IPS来源的CAR-NK细胞及其治疗癌症的用途的制作方法

：本发明属于抗肿瘤药物研究领域，具体提供了一种ips来源的car-nk细胞及其治疗癌症的用途。

背景技术

0、
背景技术：

1、肝癌是一种起源于肝脏的侵袭性肿瘤，经常发生在慢性肝病和肝硬化的环境中，肝癌是男性第五大常见癌症和女性第七大常见癌症，并且是全球癌症相关死亡的第三大原因。尽管在治疗方面取得了很多进展，但肝癌仍然是最难治疗的癌症之一，肝癌复发仍然是治愈性治疗后的主要问题，其年生存率难以令人满意，仅为40％-53％。

2、在肝癌治疗方面，对于早期肝癌患者，手术、局部破坏性治疗和肝移植是最为有效的治疗方案，且随着手术和术后恢复技术的进步，使得手术失血量、手术时间和住院时间不断减少，为早期肝癌患者提供了良好的治疗前景，但手术治疗往往需要满足严格的条件，候选患者必须具有手术可行的肿瘤位置、足够的肝脏储备以及合格的临床和生化指标，这在一定程度上限制了手术治疗的临床应用。对于中晚期患者，或难以进行手术治疗的患者，则多采用药物治疗。索拉非尼被作为肝癌的一线治疗药物，它是一种多激酶抑制剂，也是第一个获批用于治疗肝功能相对保留的晚期肝癌患者的靶向治疗药物，可抑制raf-1和其他酪氨酸激酶的活性，例如血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)、vegfr-3、fms样酪氨酸激酶3(flt3)、血小板衍生的生长因子受体(pdgfr)和成纤维细胞生长因子受体1(fgfr-1)，研究表明索拉非尼可显著抑制肝癌细胞生长，并且保留一定的肝脏功能，延长患者生存期，改善生活质量。对于索拉非尼治疗失败的患者，可尝试多柔比星、紫杉醇等其他化学治疗药物，也有研究人员推荐联合使用靶向治疗药物，如细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)抗体、程序性死亡1(pd-1)抗体均在肝癌治疗中展现出了积极的治疗效果。此外，还有研究人员尝试使用腺病毒、细小病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒等溶瘤病毒治疗肝癌，这种治疗方法比较灵活，既可以通过基因工程方式对溶瘤病毒进行多方面改造和修饰，又可以联合其他已知的治疗药物，但是该方法由于潜在的致病风险以及较低的治疗有效性，而多处于实验研究阶段。

3、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是一种人工构建的生物分子，通常包括抗原结合域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，经过基因工程和细胞工程手段，将其表达于免疫效应细胞表面，可发挥肿瘤靶向治疗作用，将效应细胞重新导向肿瘤靶标，这种靶向性免疫细胞治疗技术彻底改变了过继细胞转移治疗领域的技术研发思路，使得免疫细胞治疗不再被低效率和盲目性所困扰。自体cd19 car-t细胞治疗慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)和非霍奇金淋巴瘤(nhl)等血液系统恶性肿瘤取得了巨大成功，美国食品药品监督管理局批准了多款car-t细胞疗法，包括吉利德的yescarta、诺华的kymriah、传奇生物的ciltacabtagene autoleucel等等。

4、然而，令人担忧的是car-t疗法也并非没有缺点，主要包括：(1)免疫因子风暴，以cd19 car-t细胞为例，在肿瘤治疗过程中会导致il-6、tnf-α等多种炎性细胞因子的大量释放，致使患者出现发热、呼吸困难等症状，严重时可危及生命；(2)特异性有待提高，尽管研究人员在抗肿瘤靶点的选择上非常慎重，但是大多数car靶点也在正常组织中表达，从而导致car-t对正常组织的攻击；(3)免疫逃逸现象，肿瘤相关性抗原并非肿瘤胞存活必不可少的，因此肿瘤细胞会通过表达缺失某些肿瘤相关性抗原而逃避car-t的攻击，造成免疫逃逸现象的出现；(4)治疗实体肿瘤效果不佳，虽然靶向cd19的car-t治疗b细胞淋巴瘤和靶向bcma car-t治疗骨髓瘤取得了较好的疗效，但是car-t在治疗实体肿瘤方面却乏善可陈，其中原因相当复杂，如实体肿瘤细胞浸润困难、实体肿瘤微环境复杂、t细胞功能障碍和衰竭等等；(5)制备困难，目前批准上市的car-t细胞均为自体t细胞修饰而得，需要从患者自身提取外周血单核细胞(pbmc)，这要求为每位患者在白细胞分离后定制car-t细胞，不仅过程繁琐，经济负担大，而且受到患者自身状况的影响可能导致治疗失败风险，为此有研究者试图开发通用型car-t，但是受到抑制抗宿主反应的困扰而未获得成功，如cellectis公司开发的ucartcs1a(nct04142619)因一名参加临床试验的患者心脏骤停死亡而被迫终止。

5、为克服以t细胞为基础的嵌合抗原受体疗法的困难，研究人员开始寻找其他类型的免疫细胞，nk细胞是先天免疫系统的一种细胞毒性淋巴细胞，能够在没有人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)限制或事先致敏的情况下识别和杀死目标细胞，从而实现更快的免疫反应。与t细胞不同，nk细胞能够杀死缺少mhc i抗原标记的细胞，而缺少mhc i标记的有害细胞(如肿瘤细胞)无法被t细胞识别和破坏；更重要的是，过继性nk细胞转移不需要严格的hla匹配，引发的抑制抗宿主风险较低，上述原因使得nk细胞成为理想的car基础细胞。目前已有多种car-nk细胞被报道，如靶向cd19、bcma、her2的car-nk细胞。在研究过程中发现car-nk细胞具有以下优势：car-nk细胞保留了通过其天然受体识别和靶向异常细胞的内在能力，从而降低了通过car靶向抗原下调异常细胞逃逸的可能性；car-nk细胞不需要与患者匹配，因此来自健康供体pbmc或ucb的细胞可用于制造同种异体car-nk细胞，增强了治疗的便利性；nk细胞优先靶向和杀死癌症干细胞，防止肿瘤转移和复发。然而使用nk细胞最大的问题是细胞来源稀少，据研究供体nk细胞的主要来源是外周血，nk细胞在外周血细胞中所占比例在2％以下，使得难以获得足够数量的nk细胞用于肿瘤患者治疗。尽管存在诸如nk-92等成熟的nk细胞系，但是上述细胞系本身具有无限增殖能力，即具有一定的致癌性，增加了使用者的担忧。

6、为解决nk细胞的来源问题，人们想到了诱导型多能干细胞(induced pluripotentstem cells，ipsc)，这种细胞最早有日本科学家山中伸弥等提出，他们将oct3/4、sox2、c-myc、klf4等四种基因导入动物体细胞后获得了具有多向分化能力的干细胞，这种细胞来源广泛且具有多向分化能力，可诱导分化为多种类型的体细胞，已有研究者成功将ipsc细胞诱导分化为nk细胞。以ipsc细胞诱导分化的nk细胞为基础构建的ipsc-car-nk已经被报道，如li等人(human ipsc-derived natural killer cells engineered with chimericantigen receptors enhance anti-tumor activity.li y,hermanson dl,moriarity bs,kaufman ds.cell stem cell.2018；23:181-192)报道了ipsc-car-nk细胞在体外和体内对卵巢癌细胞的杀伤能力有所提高。

7、有鉴于临床实践中对于肝癌免疫疗法的需求，本发明提供了一种通用型car-nk细胞，所述nk细胞为ipsc细胞诱导而得的ipsc-nk细胞，细胞来源充足方便易得；所述car结构包括依次连接的信号肽、靶向c-met抗原结合域、靶向pd-l1抗原结合域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，能够有效识别肿瘤细胞，发挥持续、高效的肿瘤杀伤作用，调节免疫因子释放，发挥协同抗肿瘤作用。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明中提供了一种通用型car-nk细胞，其特征在于，所述car结构包括依次连接的信号肽、靶向c-met抗原结合域、靶向pd-l1抗原结合域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域；所述抗原结合域包括如seq id no:1-3所示重链cdr区和seq id no:4-6所示轻链cdr区；所述靶向pd-l1抗原结合域包括如seq id no:7-9所示重链cdr区和seq id no:10-12所示轻链cdr区；所述nk细胞为ipsc细胞诱导而得的ipsc-nk细胞。

2、本发明中选用ipsc-nk细胞制备car-nk细胞，不仅解决了天然nk来源稀少问题，还能够利用ipsc的免疫调节能力，改善抗肿瘤效果，此外ipsc-nk允许进行精确的基因工程改造和编辑，为car-nk细胞再修饰提供了可行性，有望进一步改善疗效并降低毒副作用。

3、c-met是原癌基因met的产物，由上皮细胞、内皮细胞、神经元、肝细胞和造血细胞表达，c-met在癌症的发生发展中发挥着关键作用，与肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭和转移有关，目前已在多种实体恶性肿瘤中观察到c-met的过表达，例如肝癌、乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌等等。值得注意的是，约50％的肝癌患者出现c-met表达异常，因此c-met被认为是肝癌免疫治疗的重要靶点，国内外研究者已提出了以靶向c-met的嵌合抗原受体治疗肝癌，如cn111704674a、cn106755107a、cn106008721a等等。本发明中以c-met为靶点，开发出相应的car-nk细胞，用以治疗包括肝癌在内的实体肿瘤。

4、pd-l1(也称为b7-h1或cd274)是程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的同源配体，pd-1在多种肿瘤中过度表达，pd-1和pd-l1的结合可以抑制t细胞的活化、增殖和存活，肿瘤细胞通过pd-1/pd-l1信号通路可抑制t细胞等免疫细胞对自身的攻击，而成为最为重要的肿瘤免疫逃逸途径之一。正因如此，pd-l1单克隆抗体已被批准用于治疗黑色素瘤、膀胱癌和淋巴瘤等多种类型的肿瘤。本发明中选用c-met和pd-l1作为双特异性靶点，构建嵌合抗原受体，可有效提高对肿瘤细胞的特异性识别能力，改善抗肿瘤治疗的靶向性和有效性。

5、进一步的，所述靶向c-met抗原结合域包括如seq id no:13所示重链可变区和如seq id no:14所示轻链可变区。

6、进一步的，所述靶向pd-l1抗原结合域包括如seq id no:15所示重链可变区和如seq id no:16所示轻链可变区。

7、进一步的，所述共刺激因子选自选自4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、tnfrsf13b、tnfrsf18、cd134中的一种或多种。

8、进一步的，所述共刺激因子选自选4-1bb，其氨基酸序列如seq id no:17所示。

9、现有技术中已经报道了多种共刺激因子可用于car结构中，并且有人提出共刺激因子的选择对于car疗法的成败起到关键性作用，如juno公司针对cd19的car-t细胞由于使用活性强烈的cd28共刺激因子而导致患者死亡的事件，因此本发明中选用激活程度相对温和且应用成熟的4-1bb作为共刺激因子，以便提高治疗的安全性。

10、进一步的，car结构中的各个元件使用柔性连接子进行连接，更有利于生物活性的保持和发挥，所述car氨基酸序列如seq id no:18所示。

11、进一步的，ipsc-nk细胞的制备方法包括：培养ipsc细胞；ipsc细胞造血分化，将ipsc细胞置于造血分化诱导培养基中进行孵育，所述造血分化诱导培养基包括50ng/ml成纤维细胞生长因子、50ng/ml骨形态发生蛋白4、50ng/ml干细胞因子和20ng/ml血管内皮生长因子；ipsc细胞nk分化，将造血分化的ipsc细胞置于含有饲养层细胞和nk分化诱导培养基中，所述nk分化诱导培养基包括20％fbs、10ng/ml白介素-15、10ng/ml白介素-7、20ng/ml干细胞因子和10ng/ml fms-样酪氨酸激酶-3配体，每3-4天更换新鲜培养基，每7天更换新鲜饲养层细胞中，培养14-21天后收集得到所述ipsc-nk细胞。

12、提供了一种所述的car-nk细胞在制备肿瘤药物中的应用。

13、进一步的，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、直肠癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、食道癌、皮肤癌中的一种或几种。

14、进一步的，所述肿瘤为肝癌。

15、据报道，c-met抗原在多种肿瘤细胞表面过表达，包括但不限于肝癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、直肠癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、食道癌、皮肤癌等等，因此本发明所提供的car-nk细胞可用于多种实体肿瘤的治疗。

16、有益效果

17、本技术提供了一种ipsc来源的通用型car-nk细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用，具有以下优势：

18、(1)选用ipsc-nk细胞制备car-nk细胞，不仅解决了天然nk来源稀少问题，还能够利用ipsc的免疫调节能力，改善抗肿瘤效果。

19、(2)选用肝癌表面抗原c-met和pd-l1为双目标靶点，能够有效识别肝癌细胞，防止免疫逃逸发生；

20、(3)所述靶向c-met和pd-l1抗原结合域与目标抗原具有中等结合活性，既能够有效识别目标细胞，又可防止对低水平表达c-met的正常组织细胞的多度攻击，降低毒副作用；

21、(4)所述car-nk细胞为通用型免疫细胞疗法，制备成本低，使用方便，可用于大规模生产和制备，降低患者经济负担。