一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽tmvp1的获得及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽序列，以及该导向性多肽在肿瘤淋巴转移早期诊断和靶向治疗中的具体用途，属于肿瘤的生物治疗领域。利用细菌鞭毛随机肽库技术筛选、裸鼠乳腺原位抑制肿瘤体内验证等技术，获得可特异性靶向肿瘤淋巴管的导向性多肽：LARGR，命名为“TMVP1”。该导向性多肽具有以下突出的技术特征：对于乳腺癌原位移植模型内的肿瘤淋巴管有很好的靶向识别效应；可作为药物载体携带药物进行抗肿瘤治疗，有效抑制淋巴管生成的密度与肿瘤的转移。该导向性多肽在肿瘤淋巴转移的早期诊断中具有独特的实用价值，同时也为靶向阻遏肿瘤淋巴管的生成与转移提供了一种全新的诊断和治疗应用途径。
【专利说明】—种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽TMVP1的获得及应用
一、【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽TMVPl的获得及应用，其技术特征在于:利用细菌鞭毛随机肽库技术体外对重组活性蛋白VEGFR-3的胞外区进行筛选，通过化学合成多肽进行体内外功能验证，获得了一段特异性靶向肿瘤淋巴管的五肽“TMVPI”。
【发明内容】
属于肿瘤的生物治疗领域。二、背景资料:
[0002]肿瘤淋巴管生成介导的淋巴道转移是大多数实体瘤播散的早期事件，是其难以根治和高病死率的重要原因。长期以来由于缺乏淋巴内皮特异性标记物和淋巴管生成模型使得对肿瘤淋巴管生成的研究相对滞后于肿瘤血管生成。随着淋巴管生成分子机制及更多相关因子研究的不断深入，抗淋巴管生成途径有望成为继肿瘤手术、放化疗之后，一种用于肿瘤转移预防和治疗的新途径。明确恶性肿瘤组织中淋巴管内皮细胞的特异性标记物，进而针对淋巴管内皮细胞探索早期靶向阻断肿瘤淋巴转移新方法，达到阻断恶性肿瘤淋巴道转移的目的，具有重要的理论和现实意义。
[0003]长期以来，大多数关于肿瘤转移的研究都集中于肿瘤的血道转移，事实上绝大多数恶性肿瘤，尤其是实体瘤转移的早期主要是通过淋巴道进行，相关前哨淋巴结的转移情况决定了肿瘤患者的临床分期、治疗方案的制订和预后的评估。因而，针对肿瘤淋巴道转移的诊断和治疗在肿瘤转移的诊断和治疗中占有绝对重要的地位。明确肿瘤淋巴管内皮细胞(LECs)的分子标志及生物学行为的变化是研究癌症淋巴道转移机制及开展分子靶向治疗的前提。既往因为缺乏淋巴管的特异性标记物，在鉴定组织中的淋巴管、分离纯化淋巴管内皮细胞上存在技术上的困难，鉴别淋巴管的方法只局限于形态学和繁琐的差别染色法，因此淋巴系统在分子生物学方面的研究始终没有长足的进步，近年来仅发现了数种相对特异表达于淋巴管内皮的特异性标志物LYVE-1、podoplanin、prox-l、VEGFR_3,但尚未发现绝对特异的淋巴管标志物。多项研究报告证明VEGF-C / VEGFR-3信号通道可介导实体瘤内及肿瘤周边新生淋巴管生成，促进肿瘤细胞易于移动、浸润并促使肿瘤细胞易于转移，VEGF-C /VEGFR-3信号通道是肿瘤淋巴管生成的中心性环节，对该信号途径的阻滞研究有望成为抗肿瘤淋巴转移治疗新的有效手段。同时，针对肿瘤新生淋巴管生成机制而研制出的特异性拮抗剂亦有望成为肿瘤靶向治疗的一种新方法，而这正是目前该领域面临的主要难题。
[0004]肿瘤分子靶向治疗是利用具有一定特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法，又称为“导弹治疗”。靶向性多肽是目前认为比较理想的一种肿瘤靶向性治疗的载体，它们具有:①血浆清除速度快、高亲和力、高特异性良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；③易于化学合成并且低免疫原性的特点，可减少、避免上述单克隆抗体的不足。因而近年来，许多学者将目光转向应用肽库技术寻找能与肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞特异性结合的短肽，以达到靶向肿瘤的目的。肽库技术是将基因型、表型及分子结合活性与噬菌体/细菌的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选技术。目前已成功的应用于抗原表位分析、单抗筛选、蛋白质功能拮抗多肽或模拟多肽的确定等方面。Arap W等对乳腺癌荷瘤小鼠进行肽库筛选后获得一系列与肿瘤血管特异性结合的短肽，其中的RGD序列被证实可与α V整合素结合。将RGD序列与阿霉素交联后应用于荷瘤小鼠，发现药物的抗肿瘤疗效显著增加而毒性作用明显减少。Laakkonen P等利用噬菌体肽库筛选获得靶向乳腺癌肿瘤及其淋巴结转移灶的导向性多肽LyP-Ι，为早期诊断肿瘤及其转移灶靶向性治疗奠定了基础。
[0005]淋巴管生成是一个复杂的生物学过程，在众多肿瘤转移过程中淋巴管转移也是的重要扩散途径。肿瘤细胞播散到区域淋巴结是大多实体肿瘤进展的早期，也是肿瘤分期和预后的重要的决定因素。淋巴管生成被认为是肿瘤细胞转移到区域淋巴结过程中发挥了举足轻重的作用。因此，通过开发抗淋巴管生成的药物来靶向肿瘤的淋巴管，以阻止某些肿瘤淋巴管的生成并靶向抑制肿瘤细胞经淋巴管转移可能构成一种新的肿瘤分子靶向治疗模式。临床应用中可以将效应片段如免疫毒素、病毒载体与多价的靶向分子联用，以克服效应片段的低肿瘤渗透性，非特异性毒性和免疫原性等问题。研制开发出的靶向性抗肿瘤淋巴管生成与转移的新型生物制剂，可有效抑制恶性肿瘤新生淋巴管的生成及转移；同时减轻对正常组织的毒副作用，从根本上改善基因治疗的安全性问题，对高效、安全的靶向性治疗药物的研发具有指导意义，可望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。
三、
【发明内容】
:
[0006]基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽TMVPl的筛选方法和序列。通过该方案获得的靶向性多肽TMVPl具有体外对淋巴管内皮细胞靶向识别效应、体内靶向识别恶性肿瘤淋巴管、携带效应片段后可特异性抑制肿瘤淋巴管生成与转移等明显优势，而对正常的细胞或组织没有明显的毒副作用，可以弥补目前肿瘤转移诊断和治疗领域的不足之处，为将来肿瘤转移的生物靶向治疗提供新的选择。
[0007]本发明的理论基础基于肿瘤淋巴管、细胞表面存在特殊分子标记。这些分子标记可能是我们已知的肿瘤转移相关抗原，也可能是一些未知抗原。若能找到与之特异性结合的配体，即可以此进行肿瘤及其转移的早期诊断和靶向阻遏。而导向性多肽是目前认为比较理想的一种肿瘤诊断和靶向性治疗的载体。尽管已经有许多导向肽的研究结果，其中部分已经进入临床试验，取得较好疗效，但是针对肿瘤淋巴管的导向性多肽筛选却鲜有报道。
[0008]利用细菌鞭毛随机肽库技术筛选肿瘤导向性多肽有以下几个优点:①库容量大，可达到108~109，属于高通量筛选；②可事先不必知道筛选物质的结构等信息操作简单，可重复性强，不似噬菌体肽库易发生污染。因此，在本发明中采用了细菌鞭毛随机肽库技术，体外对重组活性蛋白VEGFR-3的胞外区进行四轮正负筛选，通过化学合成多肽进行体外和体内验证，获得了一段特异性靶向肿瘤淋巴管的五肽序列:LARGR，命名为“TMVP1”。
[0009]与现有的导向性多肽相比，本发明达到了以下效果:
[0010]ITMVPl能在体外对表达VEGFR-3的淋巴管内皮细胞LEC具有良好的靶向识别效应，有望成为靶向阻遏肿瘤淋巴管的生成与转移的一种全新的诊断和治疗工具；
[0011]2对于乳腺癌原位移植模型、角膜微袋肿瘤生长模型及模式生物-斑马鱼体内的肿瘤淋巴管也有很好的靶向识别效应，有望成为定向阻遏肿瘤淋巴管的生成的有效治疗工
亘.N 9
[0012]3TMVP1可直接穿透细胞膜，进入胞浆和胞核，有利于其作为药物载体携带药物进行抗肿瘤治疗；
[0013]4TMVP1本身没有毒性作用，但连接效应片段后有明显的抑制肿瘤淋巴管生成与转移效应，可有效抑制淋巴管生成的密度与肿瘤的转移。其作为一种有效的抗肿瘤药物和基因治疗载体，可发挥抗肿瘤的协同作用。
四、【专利附图】
【附图说明】:
[0014]图1、激光共聚焦显微镜观察多肽与表达VEGFR-3的HLECs特异性结合；
[0015]图2、多肽在乳腺癌组织中淋巴管与血管中内的表达；
[0016]附图3 =TMVPl在小鼠角膜肿瘤微袋模型中对肿瘤新生淋巴管的靶向识别效应；
[0017]附图4 =TMVPl对模式生物斑马鱼中新生淋巴管的靶向识别效应；
[0018]附图5:TMVP1-DKK体外对新生淋巴管的抑制作用；
[0019]附图6、TMVP1-DKK抑制斑马鱼淋巴管的发育；
[0020]附图7、多肽对小鼠角膜肿瘤及新生淋巴管的抑制效应；
[0021]附图8、TMVP1-DKK`对乳腺原位肿瘤及新生淋巴管生成的靶向抑制作用
五、【具体实施方式】:
[0022]以下结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细描述。
[0023](一)TMVPI 的筛选
[0024]1.细菌鞭毛肽库体外正负筛选对肿瘤转移相关抗原VEGFR-3的胞外区蛋白和人的IgG蛋白
[0025]①取一支肽库原液，室温融化后置无菌锥形瓶中，加入MC培养基(含IOOyg /ml氨卞青霉素)50ml, 250rpm25°C摇菌过夜约16小时；
[0026]②取部分过夜培养的菌液测OD26tl，根据IOD26tl^ IX 109cells，取含IX IOltl细胞的菌液，加入50mlIMC培养基(含IOOyg / ml氨卞青霉素)中，加入色氨酸500 μ 1，250rpm25°C摇菌6小时，以诱导细菌鞭毛肽库表达；
[0027]③人的IgG蛋白IOg / ml (ImlddH2O)包被60mm细胞培养用平皿，温柔旋转，室温I小时；
[0028]④封闭:在加入肽库前I小时，去除蛋白，加入新鲜配置的封闭液，含:
[0029]
IMC培养基(含lOOpg/ml氨卞青霉素)9.2ml/
脱脂奶0.lg /
5M NaCl300μ1 / 漩涡混匀
20% α-甲酰甘露糖甙500μ1 /
[0030]置于水平摇床,室温封闭I小时；
[0031]⑤在肽库诱导即将结束时，取一支试管，加入[0032]
【权利要求】
1.一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽，其命名为TMVPl，它包含五个氨基酸的核心序列LARGR，具备靶向恶性肿瘤内部淋巴管的特异性。
2.根据权利要求1所描述的核心序列LARGR作为引导肽在制备用于肿瘤及其转移灶的诊断标记物和治疗药物中的应用。
3.权利要求1所述的核心序列LARGR作为引导肽在制备基因治疗载体中的用途。
4.权利要求1所 述的核心序列LARGR在抗肿瘤生长及抑制肿瘤转移中的用途。
【文档编号】A61P35/00GK103804470SQ201410041476
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】马丁, 奚玲, 马湘一, 王世宣, 周剑峰 申请人:深圳市奥尼克斯基因技术有限公司