一种特异抑制肿瘤细胞转移的新型靶向肽tmtp1-kla的制备与应用的制作方法

一种特异抑制肿瘤细胞转移的新型靶向肽tmtp1-kla的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种特异抑制肿瘤细胞转移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制备与应用，其技术特征在于：制备一种能够同时识别高转移潜能肿瘤细胞并可抑制肿瘤细胞生长与转移的多肽TMTP1-GG-D(KLAKLAK)2，该多肽可将抗菌肽特异性地输送到恶性肿瘤组织及转移灶局部，以选择性的杀伤具有高转移潜能的肿瘤细胞，而没有明显的毒副作用，有效抑制肿瘤的生长与转移，有望成为一种抗肿瘤新药，可以解决目前肿瘤分子靶向治疗技术和实践中关键的不足之处。本发明的目的，在于提供一种能够同时特异性识别和抑制具有高转移潜能倾向的肿瘤细胞的多肽，从而克服现有靶向性药物存在副作用大、特异性不强等问题，以期在临床治疗中发挥高效、特异的肿瘤抑制和杀灭作用，使这一新的多肽可达到更大程度上靶向性杀灭肿瘤细胞的治疗目的，此外，本发明也将为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。
【专利说明】一种特异抑制肿瘤细胞转移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种特异抑制肿瘤细胞转移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制备与应用，其技术特征在于:制备一种能够同时识别高转移潜能肿瘤细胞并可抑制肿瘤细胞转移的多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2，该多肽可以选择性的杀伤具有高转移潜能的肿瘤细胞，而没有明显的毒副作用，有效抑制肿瘤的生长与转移。
【发明内容】
属于蛋白质多肽领域。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是严重危害人类健康的一类疾病。确切证据表明，90%以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移或复发。近年来，肿瘤治疗取得了长足进步，特别是对白血病、恶性淋巴瘤等的治疗有了突破，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤大多数的实体瘤(如卵巢癌、胃癌、肝癌等)的治疗未能达到满意的效果。传统的恶性肿瘤治疗模式(手术、放疗、化疗)虽然是目前肿瘤治疗的主要手段，但尚无法做到从根本上清除肿瘤，且由于缺乏特异性，在取得疗效的同时也往往带来较大的毒副作用。随着生物技术的革命性进展和对恶性肿瘤发生发展分子机制的深入研究，临床医学包括肿瘤学发生了重大变革，具有较低不良反应和良好疗效的分子靶向治疗越来越受到国内外学者的重视，代表了肿瘤治疗的未来趋势。
[0003]肿瘤分子靶向治疗是利用具有一定特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法，又称为“导弹治疗”。目前肿瘤分子靶向治疗的手段主要有两类:单克隆抗体和靶向性多肽(Homing peptide)。癌症治疗性抗体目前已有近10年历史,第一种应用此技术制备的抗体在美国已通过FDA的认证。我们知道，单链抗体(ScFv)在临床应用中具有巨大的潜力，然而快速的血浆清除及大量生产的困难限制了它的实际应用。Afanasieva TA等利用噬菌体抗体库筛选并获得了一种抗VEGF的单链抗体(ScFv — V65)。动物实验证明，这种抗体在荷瘤鼠体内可以明显抑制肿瘤生长，与对照组比较达50%。之后，他们对腺病毒进行改造，使之能编码、合成ScFv - V65，这样表达出来的ScFv — V65融合蛋白其半衰期明显延长，血浆清除率降低。当给荷瘤小鼠应用这种重组病毒后，其肿瘤生长明显受到限制；当重复多次系统给药时，这种抑制作用更为明显。实验证明，ScFv作为一种新的基因治疗方法，克服了传统抗体治疗的许多局限性，具有广阔的应用前景。针对肿瘤抗原设计的单克隆抗体，业已成为肿瘤导向治疗中最常用的载体，但这些单克隆抗体的种类却非常有限，并且在实际应用中还存在以下缺点:①体积较大，在肿瘤组织、细胞中穿透力较弱，并可被肝脏及网状内皮系统非特异性摄取、吞噬对肝脏、骨髓的剂量相关毒性作用免疫原性强。
[0004]而靶向性多肽是目前认为比较理想的一种肿瘤靶向性治疗的载体，它们具有:①血浆清除速度快、高亲和力、高特异性；②良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；③易于化学合成并且低免疫原性的特点，可减少、避免上述单克隆抗体的不足。因而近年来，许多学者将目光转向应用肽库技术寻找能与肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞特异性结合的短肽，以达到靶向肿瘤的目的。肽库技术是将基因型、表型及分子结合活性与噬菌体/细菌的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选技术。目前已成功的应用于抗原表位分析、单抗筛选、蛋白质功能拮抗多肽或模拟多肽的确定等方面。Arap W等对乳腺癌荷瘤小鼠进行肽库筛选后获得一系列与肿瘤血管特异性结合的短肽，其中的R⑶序列被证实可与α V整合素结合。将RGD序列与阿霉素交联后应用于荷瘤小鼠，发现药物的抗肿瘤疗效显著增加而毒性作用明显减少。Laakkonen P等利用噬菌体肽库筛选获得靶向乳腺癌肿瘤及其淋巴结转移灶的导向性多肽LyP-Ι，为早期诊断肿瘤及其转移灶靶向性治疗奠定了基础。KarassevaN等发现了可与上皮生长因子受体一 2 (ErbB-2)特异性结合的6肽KCCYSL，它可特异性与乳腺癌及前列腺癌细胞系结合，而与正常细胞则无结合。另外，Noda K等利用噬菌体肽库技术筛选并获得了能与肿瘤细胞表面碳水化合物抗原(carbohydrate antigens)特异性结合的肽段。Peletskaya EN等报道了利用肽库技术筛选与Thomsen-Friedenreich (TF)肿瘤相关抗原特异性结合的肽段。TF抗原在大约90%的原发癌灶、淋巴瘤以及它们的转移灶细胞表面表达，并与肿瘤转移能力增强有关。而Landon LA等则通过一系列的改造，大大增强了筛选获得的肽段与TF抗原的亲和力及其水溶性。
[0005]抗菌肽是一种天然免疫系统中的小分子多肽，具有抗肿瘤活性，热稳定性好、水溶性好、选择性强、毒副反应低、无免疫原性、作用迅速、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点，不仅可以抑杀细菌、真菌、病毒和寄生虫，对多种癌细胞、转化细胞和实体瘤也有明显的抑制作用，在肿瘤的分子靶向治疗中具有重要意义。目前已发现98种抗菌肽具有抗肿瘤活性，这些抗菌肽一般由12~55个氨基酸残基组成。与传统的抗肿瘤化疗药物相比，抗菌肽可以选择性作用于肿瘤细胞，对正常细胞损伤小，对人体几乎没有毒性，而且不易产生耐药性，其为人们获得一种理想的化疗药物带来了希望。利用肿瘤的表面分子为靶点，将特异性分子与抗菌肽结合，由其介导抗菌肽与肿瘤细胞结合，可达到特异性杀伤肿瘤的效应。Warren等针对前列腺肿瘤特异性抗原PSMA设计出被2个Y谷氨酰修饰的穿孔肽，对PSMA阳性的前列腺细胞有高度的溶细胞活性，对PSMA阴性的细胞没有作用。β LH的片段与horl4的复合物，可以选择性杀伤卵巢癌细胞。蛋白转运体也可用来转运抗菌肽，Jeffrey等将抗菌肽1)(1(1^1(1^1()2与载体2?1025结合，经注射后对实体瘤产生了很好的抑制效果。Ellerby等人将抗菌肽序列d(KLAKLAK)2与血管定位序列组合，该定位抗菌肽通过线粒体途径诱导血管生成性内皮细胞凋亡,体内裸鼠实验`表明该抗菌肽引起肿瘤细胞凋亡和坏死，Chen等报道了 RGD-tachyplesin诱导肿瘤细胞和内皮细胞的凋亡，该凋亡受Fas死亡受体途径和线粒体途径共同调控，Mai等人将抗菌肽序列d(KLAKLAK)2与蛋白转导序列PTD结合，该抗菌肽在体外可迅速诱导一系列肿瘤细胞凋亡，并且可以通过定位注射引起体内实体瘤的凋亡，因此认为该抗菌肽可用于临床治疗可触及的实体瘤，并可用于放疗、免疫治疗和基础化学治疗的联合辅助治疗。
[0006]在前期研究工作中，我们利用细菌鞭毛肽库对具有不同转移潜能的前列腺癌细胞进行正负筛选，获得一段5肽序列，命名为“TMTP1”;令人惊喜的是，TMPl肽对高转移前列腺癌肿瘤、高转移潜能的乳腺癌具有很好的靶向能力；此外，TMTPl肽对前列腺癌的自发肝转移灶即使直径仅有Imm亦有很好的识别能力。实验结果表明，我们通过肽库技术筛选获得的TMTPl是一种靶向性良好的肿瘤导向肽，有望应用于恶性肿瘤及其转移灶的早期诊断及治疗。本发明在前期工作基础上将特异性杀伤肿瘤的抗菌肽序列d(KLAKLAK)2与TMTPl融合，可将抗菌肽特异性地输送到恶性肿瘤组织及转移灶局部，靶向性地杀灭肿瘤细胞，减轻对正常组织的毒副作用，有望成为一种抗肿瘤新药，迄今尚未见有相关报道。
[0007]本发明的目的，在于提供一种能够同时特异性识别和抑制具有高转移潜能倾向的肿瘤细胞的多肽，从而克服现有靶向性药物存在副作用大、特异性不强等问题，以期在临床治疗中发挥高效、特异的肿瘤抑制和杀灭作用。

【发明内容】

[0008]基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明提供了一种嵌合的促进高转移潜能肿瘤细胞凋亡的靶向性多肽，其含有与一种抗微生物肽连接的高转移潜能肿瘤细胞导向肽。通过该方案获得的靶向性多肽具有高效靶向抑制高转移潜能肿瘤生长与增殖、可有效抑制其转移等明显优势，而对正常的细胞或组织没有明显的毒副作用，可以解决目前肿瘤分子靶向治疗技术和实践中关键的不足之处。
[0009]本发明的技术方案是:一种嵌合的促进高转移潜能肿瘤细胞凋亡的靶向性多肽，其特征是:它是由一个具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTP1、两个甘氨酸GG和一个抗菌肽D (KLAKLAK)2组成。
[0010]与现有的抗肿瘤多肽相比，本发明达到了以下效果:
I本靶向性多肽是由一个具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTPl及抗菌肽d(KLAKLAK)2构建而成，在理论和实际上达到了抗微生物肽杀伤效应的同时尽可能提高肿瘤导向肽TMTPl靶向特性的效果。由于这种全新的设计，使这一新的多肽可达到更大程度上靶向性杀灭肿瘤细胞的治疗目的，此外，本发明也将为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。
[0011]2对肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明，该靶向性多肽对正常细胞无明显影响，而对于有高转移潜能的肿瘤细胞，包括前列腺癌和胃癌，有显著的抑制增殖和诱导凋亡的效应。
[0012]3对肿瘤动物模型的体内研究证实，通过腹腔注射的用药途径，该靶向性多肽对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性。
[0013]4制备出肿瘤导向肽与抗菌肽的靶向性多肽，作为一种有效的抗肿瘤药物，可发挥抗肿瘤的协同作用，使其既具有抗菌肽高效毒性效应的优点，又能在高转移潜能肿瘤组织富集，从而进一步降低新型抗肿瘤多肽的临床用药量，提高量效比，降低毒副作用。应用于研究在体外和体内对细胞增殖、分化、转移和凋亡的影响，以及具有易发生转移的恶性肿瘤如前列腺癌、胃癌的辅助治疗。
[0014]四、【专利附图】

【附图说明】:
图1、抗肿瘤多肽的构建示意图；
图2、抗肿瘤多肽体内外对肿瘤细胞的靶向识别作用；
图3、抗肿瘤多肽抑制肿瘤细胞的增殖；
图4、抗肿瘤多肽镜下诱导肿瘤细胞凋亡的形态学改变；
图5、抗肿瘤多肽流式细胞仪检测诱导肿瘤细胞凋亡的作用；图6、抗肿瘤多肽抑制肿瘤细胞侵袭与转移的作用；
图7、抗肿瘤多肽体内抗肿瘤生长作用；
图8、抗肿瘤多肽体内对肿瘤转移的抑制作用
五、【具体实施方式】:
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0015]依照本发明的技术方案制备的一种嵌合的促进高转移潜能肿瘤细胞凋亡的靶向性多肽，它是由一个具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTPl、两个甘氨酸GG和一个抗菌肽D (KLAKLAK)2组成。
[0016](一)TMTPl-GG-D (KLAKLAK)2 多肽的设计与合成:
在TMTPl的N端和C端分别加上一个甘氨酸和一个半胱氨酸，并利用两个半胱氨酸氧化成二硫键，形成环肽结构，序列如下:GCGNVVRQGC-GG- (KLAKLAK-KLAKLAK) d。cys 二硫键环化，使TMPl具有更稳定的空间构象；(KLAKLAK-KLAKLAK) d用右旋氨基酸。用无菌水溶解合成的TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽，分装后一 20°C保存。
[0017](二)TMTPl-GG-D(KLAKLAK)2多肽对多种高转移性肿瘤细胞靶向识别效应的体内外研究
1.细胞培养
I)用棉手套从液氮内取出保种的PC-3M-1E8，MKN-45，小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞，人正常肝细胞系L02，人正常乳腺细胞MCF-10A，HEK293细胞，迅速放入37°C水浴锅内摇动，快速解冻。
[0018]2)待细胞完全解冻为悬液后，800rpm，室温离心5分钟，用75%乙醇喷洒消毒，超净细胞台内用Iml加样枪小心吸弃冻存液，加新鲜RPMI1640培养基重悬细胞沉淀，转入细胞培养瓶内，补RPMI1640培养基至总体积约6ml。置37°C，5%C02培养箱培养。
[0019]3)次日在倒置显微镜下观察，可见细胞贴壁良好，只有少许死亡细胞悬浮在培养液中，吸弃陈旧培养基，进行首次换液，置培养箱继续培养。
[0020]4)48小时后再次观察，可见复苏细胞融合已达80%_90%，准备传代。吸弃旧培养基，用经高压灭菌过的PBS轻柔洗2遍，加37 °C预热了的0.25%胰酶，覆盖培养瓶底，拧紧盖子在显微镜下观察，细胞界限变清楚，细胞开始变圆时，吸弃培养瓶内胰酶，拧好培养瓶的盖子，放置I分钟后，用吸管轻轻吹打细胞悬液使消化下来的细胞充分分散。并按1:3传代，补足培养液，吹均匀后置37°C培养箱培养。
[0021]5) 2-3天换培养液一次。
[0022]6)选择处于对数生长细胞进行体外效应实验。
[0023]2.TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽的靶向识别效应的体外研究
1)1 μ I FITC标记的TMTPl-GG-D(KLAKLAK)2和FITC-错序肽分别与PC-3M-lE8，MKN-45，小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞，人正常肝细胞系L02，人正常乳腺细胞MCF-10A，HEK293细胞孵育4小时，此后洗去未结合的多肽溶液，固定细胞，激光共聚焦显微镜下观察。
[0024]可见FITC-GG-D(KLAKLAK)2与PC-3M-1E8，MKN_45细胞结合，显示强膜荧光染色；而错序肽与PC-3M-1E8细胞，MKN-45细胞无结合，仅显示为背景染色；此外，FITC-TMP1与小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞，人正常肝细胞系L02，人正常乳腺细胞MCF-10A，HEK293细胞亦无结合，仅显示为背景染色(图2)。
[0025]3.原代裸鼠皮下瘤模型的建立
1)取处于对数生长期的PC-3M-1E8前列腺癌细胞和MKN-45胃癌细胞，用0.25%胰酶消化，800rpm离心5分钟收集细胞，无菌PBS重悬细胞，通过计数板计数后调整细胞浓度。
[0026]2)将雄性裸鼠固定后，拿棉签蘸碘伏消毒裸鼠左侧大腿根部皮肤，用Iml注射器取200 μ 1PC-3M-1E8前列腺癌细胞悬液(浓度为1.5 X 101°/!)，注射到消毒过的皮下。即每只裸鼠接种3X IO6个细胞。共注射雄性裸鼠3只。
[0027]3)将雌性裸鼠固定后，拿棉签蘸碘伏消毒裸鼠左侧大腿根部皮肤，用Iml注射器取200 μ I MKN-45胃癌细胞悬液(浓度为I X 101°/!),注射到消毒过的皮下。即每只裸鼠接种2 X 106/L个细胞。共注射雌性裸鼠3只。
[0028]4)放入SPF环境中继续饲养，每天观察注射部位的肿瘤形成情况，待10天左右皮下肿瘤已经明显形成后，隔天观察肿瘤生长情况并用游标卡尺测量肿瘤最大径及最小径的值。
[0029]4.TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽的靶向识别效应的体内研究
1)PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤荷瘤小鼠尾静脉注入FITC标记的TMTP1_GG_D (KLAKLAK)220 μ M，并于不同时段处死小鼠，左心室注射5ml PBS冲洗后，取肿瘤组织，行冰冻切片，冰无水乙醇:丙酮(I: I)固定，激光共聚焦显微镜观察拍照。
[0030]结果显示:TMTP1-GG-D(KLAKLAK)2 20 μ M在荷瘤小鼠体内循环24h后，在肿瘤部位聚集，肿瘤组织切片可见较强荧光信号，结果说明:FITC- TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2在体内亦有很好的肿瘤导向性，可靶向高转移潜能的PC-3M-1E8前列腺癌和MKN-45胃癌。(图2)。
[0031](三)TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽对多种高转移性肿瘤细胞靶向杀伤效应的体外研
究
1.MTT (噻唑蓝)实验操作步骤:
I)消化上述对数生长期细胞，细胞计数板计数细胞悬液的浓度，调整细胞浓度，接种到96孔板，8000个/孔。
[0032]2)置37°C，5%C02温箱培养培养过夜。
[0033]3)加入以下浓度的无菌多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2: 5、10、15、20 μ M，每个浓度设3个复孔，同时各设3孔未加多肽的空白对照组及调零孔(无细胞，只有等体积的培养基)。置37°C，5%C02温箱培养过夜。
[0034]4)24小时后，用加样枪小心吸弃孔内上清，加入90 μ IRPMI1640培养液，接着加入10 μ g MTT 溶液(5mg/ml)。37。。，5%C02 温箱培养 4h。
[0035]5)将96孔板置离心机内，常温800rpm离心5分钟。
[0036]6)加样枪小心吸弃孔内液体。加入150 μ I 二甲基亚飒(DMSO)，置摇床上避光轻柔摇荡巧分钟，充分溶解结晶物。
[0037]7)上酶标仪检测490nm波长处各孔的吸光值。
[0038]8)结果的处理，所有吸光值均以平均值士 SD表示。以各株细胞的空白对照孔吸光值为对照，计算不同多肽浓度作用下的平均细胞存活率(即处理组平均值:空白对照组平均值)。
[0039]实验结果显示:如图3所示，TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2抗肿瘤多肽在不同作用浓度下(5-20 μ M)，剂量依赖性的显著抑制肿瘤细胞的增殖，增加肿瘤细胞凋亡；20μΜTMTP1-GG-d(KLAKLAK)2引起95%的PE-3M-1E8细胞凋亡，几乎100%MKN_45细胞凋亡，但是正常小鼠成纤维细胞NIH 3T3没有明显凋亡(约10%凋亡)。即TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2对前列腺癌PE-3M-1E8细胞剂量依赖性地发挥了剧烈的毒性作用，对胃癌MKN-45细胞也发挥了显著的杀伤效应，而对小鼠成纤维细胞NIH 3T3没有明显的细胞毒性。
[0040]2.倒置显微镜及流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤:
1)消化处于对数生长期的细胞，接种到6孔板内，调整细胞密度，使孔板内细胞融合度约 60%。
[0041]2)置37°C，5%C02温箱培养培养过夜，使细胞贴壁。
[0042]3)加入工作浓度为 10 μ M 的 TMTPl-GG-D (KLAKLAK)2
4)为检测TMTPl小分子多肽对细胞的毒性，另外分别加入3 μ g/mlTMTPl，同样设不加处理因素的对照孔。
[0043]5)作用24小时后，在倒置显微镜下观察细胞的形态学变化。
[0044]6)用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞。
[0045]7)将消化收集的细胞37°C，800rpm离心5分钟。弃上清，用磷酸盐PBS重悬细胞调整浓度，收集I X IO5个细胞，再次800rpm离心5分钟，用PBS重复洗细胞一次。
[0046]8)吸弃PBS，加凯基凋亡试剂盒中的Binding Buffer500 μ L重悬细胞。
[0047]9)加 Annexinv-FITC 5 μ L,轻柔混匀后，加 Propidium 1dide 5μ?,混匀。
[0048]10)常温，避光反应10分钟。
[0049]11) I小时内上流式细胞仪检测。
[0050]12)调节流式细胞仪参数，将激发波长调到488nm;发射波长调到530nm。标记早期凋亡细胞的AnnexinV-FITC用FLIC通道检测，标记坏死细胞的PI用FL3通道检测。并用未加处理因素的空白对照细胞调节荧光补偿，设定十字门，去除光谱重叠。
[0051]实验结果显示:如图4所示，与未处理的对照组相比，10 μ M的TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2作用后的MKN-45与PC-3M-1E8细胞明显出现皱缩，体积变小，胞浆浑浊，染色质边缘化，细胞间隙增大，体积缩小，细胞周缘模糊，细胞折光性整体减弱，胞浆浓缩，核染色质分布不均匀，偶见凋亡小体，细胞膜皱缩破裂等凋亡变化，作为对照的NIH 3T3细胞则没有明显光镜下的变化。如图5所示，与未处理的对照组相比，ΙΟμΜ的TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2显著增加了 MKN-45与PC-3M-1E8细胞的凋亡率，并随着作用时间的延长,凋亡率逐渐增加，48h达到高峰。
[0052]3.boyden 小室
1)消化处于对数生长期的细胞，接种到6孔板内，调整细胞密度，使孔板内细胞融合度约 60%。
[0053]2)置37°C，5%C02温箱培养培养过夜，使细胞贴壁。
[0054]3)加入工作浓度为2 μ M的TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2，同样设不加处理因素的对照孔。
[0055]4)作用12小时后，在倒置显微镜下观察细胞的形态学变化；用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞。
[0056]5)按 1:5无血清DMEM稀释的基质胶Growth factor-reduced Matrigel 约 50 μ I/孔铺于8 μ m孔径的聚碳酸酯微孔滤膜上，37°C放置0.5h后转置室温下干燥过夜。
[0057]6) Boyden下室加入25 μ I的ΝΙΗ3Τ3细胞上清液，上室加入200 μ I细胞浓度为
2XlOVml的细胞悬液，每孔设3个复孔。
[0058]7)置37°C、5%C02温箱中培养8h后，擦去上室上细胞，倒置膜片(膜朝上)，甲醇固定，苏木素染色，计数侵过滤膜的细胞数。共计数中央和四周各5个视野(X200)，取平均值。
[0059]实验结果显示:如图6所示，2μΜ的TMTPI _GG_D (KLAKLAK)2作用后的MKN-45与PC-3M-1E8细胞平均穿膜细胞数明显低于对照组，提示迁移侵袭细胞数明显减少，且差异有显著性。
[0060](四)TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2肿瘤靶向治疗的体内研究
1.前列腺癌和胃癌皮下瘤模型的建立
I)原代前列腺癌/胃癌皮下瘤生长至约IcmX Icm时，取皮下瘤生长状态好的前列腺癌和胃癌裸鼠各2只，颈椎脱白术处死荷瘤裸鼠，在超净工作台内用锋利的无菌剪刀及镊子剥离瘤体，置无菌生理盐水中，去除结缔组织，用剪刀将瘤体剪成约2mm3大小的瘤块。
[0061]2)在超净工作台内抓牢固定待移植裸鼠，碘伏消毒左侧大腿根部，手术刀小心划开一长约3mm消毒过的皮肤，镊子小心钝性分离皮下组织，选一剪碎的瘤块置入其中，4.0号手术缝线缝合皮肤。前列腺癌移植20只裸鼠，胃癌移植16只裸鼠。
[0062]3)放回SFP级动物房继续饲养，每天观察移植部位的肿瘤形成情况，待7天左右皮下肿瘤已经明显形成后，隔天观察肿瘤生长`情况并用游标卡尺测量肿瘤最大径及最小径的值。
[0063]2.前列腺癌和胃癌皮下瘤裸鼠分组处理
O当前列腺癌/胃癌皮下移植瘤生长至约3mmX3mm时，将15只前列腺癌荷瘤裸鼠随机分为3组，每组5只，每组为一笼，做好标记。将12只胃癌荷瘤裸鼠随机分为3组，每组4只，每组为一笼，做好标记。
[0064]2)前列腺癌/胃癌皮下移植瘤荷瘤裸鼠分别接受以下处理(均为腹腔注射):第一组:50 μ M PBS (空白对照组)，第二组；50 μ M PBS TMTPI,第三组；50 μ MTMTP1-GG-d (KLAKLAK)2。
[0065]3.每3天按上述方式处理一次，并且每次处理前先用游标卡尺测量肿瘤最大径及最小径的值。
[0066]4.处理21天(治疗8次)后，将各组前列腺癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后，相机拍照。并按公式V = 4/X (d/2) 2X (D/2)计算每次测量的肿瘤体积，d代表肿瘤最小径的值，D代表肿瘤最大径的值，绘制肿瘤体积增长曲线。拍照后停止处理，继续饲养，每天观察，直至第一次处理后第46天，观察各组荷瘤裸鼠死亡情况，记录死亡每天观察，绘制各组裸鼠生存曲线。
[0067]5.处理21天(治疗8次)后，将各组胃癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后处死，剥离肿瘤，将各组肿瘤先用相机拍照，再用PBS洗净血迹后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液与瘤体的体积比为10:1，送武汉谷歌生物技术有限公司进行石蜡包埋，4μπι切片。并按公式V=4/31 X (d/2) 2X (D/2)计算每次测量的肿瘤体积，d代表肿瘤最小径的值，D代表肿瘤最大径的值，绘制肿瘤体积增长曲线。[0068]6.胃癌原位模型的建立
I)原代胃癌皮下瘤生长至约IcmX Icm时，取皮下瘤生长状态好的裸鼠2只，颈椎脱臼术处死荷瘤裸鼠，在超净工作台内用锋利的无菌剪刀及镊子剥离瘤体，置无菌生理盐水中，去除结缔组织，用剪刀将瘤体剪成约Imm3大小的瘤块。
[0069]2)将12只预备造模的雌性裸鼠禁食12小时后，腹腔注射速眠新麻醉，碘伏和75%酒精消毒裸鼠左侧及中部腹部皮肤，镊子夹起消毒过的皮肤，剪刀剪开腹壁，在正中旁的左侧打开腹腔，将胃用镊子小心拉出，用缝针小心反复轻刺胃大弯侧前壁的浆膜层3-5次，选取一剪碎的新鲜胃癌皮下瘤瘤块置于此处，然后用5-0可吸收缝线将瘤块缝在刺伤的胃大弯浆膜层上。按正常解剖位置将胃放回腹腔，用1-0缝线缝合腹壁及皮肤。擦净血溃，放回紫外线消毒的笼子继续在SPF级动物房饲养。
[0070]7.胃癌原位肿瘤的处理
I)胃癌原位移植瘤术后第7天，15只术后裸鼠随机分为3组，每组5只，通过剪耳朵做好标记。
[0071]2)移植瘤裸鼠分别接受以下处理(均为腹腔注射):第一组:50μΜ PBS(空白对照组)，第二组；50 μ M PBS TMTPl，第三组；50 μ M TMTPI_GG_D (KLAKLAK)2。
[0072]3 )每3天按上述方式处理一次。
[0073]4)处理10次后乙醚麻醉处理裸鼠，解剖裸鼠，取出原位瘤，肝脏，脾脏及腹壁转移瘤，照相机拍照后，取原位瘤及各组织中肉眼可见的转移瘤，PBS洗净血迹后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液与瘤体的体积比为10:1，进行石蜡包埋，4 μ m切片，石蜡切片HE染色。
[0074]5)记录各组裸鼠原位瘤及转移瘤的发生率，统计数据。
[0075] 实验结果显示:如图7所示，结果显示TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽显著抑制了 PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤及MKN-45胃癌原位移植肿瘤的生长并且显著延长了荷瘤裸鼠的生存期。TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽处理后，荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显比对照组荷瘤裸鼠的肿瘤体积小(P〈0.05)。与PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤的治疗效果相似，TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2靶向多肽显著抑制了 MKN-45胃癌原位抑制肿瘤的体积，而对照组无明显影响。
[0076]如图8所示:对照组裸鼠的胃组织可见巨大的原位肿瘤，除TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽处理组外，肝脏或脾脏上也可见明显的白色转移灶，腹壁也有较大的转移瘤。如图8所示，对照组裸鼠胃原位均100%发生肿瘤，80%发生肝转移，40%发生脾转移，60%发生腹壁转移，20%发生肾脏转移，60%发生肠系膜淋巴结转移，而TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽处理组裸鼠无肉眼可见肝脾肾转移灶、腹壁转移灶、肠系膜淋巴结转移灶。
[0077]以上数据显示，新型抗肿瘤多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2具有显著抑制肿瘤的发生发展及抑制肿瘤转移的效应，有望成为一种新型抗肿瘤药物。
[0078]一种嵌合的促进高转移潜能肿瘤细胞凋亡的靶向性多肽包括氨基酸序列如下:Gly-Cys-Gly-Asn-Val-Val-Arg-Gln-Gly-Cys—Gly-Gly-
D (Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)
【权利要求】
1.一种特异抑制肿瘤细胞转移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制备与应用，其特征是:一种嵌合的促进高转移潜能肿瘤细胞凋亡、抑制其转移的靶向性多肽，它是由一个具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTP1、两个甘氨酸GG和一个抗菌肽D(KLAKLAK)2组成。
2.根据权利要求1所描述的多肽，其特征在于所述对具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向妝为 Gly-Cys-Gly-Asn-Val-Val-Arg-Gln-Gly-Cys,抗菌妝为 D(Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)。
3.权利要求1所述的新型靶向性多肽在体外抑制肿瘤的增殖、侵袭能力及诱导肿瘤细胞凋亡中的应用。
4.权利要求1所述的新型靶向性多肽在抗肿瘤生长及抑制肿瘤转移中的用途。
【文档编号】A61K38/10GK103656666SQ201210340385
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2012年9月14日
【发明者】马丁, 王世宣, 周剑峰, 奚玲, 马湘一 申请人:深圳市奥尼克斯基因技术有限公司