一种新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于白喉毒素分子（DT）效应基团DT390与肿瘤转移靶向性多肽TMTP1的三个重复序列的可靶向高转移肿瘤的新型重组融合蛋白及其制备方法，它是由白喉毒素蛋白效应基团、具有靶向高转移肿瘤导向肽TMTP1的三个重复串联序列和融合的His表达标签组成，其中DT390是白喉毒素第1-390个氨基酸。所述高转移肿瘤靶向的可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1是在大肠杆菌BL21中用37℃诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的DT390-triTMTP1蛋白。该融合蛋白可通过更大程度上达到靶向性杀灭肿瘤细胞的治疗目的，对正常细胞无明显影响，而对于有高转移潜能的肿瘤细胞，包括前列腺癌和胃癌，有显著的抑制增殖和诱导凋亡的效应，对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性，并为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。
【专利说明】—种新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1的制备与应用
【技术领域】[0001]本发明涉及一种新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl的制备与应用，其技术特征在于:构建白喉毒素分子(DT)效应基团DT390与肿瘤转移靶向性多肽TMTPl的三个重复序列串联(即GG/VKK湖GGGGSyVKK湖GGGGSyVKK湖)的重组原核表达载体，并进行重组蛋白的制备、表达、纯化与复性。经体内外实验证实该新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl可作为抗肿瘤药物，能选择性杀伤肿瘤细胞，有效地抑制肿瘤的生长与转移，且对正常细胞和组织没有明显的毒副作用。本
【发明内容】
属于医药生物【技术领域】。
[0002]
【背景技术】
[0003]恶性肿瘤严重威胁广大人民的健康与生命，全球每年癌症新发病例约有1000万例，因癌症导致死亡的病例约700万。而转移是肿瘤细胞播散的早期事件，是导致恶性肿瘤难以根治和高死亡率的重要原因。有效控制肿瘤转移就意味着显著改善肿瘤患者的生存期。临床上治疗恶性肿瘤的常规方法主要包括手术，化疗，放疗等。手术是早期恶性肿瘤患者的首选治疗手段，化疗是最常用的辅助治疗手段，能发挥清除手术残余病灶或转移灶的作用。化疗与手术联用，能较好的控制多种类型恶性肿瘤。但是，化疗药物会引起明显的全身性毒副作用和患者的不良反应，且多疗程的重复化疗容易引起肿瘤细胞的耐药性，抵抗化疗药物的作用。随着全球老龄化社会的到来以及肿瘤发病率的不断上升，降低恶性肿瘤传统的治疗方法复发率，提高肿瘤治疗的有效率是目前对治疗恶性肿瘤的迫切要求。临床上迫切需要研发一些药物针对常规治疗效果不理想的难治性肿瘤(高转移性肿瘤，耐药性肿瘤)。靶向治疗药物应运而生，其目的是提高病灶局部的药物浓度，减少药物毒副反应，降低用药剂量，使药物能安全有效的发挥作用。
[0004]分子靶向治疗作为近年来的一项新兴技术，引起肿瘤界的极大关注。目前放疗和化疗等常规辅助肿瘤在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有不同程度的损伤，从而引起肿瘤治疗毒副作用，严重者可影响治疗进行、甚至危及患者生命，因此应用多肽进行肿瘤靶向性生物治疗是目前肿瘤生物治疗发展的方向。在临床上，大多数化疗药物并不是优先在肿瘤病灶浓聚。有研究表明，到达肿瘤灶的化疗药物的总量只占正常组织的5%~10%，同时化疗药物的毒副作用常常限制了化疗药物的最佳使用量，最终导致化疗不完全、早期复发和化疗耐药。迄今，已有许多优化方法被使用来提高化疗药物的选择毒性，如化疗药物的包被，单克隆抗体或肿瘤特异性受体/肽配体的导向等等。目前分子靶向诊治的手段主要有两类:单克隆抗体和祀向性多肽(Homing peptide)。祀向性多肽(homing peptide)是目前
认为比较理想的一种肿瘤诊断和靶向性治疗的载体，较单克隆抗体而言，其优点为:4血浆清除速度快、高亲和力、高特异性良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；3易于化学合成和低免疫原性的特点。近十余年，国内外研究者应用肽库技术针对不同的靶点进行不同的肿瘤靶向肽筛选，例如Arap W等对乳腺癌荷瘤小鼠进行肽库筛选后获得一系列与肿瘤血管特异性结合的短肽，其中的RGD序列被证实可与整合素结合，可特异性靶向多种肿瘤。在巨大的医疗需求的推动下，利用导向肽制备用于肿瘤诊断、治疗的造影剂、药物和制备基因治疗载体制剂将有可能在数年内正式上市成为临床治疗药物，成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望。Arap W利用RGD序列与阿霉素交联后应用于荷瘤小鼠，发现药物的抗肿瘤疗效显著增加而毒性作用明显减少。新近对新多肽SP94与脂质体阿霉素交联后应用于肝癌重度联合免疫缺陷荷瘤小鼠的研究发现，优化药物释放系统增加肿瘤细胞的凋亡和降低肿瘤血管生成，从而显著增加抗瘤效应。
[0005]免疫毒素是蛋白毒素分子(植物毒素、细菌毒素、真菌毒素、动物毒素等)与来自免疫系统的靶向分子(单克隆抗体、免疫球蛋白、生长因子等)通过化学连接或者基因工程技术偶联形成的融合毒素。近年来，随着基因工程技术的发展，一般都是采用该技术构建毒素分子与靶向分子的融合基因，然后再表达和纯化融合蛋白。常用的毒素分子通常来自细菌毒素的白喉毒素(DT)或假单胞菌外毒素(PE)。靶向性融合毒素为恶性肿瘤患者提供了一种令人鼓舞的全新治疗方法。尤其是一些对放疗，化疗等传统治疗效果不理想的患者，应用靶向性融合毒素治疗的意义更为深远。靶向性融合毒素治疗策略很简单:携带了毒素蛋白的靶向分子能识别并结合肿瘤细胞，然后进入细胞内，由毒素蛋白发挥毒性杀死细胞。多种不同的靶向分子都能用于制备靶向性融合毒素，如能识别肿瘤细胞表面特异性表位的抗体分子，或者能够识别并结合肿瘤细胞表面特殊受体的配体分子等。发挥细胞毒性作用的毒素分子通常来源于细菌(如白喉毒素DT或假单胞菌外毒素)或植物(如蓖麻毒素或相思豆毒素)。这些毒素通过不同作用机制抑制细胞蛋白质合成，引起细胞死亡。蓖麻毒素通过切断核糖体，而白喉毒素和假单胞菌外毒素通过发挥ADP-核糖基化活性抑制细胞蛋内白质合成，最终导致细胞凋亡。因为融合毒素分子只能进入表面具有导向分子识别和结合受体的细胞。所以理论上这种靶向融合毒素能选择性的最大程度杀伤肿瘤细胞，同时降低治疗的副反应。
[0006]白喉毒素是一种毒性十分强大的细胞毒素。天然的白喉毒素分子能广谱杀伤真核细胞，通过其天然受体结合域(R区)与哺乳类动物细胞表面的肝素结合表皮生长因子受体结合，经过胞吞作用，被运输到酸性吞噬小泡，进行PH值依赖性的构型改变,酶活性域(C区)被剪切并释放到胞内。胞内的酶活性域通过催化延长因子2的ADP核糖基化，弓丨起蛋白合成受到阻断，细胞凋亡。近年来，靶向性融合毒素的开发和应用都发展迅速。通过基因工程技术将能选择性靶向到恶性肿瘤细胞表面的配体取代白喉毒素天然受体结合域(R区)，产生大量截短或重组的白喉毒素融合蛋白。这些融合毒素代表一类新型的细胞毒性药物。与化疗药物不同，白喉毒素类融合毒素通过靶向分子引起受体介导的内吞，选择性的进入毒素敏感细胞内，引起靶细胞凋亡。迄今为止，基于白喉毒素的融合毒素主要包括:DT508-MSF，DT486-1L-2, DT390-GM-CSF，DT390-1L3，DT388-GM-CSF，DT388-1L-3，DT385-VEGF，以及DT388与μ PA的融合。这些融合毒素中，nT388_IL3在临床试验中取得了一些比较好的效果，然而只有DT389-1L2重组融合毒素(地尼白介素2)被美国FDA批准上市，用于治疗成人皮肤T细胞淋巴瘤。
[0007]采用基因工程技术连接配体和毒素的策略不仅克服了化学连接方法的缺点，还展示了其如高精确度，更强的稳定性等优点。生产的白喉毒素类融合毒素已被用于肿瘤，传染病，血液病的治疗，部分药物取得了很好的临床疗效。在毒素与配体之间增加一个连接物，通过更好的受体、配体间相互作用促使融合毒素发挥更好的效应，与血清半衰期长的配体结合能使小分子量分子的半衰期延长，根据选择性靶向肿瘤细胞表面高表达分子的策略制备的免疫毒素副作用小甚至没有副作用，且对周围正常组织显示更好的安全性。
[0008]过去的几十年中，学者们通过培养的细胞，动物模型，以及临床病人研发了大量抗各种各样恶性肿瘤的免疫毒素。其中，由生长因子或Fv片段作为导向分子构成的小分子融合毒素的效应最好。免疫毒素在体内外实验中都显示了良好的生物效应，但实际上，到目前为止，仅仅适用于实验研究以及临床上体外应用。Woo JH等人制备的双价抗人T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv (MCHTl)将白喉毒素与两个串联的单链抗体sFv融合表达，结果显示二价重组毒素的结合力是一价的七倍，而杀伤力增强至十倍。今后的临床应用中可以将免疫毒素与多价的靶向分子联用，以克服免疫毒素的低肿瘤渗透性，非特异性毒性和免疫原性等问题。研制开发出的靶向性抗肿瘤新型生物制剂，可有效弥补目前基因治疗靶向性的不足；同时减轻对正常组织的毒副作用，从根本上改善基因治疗的安全性问题，对高效、安全的靶向性治疗药物的研发具有指导意义，可望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。
【发明内容】
[0009]基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种基于白喉毒素分子(DT)效应基团DT390与肿瘤转移靶向性多肽TMTPl的三个重复序列串联的可溶性融合蛋白及其制备方法，通过该方案获得的可溶性融合蛋白具有高效靶向抑制高转移潜能肿瘤生长与增殖、可有效抑制其转移等明显优势，而对正常的细胞或组织没有明显的毒副作用，可以弥补目前肿瘤治疗领域的不足之处，为将来肿瘤转移的生物靶向治疗提供新的选择。
[0010]本发明的技术方案是:一种靶向高转移潜能可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl，其特征是:它是由白喉毒素蛋白效应基团、具有靶向高转移肿瘤的导向肽TMTPl的三个重复序列和融合的His表达标签组成；其中DT390是白喉毒素`第1-390个氨基酸。
[0011 ] 所述的DT390包含白喉毒素的催化区(酶活化区，第1-193位氨基酸)、跨膜转运区(第205-379氨基酸);所述的具有靶向高转移肿瘤的导向肽TMTPl是该可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的His表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端。
[0012]所述靶向高转移肿瘤的可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl是在大肠杆菌BL21(DE3) plysS中用37°C诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的DT390-triTMTPl蛋白。
[0013]与现有的免疫毒素相比，本发明达到了以下效果:
I本可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl构建包含白喉毒素的第1_390位氨基酸及具有靶向高转移肿瘤的导向肽TMTPl的三个重复序列，在理论上既保留了白喉毒素的杀伤效应，同时又发挥了肿瘤转移导向肽TMTPl靶向效应。由于这种全新的设计，使这一新的构建体可更大程度上实现靶向性杀灭肿瘤细胞，达到抑制肿瘤细胞生长和转移目的。此外，本发明也将为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。
[0014]2体外实验结果表明，该可溶性融合蛋白对于有高转移潜能的肿瘤细胞，包括前列腺癌和胃癌，有显著的抑制增殖和诱导凋亡的效应，而对正常细胞无明显影响。
[0015]3对肿瘤动物模型的体内模型研究证实，通过腹腔注射的用药途径，该可溶性融合蛋白对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性。
[0016]4制备出肿瘤导向肽与白喉毒素的融合蛋白，作为一种有效的抗肿瘤的生物治疗制剂，由于其既具有白喉毒素高效细胞毒性，又能在高转移肿瘤细胞处富集，因此该新型可溶性融合蛋白具备临床开发应用的前景， 比如在高转移的晚期卵巢癌和胃癌等患者，作为一种新的生物治疗策略。
[0017]【专利附图】
【附图说明】:
图1、融合蛋白DT390-triTMTPl的构建示意图；
图2、融合蛋白DT390-triTMTPl的三维模拟图；
图3、融合蛋白DT390-triTMTPl的纯化的电泳图；
图4、融合蛋白DT390-triTMTPl抑制肿瘤细胞的增殖；
图5、融合蛋白DT390-triTMTPl诱导肿瘤细胞凋亡；
图6、融合蛋白DT390-triTMTPl体内抗肿瘤生长作用；
图7、融合蛋白DT390-triTMTPl体内对肿瘤转移的抑制作用；
图8、融合蛋白DT390-triTMTPl在裸鼠体内各脏器的分布
【具体实施方式】:
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0018]依照本发明的技术方案制备的三个重复序列的具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTPl与白喉毒素蛋白效应基团DT390融合蛋白，应用基因克隆技术，构建了三个重复序列的具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTPl与白喉毒素蛋白效应基团DT390的融合基因，并在大肠杆菌中获得闻效表达。
[0019]实现本发明的三个重复序列的具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTPl与白喉毒素蛋白效应基团DT390融合蛋白的制备方法，按以下步骤制备:
(一)DT390-triTMTPl基因片段的获得:
在DT390-triTMTPl引物两端分别设计了限制性酶切位点Ndel和Xhol，以便定向克隆。并在下游引物上设计了一段编码三个TMTPl的序列。用上述引物从含有白喉毒素全长序列的质粒中PCR扩增，获得DT390与TMTPl融合的基因片段，简称DT390_triTMTPl片段
1.PCR扩增目的基因:
根据白喉毒素第1-390位氨基酸序列，采用引物设计软件Oligo 6.0，设计特异性扩增TMTPl-triDT390引物，在5’端分别加上Nde I和Xho I的酶切位点序列，引物序列为:上游:5’ - CAT ATG GGC GCT GAT GAT GTT GTT G -3’
下游:5’- CTC GAG ATT ATT GAC GCA CCA CGT TAG AAC CAC CAC CAC CTT GAC GCACCA CGT TTG AAC CAC CAC CAC CTT GAC GCA CCA CGT TAC CAC C -3’
以我室保存含白喉毒素的质粒作为模板:
PCR反应体系(50 μ I)
Taq 酶 IOXbuffer5 μ I
MgCl2 (25mM)3 μ I
dNTP (IOmM)I μ I
【权利要求】
1.一种新型靶向高转移肿瘤的可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl的制备与应用，其特征是:它是由白喉毒素蛋白效应基团、靶向高转移肿瘤导向肽TMTPl的三个重复序列和融合的His表达标签组成；其中DT390是白喉毒素第1-390个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种新型靶向高转移潜能可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl，其特征是:所述的DT390包含白喉毒素的催化区(酶活化区，第1-193位氨基酸)、跨膜转运区(第205-379氨基酸)；所述的可靶向高转移肿瘤导向肽TMTPl是该可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的His表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端。
3.所述高转移肿瘤靶向可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl是在大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中用37°C诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的DT390-triTMTPl蛋白。
4.DT390-triTMTPl的氨基酸序列:
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIGSLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAffAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLGGNVVRQGGGGSNVVRQGGGGSNVVRQ DT390-triTMTPl的核酸序列:
ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAACTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTcACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGaGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGGGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCgatAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAGATGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTGGAGGAAACGTGGTGCGTCAAGGAGGAGGAGGATCAAACGTGGTGCGTCAAGGTGGTGGTGGTTCTAACGTGGTGCGTCAATAA。
5.权利要求1所述的新型重组可溶性融合蛋白在体外抑制肿瘤的增殖能力及诱导肿瘤细胞凋亡中的应用。
6.权利要求1所述的新型重组可溶性融合蛋白在抗肿瘤生长及抑制肿瘤转移中的用途。
【文档编号】C07K19/00GK103694357SQ201210365834
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年9月27日 优先权日:2012年9月27日
【发明者】马丁, 王世宣, 卢运萍, 奚玲, 马湘一 申请人:深圳市奥尼克斯基因技术有限公司