来源于家蚕微孢子虫的功能基因和应用的制作方法

本发明属于生物，涉及微孢子虫在宿主体内维持细胞活动的调控基因，具体为来源于家蚕微孢子虫的功能基因和应用。

背景技术：

1、蛋白质翻译后修饰是蛋白质功能调节的一种重要方式,对蛋白质的结构和功能至关重要，也是蛋白质组复杂性的主要原因之一。泛素化，一种较为常见的蛋白质翻译后修饰，指泛素蛋白c末端的甘氨酸经由异肽键与底物蛋白的氨基连接在一起,最常见的连接是与底物蛋白赖氨酸的ε氨基相连以及与底物蛋白的n末端相连。最近还发现,可以与cys、ser和thr相连。sumo化与泛素化修饰过程相似，也是一个多酶参与的酶联反应，但两个途径所参与的酶完全不同。首先，sumo化修饰比泛素化修饰多一步成熟化的过程，即sumo前体在sumo蛋白酶的作用下，c端的4个(或多个)氨基酸残基被切除，生成成熟的sumo并露出c-端2个gly残基。接着,在sumo化活化酶e1、结合酶e2(ubc9)和连接酶e3的作用下完成sumo化修饰过程，且这个过程是可逆的，称为去sumo化。在低等真核生物中，例如酵母，昆虫和线虫，仅表达一个sumo基因，在人体内发现有4个sumo蛋白的基因，而在植物中则表达多达8个sumo基因。有多数研究发现，sumo家族的蛋白通过与蛋白质结合，来调节细胞核转运、转录、染色体分离和dna修复等细胞过程。

2、微孢子虫(microsporidia)是一类能形成孢子的专营细胞寄生生物，其宿主仅限于动物，大多数感染昆虫，但它们也是甲壳类动物和鱼类常见疾病的病原，除了给养蚕业带来毁灭性打击外，也会造成养蜂业和水产业(鱼、虾等)的重大经济损失。同时有10％的微孢子虫可以感染包括人类在内的脊椎动物和无脊椎动物，危害巨大。家蚕微孢子虫(nosemabombycis,nb)是第一个被鉴定的微孢子虫，是引起家蚕微粒子病的病原。家蚕微孢子虫对家蚕的侵染潜伏期长，传播范围广，不仅能通过食下传染，而且能寄生于蚕幼虫、蛹和蛾，并通过蚕卵传染至下一代。因其巨大的危害性，家蚕微孢子虫被列为蚕业生产上唯一的法定检疫对象。

3、有研究表明微孢子虫对宿主的感染会诱导宿主产生各种各样的反应，如泛素介导的抗性，活性氧的产生，黑化反应和先天免疫途径激活，以及基本代谢的增加和保幼激素的积累等。虽然有组学数据显示与sumo化修饰有关的泛素化途径可能参与了宿主对微孢子虫的应激反应，但是有关sumo化修饰与nb复制的结果尚未见报道。

4、微孢子虫作为原虫和真菌之间的过渡物种，其基因组在进化过程中丢失了很多的功能模块，比如很多微孢子虫没有线粒体，或者只有功能不完整的线粒体，dipika gupta等用13个酵母来源的sumo系统蛋白序列交叉比对了5个主要的真菌门类基因组数据，发现在微孢子中都含有sumo系统需要的各个蛋白，表明sumo系统在微孢子虫复制过程中有重要的作用。然而关于微孢子虫sumo基因的功能及其修饰的底物蛋白等仍然未知。

5、sumo修饰在许多生物学过程中都发挥着重要的作用，近年来的研究显示病毒、细菌、真菌等病原可以与宿主的sumo化系统的各个部分发生相互作用，调节宿主的免疫反应，或利用宿主的sumo修饰系统对病毒蛋白进行功能性修饰，创造有利于病原复制的环境，如乳头瘤病毒，腺病毒，疱疹病毒，正粘病毒，丝状病毒和小核糖核酸病毒等dna和rna病毒。细菌性病原虽然不含有sumo，但同样会与宿主的sumo修饰系统各个组分发生相互作用，调控宿主的免疫反应等。在真菌性病原中，大量研究发现sumo修饰控制着致病真菌中大量蛋白质的功能特性，在这些真菌的生理学和病理学中起着重要作用。如在酵母中，人们发现sumo系统相关的基因smt3,ulp1,aos1,uba2,ubc9和mms21虽然不是酵母生长必须的基因，但调节了酵母染色体分离、dna复制、细胞周期进展、端粒位置效应和核孔动力学等细胞内过程。在念珠菌(candida albicans和candida glabrata)中，人们发现sumo对c.glabrata的生长、应激反应和dna损伤修复能力至关重要；c.albicans sumo基因的敲除会增强其对各种刺激如温度、活性氧、未折叠蛋白、抗真菌药物等的敏感性。在曲霉菌中，虽然构巢曲霉(aspergillus nidulans)sumo的缺失不影响其细胞活力，但会导致生长减慢、菌落边缘参差不齐、对dna损伤刺激敏感、分生孢子减少、次级代谢产物产生显著改变和自身不育。黄曲霉(a.flavus)sumo与其毒性有关，sumo基因的缺失会导致霉菌生长缓慢及二级代谢产物的改变。

技术实现思路

1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明克隆了家蚕微孢子编码的sumo基因，研究其功能，并探讨其对于nb在宿主家蚕体内复制的影响；鉴于此，本发明提供了来源于家蚕微孢子虫的功能基因和应用。

2、技术方案：来源于家蚕微孢子虫的功能基因，所述基因编码的氨基酸序列为seqid no.19。序列为：

3、mseerensdvqnnkiklkiidqdgailefkvkkgitfrkilktfadqvnkdpselrlvfngkvldlestpdfynmedndevevvasqvggcn。

4、优选的，所述基因的核苷酸序列为seq id no.20。序列为：

5、atgtcagaagaaagagaaaattcggatgtgcaaaacaataagattaaacttaagataattgaccaagacggagctatactagaatttaaagttaagaaagggattacatttaggaagatacttaagacatttgcagatcaagtaaataaagaccccagtgagcttagacttgtttttaatggtaaagtactagacttagagtccacacctgatttttataacatggaagacaatgacgaagttgaagtagtcgcctcacaagtaggaggatgcaattaa。

6、优选的，所述基因全长cdna序列克隆的特异性引物为：nbsumo-f、seq id no.1和nbsumo-r、seq id no.2。

7、优选的，所述基因荧光定量pcr引物为：qrt-bmsumo-f、seq id no.3，qrt-bmsumo-r、seq id no.4，qrt-nbsumo-f、seq id no.5，qrt-nbsumo-r、seq id no.6。

8、优选的，所述基因在rna干扰试验中，采用的sirna序列为：nbsumo-sirna1 sense、seq id no.13，nbsumo-sirna1 antisense、seq id no.14，nbsumo-sirna2 sense、seq idno.15，nbsumo-sirna2 antisense、seq id no.16，nbsumo-sirna3 sense、seq id no.17，nbsumo-sirna3 antisense，seq id no.18。

9、以上所述的来源于家蚕微孢子虫的功能基因在调控微孢子虫基因组在宿主家蚕体内复制中的应用。

10、优选的，所述调控通过功能基因编码的蛋白对宿主家蚕内与nbsumo结合的家蚕蛋白或微孢子虫蛋白进行修饰实现。

11、优选的，所述功能基因编码的蛋白分布于宿主家蚕细胞的细胞质内，并呈点状分布。

12、以上所述的来源于家蚕微孢子虫的功能基因在维持微孢子虫在宿主家蚕体内自身细胞活力中的应用。

13、本发明的设计思路在于：根据microsporidiadb数据库中已测序的微孢子虫基因组信息，发明人发现家蚕微孢子虫nb基因组中含有sumo，sae1/sae2，ubc9和pias等编码完全sumo途径蛋白的基因。通过基因克隆和测序确定nbo34g0004编码nbsumo基因。在nb感染的家蚕bmn细胞中，家蚕内源性sumo的表达量在nb感染无显著差异，但nb自身表达大量的sumo，因此发明人提出猜想，nb不依赖宿主sumo化系统，在sumo系统上实现了自我供给，并且有可能通过自身sumo系统调节宿主体内蛋白质的功能，有利于完成自己的繁殖过程。

14、现有技术中缺少微孢子虫系统的基因编辑技术，本领域技术人员无法获得sumo基因的突变体，为了初步探索sumo是否与nb复制有关，发明人根据nbsumo序列合成了sirna来降低nb复制过程中表达的nbsumo基因，通过检测nb基因组拷贝数的相对量，发现nbsumo降低后nb基因组拷贝数显著下降，表示sumo系统参与微孢子虫基因组的复制。

15、为了更好地理解nbsumo的功能，本发明利用pull-down联合质谱技术分析了与nbsumo结合的家蚕蛋白和nb蛋白，发现有多种蛋白可能被nbsumo修饰。其中一些在其他研究中已经发现能被sumo或者泛素修饰的蛋白，如micos complex subunit mic60，e3ubiquitin-protein ligase hrd1，general vesicular transport factor p115，dnareplication licensing factor，但是还有很多蛋白在其他物种中未发现相关研究，后续有必要通过体内或者体外系统确认这些蛋白是否被sumo修饰。本发明用go分析了当前获得这些蛋白在biological process条目中的分布，发现这些蛋白质参与了泛素化修饰、转录调控、dna复制等过程，表示nbsumo调控了宿主家蚕的多种生物学过程。

16、有益效果：(1)本发明所述nbsumo基因在调控微孢子虫的基因组复制过程中具有重要作用，为研究微孢子虫在宿主家蚕体内的存活机制提供重要理论指导；(2)本发明为养蚕业中家蚕微孢子虫病害的治理和防控提供理论基础。