EphA2靶向多肽及其应用

本发明涉及生物医学工程领域，更特别地，涉及epha2靶向多肽肿瘤靶向肽及其在肿瘤靶向筛查、诊断、治疗或预后评估试剂中的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤对人类健康造成严重威胁，是世界范围内主要致死原因之一。常规的肿瘤治疗手段包括化疗、放疗、手术切除等，但这些方法通常会对机体的正常组织带来损伤，具有很大的毒副作用，给肿瘤患者带来极大的痛苦。因此，特异性高、疗效显著的肿瘤靶向治疗。

2、肿瘤靶向疗法是指通过干扰参与肿瘤细胞发生、发展和扩散相关的特殊分子，进而抑制肿瘤进展的治疗方法。肿瘤靶向疗法区别于传统化疗，有特定的靶标分子，人们也正在努力开发各种肿瘤靶向疗法。目前认为，靶向多肽是比较理想的肿瘤靶向治疗手段，具有以下优势：1)血浆清除速度快，亲和力高，特异性强；2)良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞所摄取；3)易于化学合成，且免疫原性低，可避免单克隆抗体治疗的不足。因此，特异性靶向多肽是医学研究、临床应用和分子成像的理想且有吸引力的目标。

3、促红细胞生成素产生肝细胞受体(eph)是最重要的一类受体酪氨酸激酶(rtk)，目前， eph受体有14种，相关配体(ephrins)有8种。eph受体根据它们的序列同源性和对其同源ephrin配体的结合亲和力分为eph-a和eph-b亚家族。eph受体信号传导有助于多种生物事件，主要导致细胞间排斥或粘附。因此，eph受体和相应的配体在胚胎组织模式、神经元靶向和血管发育中具有重要作用。同时，在多种恶性肿瘤中发现高水平的eph蛋白，这种过度表达显着促进了癌变。一些eph受体，尤其是epha2，它在多种侵袭性癌症类型中广泛表达，包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和结肠癌等，而在正常组织中几乎没有表达。因此，epha2已成为恶性肿瘤靶向诊断和治疗的有力候选者。

4、目前，最常用的检测方法是免疫组织化学(ihc)，然而ihc检查存在根本的局限性：肿瘤异质性空间表达的特点导致其对标志物的检测不敏感，以及肿瘤取样不完全等因素可能导致出现假阳性结果。此外肿瘤组织活检是损伤性的，无法对肿瘤进展过程中的表达水平进行重复、动态的监测，而活检组织染色也只能代表一定小区域范围的表达状态，无法完整准确地反应整个肿瘤组织和病灶转移的情况，这可能造成假阴性的检测结果。相较而言，分子影像(molecular imaging)在肿瘤个性化医学中发挥越来越重要的作用。其中分子探针的制备是分子影像的关键，高灵敏度和特异性的分子探针进入体内后可与细胞内特定的靶点结合，体外通过特点的影像设备进行信号捕捉，例如通过正电子发射计算机断层扫描(pet-ct)、单光子发射计算机断层成像技术(spect)、磁共振成像(mri)以及荧光成像(fl)等进行采集成像，从而达到特异性诊断，实现高度特异性的诊断。

5、基于以上考虑，申请人设计出了一类新型的epha2靶向多肽，这类多肽能特异性的靶向epha2，偶联荧光染料可进行光学成像来协助医生在利用分子影像手术导航设备时可以在术中精确定位肿瘤边界，来达到对肿瘤精准切除的目的，从而减少对病人创伤，降低术后复发的风险。epha2靶向多肽还可偶联放射性核素进行核素成像，来达到肿瘤早期诊断和治疗的目的。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种epha2靶向多肽。

2、本发明的另一目的是提供一种修饰的多肽。

3、本发明的又一目的是提供epha2靶向多肽、修饰的多肽的应用。

4、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

5、一种epha2靶向多肽，所述epha2靶向多肽序列包括如下氨基酸序列：

6、yq-ep-1:pro-glu-ser-thr-pro-tyr(seq id no.1)

7、yq-ep-2:pro-asp-ser-thr-pro-tyr(seq id no.2)

8、yq-ep-3:pro-glu-ser-val-pro-tyr(seq id no.3)

9、yq-ep-4:pro-asp-ser-val-pro-tyr(seq id no.4)

10、yq-ep-5:tyr-pro-thr-ser-glu-pro(seq id no.5)

11、yq-ep-6:tyr-pro-thr-ser-asp-pro(seq id no.6)

12、yq-ep-7:tyr-pro-val-ser-glu-pro(seq id no.7)

13、yq-ep-8:tyr-pro-val-ser-asp-pro(seq id no.8)

14、yq-ep-9:arg-ala-trp-leu-tyr-ala-pro-glu-ser-thr-pro-tyr(seq id no.9)

15、yq-ep-10:asn-arg-ala-trp-leu-tyr-ala-pro-glu-ser-thr-pro-tyr(seq idno.10)

16、yq-ep-11:cycle(lys-val-met-glu)-glu-ser-thr-pro-tyr

17、yq-ep-12:cycle(lys-val-met-pro-glu)-ser-thr-pro-tyr

18、yq-ep-13:cycle(lys-val-met-pro-glu-glu)-thr-pro-tyr。

19、本发明进一步提供所述epha2靶向多肽的制备方法，包括：通过fmoc固相多肽合成方法合成所述epha2靶向多肽。

20、作为一种优选地具体实施方式，所述制备方法包括：

21、依照预设的氨基酸序列依次将氨基酸逐个偶联至rink amide mbha树脂，在偶联过程中hctu和fmoc保护的氨基酸被溶解在含有0.4mol/l的dipea的dmf中，每次偶联时间>1h；

22、后进行脱保护流程：使用含20％哌啶的dmf溶液脱去fmoc基团，每次脱保护时间为5min，重复两次。

23、后在强酸的作用下反应2-3h脱去侧链保护基团，以质量份计，所述强酸包括tfa90-95％、h2o 2-5％、tis 2-5％、edt 2％-5％。

24、本发明进一步提供一种多聚体，所述多聚体包括至少2条多肽；所述多肽任选自所述 epha2靶向多肽。

25、进一步地，所述多聚体通过至少两条所述epha2靶向多肽以线性或d-型或环化后形成。

26、进一步地，不同多肽间通过共价连接、非共价连接或多聚体混合的形式连接；

27、优选地，所述共价连接为通过连接分子进行连接，所述连接分子包括6-叔丁氧羰肼基烟酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或n-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种；

28、所述多聚体为聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚乳酸或聚乳酸-乙醇胺中的任一种或至少两种的组合。

29、一种修饰的多肽，其特征在于具备以下通式：

30、m-l-yq-ep-x，或m-yq-ep-x，

31、其中，m表示荧光标记或放射性核素标记；

32、l为连接基团；

33、yq-ep-x为所述的epha2特异性靶向多肽。

34、进一步地，所述荧光标记为ir dye800、cy7、cy5、罗丹明、icg等荧光染料中的一种或多种，所述放射性同位素为18f，68ga，64cu，99mtc，90y，111in，125i,131i或177lu；

35、进一步地，所述荧光标记和所述放射性同位素通过螯合剂为hynic、dota，nota或dtpa进行标记，也可通过nhs、edc、mal等点击化学方式进行标记。

36、本发明所述的epha2特异性靶向多肽、所述的多聚体、所述的修饰的多肽在制备肿瘤靶向筛查、诊断、示踪、预后评估试剂或治疗药物中的应用；优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；进一步优选在制备肿瘤边界的精准定位和手术导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。

37、所述的肿瘤为epha2阳性肿瘤，即为epha2过表达的所有肿瘤，例如肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌中的一种或多种。

38、本发明具备如下有益效果：

39、(1)本发明提供了一种具有靶向epha2阳性肿瘤细胞的多肽，该多肽可以特异性地结合 epha2受体，其可以作为靶向多肽与荧光染料偶联用于荧光成像进行手术导航。此外，该多肽也可以与放射性核素或能杀伤癌细胞的制剂连接，用于epha2过表达肿瘤的早期诊断和治疗。

40、(2)本发明进一步基于发现的epha2靶向多肽提供了一种修饰的多肽，可作为分子探针，其具有良好的靶向性、分子量小、代谢速率快、无免疫原性、渗透性好等优点。本发明提供的修饰的多肽可以用于临床的spect/pet检测，有利于后期临床转化，可以动态、无创地监测epha2的表达水平，具有良好的应用前景和临床指导意义。

41、(3)本发明提供的修饰的多肽的制备方法简单易行、成本低廉、实用性强、且具有良好的生物安全性和较高的应用价值。