层；
(3)将外环模具套在底座模具的最外级台阶上，将含3%紫杉醇的30%聚酯/四异二醇溶液灌入细胞基质层结构与外环模具的缝隙中，使底座模具、内模具和阵列孔板一起旋转(转速为lOOr/min)并使外环模具保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用细胞培养液萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成半纺锤状的聚酯层，然后依次去除外环模具、底座模具与内模具，制成含多分支通道的半纺锤状人工胰岛前体；(4)将两个半纺锤体通过含3%紫杉醇的30%聚酯/四异二醇溶液渗透粘连合并在一起，形成具有内分支管道的完整纺锤状人工胰岛前体。
权利要求
1.利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤进行 1)将不同天然高分子溶液与不同动物体细胞悬浮液分别按I 9:9 I体积比混合制成多种细胞基质溶液；天然高分子溶液的质量百分浓度为1% 30% ; 2)将内模具⑴底部插入阵列孔板(2)的孔洞中，阵列孔板(2)镶嵌在底座模具(3)底层，底座模具(3)采用从下至上的多层台阶结构，内模具(I)采用多级分支结构，且各级内环模具(4)厚度与底座模具(3)对应的台阶宽度相同；先将第一级内环模具(4a)套在底座模具(3)的第一级台阶上，之后将其中一种细胞基质溶液灌注到内模具(I)和第一级内环模具(4a)之间的缝隙中，使底座模具(3)、内模具⑴和阵列孔板(2) —起旋转并使第一级内环模具(4a)保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中采用物理或化学交联或聚合方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除第一级内环模具(4a)，形成稳定的第一层细胞基质层(5a)； 3)将第二级内环模具(4b)套在底座模具(3)的第二级台阶上，将另一种细胞基质溶液灌注到第一层细胞基质层(5a)和第二级内环模具(4b)之间的缝隙中，使底座模具(3)、内模具(I)和阵列孔板(2) —起旋转并使第二级内环模具(4b)保持不动，使细胞基质溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中采用物理或化学交联或聚合方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，去除第二级内环模具(4b)，形成稳定的第二层细胞基质层(5b)； 4)重复步骤2)与步骤3)，得到含不同动物体细胞的多层细胞基质层结构； 5)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为5% 30%的合成高分子溶液； 6)将外环模具(6)套在底座模具(3)的最外级台阶上，将合成高分子溶液灌入步骤4)中得到的多层细胞基质层结构与外环模具(6)的缝隙中，使底座模具(3)、内模具⑴和阵列孔板(2) —起旋转并使外环模具(6)保持不动，使合成高分子溶液形成半纺锤状外形，旋转过程中用细胞培养液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层(7)，然后依次去除外环模具￠)、底座模具(3)和内模具(I)，制成含多分支通道的半纺锤状复杂器官前体； 7)将两个半纺锤体通过天然或合成高分子溶液渗透粘连合并在一起，形成具有内分支管道的完整纺锤状复杂器官前体。
2.按照权利要求I所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的细胞基质层(5)与合成高分子材料层(7)在成形过程中，底座模具(3)、内模具(I)和阵列孔板⑵一起旋转的旋转速度为5 100r/min。
3.按照权利要求I或2所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的内模具(I)由尼龙、合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯或聚氨酯软性材料制成的实心管组合而成，内模具(I)级数为I 10，每级分支数为2 100 ;内模具(I)最末级分支的直径范围在O. Imm 5mm。
4.按照权利要求I或2所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于底座模具(3)的各级台阶宽度相同或不同，台阶的级数为2 20 ;底座模具(3)外形及各级台阶截面为圆型；底座模具(3)的材料为金属或是硬质合成高分子材料。
5.按照权利要求I所述的利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。
6.按照权利要求I所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入细胞生长因子及抗凝血因子。
7.按照权利要求6所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的细胞生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子；抗凝血因子采用肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖。
8.按照权利要求I所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、聚乳酸、聚酯和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。
9.按照权利要求I所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的一种或几种材料的复合物。
10.按照权利要求I所述的利用旋转组合模具制备复杂器官前体的方法，其特征在于步骤I)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的O.09M氯化钠、3 —羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液；步骤5)中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或I，4-二氧六环。
全文摘要
利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法，该方法首先制备细胞基质溶液和合成高分子溶液，组装带有多级分支内模具的组合模具，将细胞基质溶液灌注到内环模具与底座模具之间，旋转底座模具并经物理或化学交联或聚合形成细胞基质层；将合成高分子溶液灌注到细胞基质层和外环模具之间，旋转底座模具并用细胞培养液或PBS萃取后形成外支架，去除组合模具形成含不同细胞与合成高分子支架的具有多分支通道的半纺锤状三维结构，将两个半纺锤体通过天然或合成高分子溶液渗透粘连合并形成具有内分支管道的完整纺锤状复杂器官前体,克服了目前细胞很难渗入到三维支架中、含多种细胞的支架成形不易等缺点。
文档编号A61L27/24GK102871771SQ201210324600
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者王小红, 黄源文 申请人:清华大学