基于CyPA和Gag的DNA疫苗的制作方法

基于CyPA和Gag的DNA疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基于CyPA和Gag的DNA疫苗，其包含编码CyPA的多核苷酸和编码HIV的Gag蛋白的多核苷酸，其中所述DNA疫苗在接种于人类对象后允许在所述对象中表达所述CyPA和Gag蛋白，并由此引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。本发明还涉及使用所述DNA疫苗在人类对象中预防或治疗HIV感染的方法。
【专利说明】基于CyPA和Gag的DNA疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及HIV感染的治疗和预防。具体而言，本发明涉及一种DNA疫苗，其包含编码CyPA的多核苷酸和编码HIV的Gag蛋白的多核苷酸，其中所述DNA疫苗在接种于人类对象后允许在所述对象中表达所述CyPA和Gag蛋白或其片段，并由此引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。本发明还涉及使用所述DNA疫苗在人类对象中预防或治疗HIV感染的方法。
【背景技术】
[0002]DNA疫苗问世已有二十多年，尽管其具有安全性高、构建周期短、能诱导一定强度特异性免疫应答尤其是T细胞应答等优势，但其仍然有投送效率低和免疫原性弱的巨大瓶颈。利用佐剂来提高DNA疫苗的免疫原性是有效途径之一。针对DNA疫苗这一特殊的疫苗形式，筛选一些在DNA疫苗中能够发挥佐剂效应的基因对于DNA疫苗的研发重大具有意义。现行临床试验研究显示，HIV-1 Gag DNA疫苗诱导的特异性免疫应答较弱，通过改良疫苗载体及投送途径均不能有效引发针对Gag的细胞免疫应答，因此需要新的Gag特异性的基因佐剂以增强其免疫应答强度。
[0003]研究显示在人体细胞组成型表达的肽基脯氨酸顺反异构酶亲环素A(CyclophilinA, CyPA)与HIV-1 Gag蛋白的片段P24的N末端存在特异性相互作用，并使得CyPA这种胞衆宿主蛋白特异性的掺入到病毒颗粒中(Franke EK, Yuan HE, Luban J.Specificincorporation of cyclophilin A into HIV-lvirions.Nature 1994;372:359-62;Thali M, Bukovsky A, Kondo E, Rosenwirth B, Walsh CT, Sodroski J,et al.Functionalassociation of cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994;372:363-5)。并证实，这种特异性的相互作用显著影响病毒的复制能力(Braaten D7Luban J.Cyclophilin Aregulates HIV-linfectivity,as demonstrated by gene targeting in human T cells.The EMBO journal 2001 ；20:1300-9)以及引发的宿主针对HIV-1病毒的天然免疫应答(Manel N, Hogstad B, Wang Y, Levy DE, Unutmaz D, Littman DR.A cryptic sensor forHIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells.Nature2010 ；467:214-7)。

【发明内容】
[0004]本发明基于以下发现，即与仅表达HIV Gag蛋白的DNA构建体相比，同时表达CyPA蛋白和HIV Gag蛋白的DNA构建体在接种于对象后能够引发增强的针对Gag的特异性免疫应答。
[0005]因此，本发明提供一种DNA疫苗，其包含免疫学有效量的编码CyPA的第一多核苷酸和编码HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分别可操纵地连接于启动子，且所述DNA疫苗在接种于人类对象后允许在所述对象中表达所述CyPA和Gag蛋白或所述片段，并由此引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。[0006]在本发明的DNA疫苗中，所述第一多核苷酸编码的CyPA包含与SEQ ID NO:1具有至少70%相同性的氨基酸序列。优选地，所述CyPA包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
[0007]在本发明的DNA疫苗中，所述第二多核苷酸编码的Gag蛋白来自HIV-1或HIV-2。所述 HIV-1 包括但不限于以下亚型:A、B、C、D、F、G、H、J、K、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF03_AB、CRF04_cpx、CRF05_DF、CRF06_cpx、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF09_cpx、CRF10_CD、CRFl 1_cpx、CRF12_BF、CRF13_cpx、CRF14_BG、CRF15_01B、CRF16_A2D、CRF17_BF、CRF18_cpx、CRF19_cpx、CRF20_BG、CRF21_A2D、CRF22_0IAl、CRF23_BG、CRF24_BG、CRF25_cpx、CRF26_AU、CRF27_cpx、CRF28_BF、CRF29_BF、CRF30_0206、CRF31_BC、CRF32_06A1、CRF33_01B、CRF34_01B、CRF35_AD、CRF36_cpx、CRF37_cpx、CRF38_BF、CRF39_BF、CRF40_BF、CRF41_CD、CRF42_BF、CRF43_02G、CRF44_BF、CRF45_cpx、CRF46_BF、CRF47_BF、CRF48_01B、CRF49_cpx、CRF50_A1D、0^51_0川、0^52_018、0^53_018和0^54_018。在一些实施方式中，所述第二多核苷酸编码完整的HIV Gag蛋白。所述Gag蛋白包含与SEQ ID NO: 10具有至少80%相同性的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，所述Gag蛋白包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列。在另一些实施方式中，所述第二多核苷酸编码HIV Gag的免疫原性片段，例如，包含SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的Gag蛋白的免疫原性片段。
[0008]在一些实施方式中，本发明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸和第二多核苷酸由同一表达载体携带，优选地，所述编码CyPA的第一多核苷酸与编码HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸被分别表达。在另外一些实施方式中，本发明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸与第二多核苷酸由不同表达载体携带。优选地，本发明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸与第二多核苷酸的比例是大约1: 10至大约10: I。更加优选地，所述第一多核苷酸与第二多核苷酸的比例是大约1:1。
[0009]本发明还提供在人类对象中预防或治疗HIV感染的方法，其包括给所述对象施用如上所述的本发明的DNA疫苗，由此在所述对象中引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。优选地，给所述对象施用两次或更多次本发明的DNA疫苗，两次施用的间隔为2至4周。优选地，给所述对象施用3次本发明的DNA疫苗。可通过选自肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、淋巴管注射和粘膜免疫的一或`多种途径给所述对象施用本发明的DNA疫苗。优选地，本发明的DNA疫苗在对象中引发Gag-特异性的抗HIV细胞免疫应答。
【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1 为 PDRVI4.0-Homo CyPA 质粒的图谱。
[0011]图2 为 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA 质粒图谱。
[0012]图3显示CyPA对HIV-1 Env和Gag诱导的特异性免疫应答具有不同的影响。
[0013]图4显示小鼠和人的CyPA增强了 Gag诱导的特异性细胞免疫应答，但对Gag诱导的特异性体液免疫应答无显著性影响。
[0014]图5显示CyPA与Gag联合使用扩大了 DNA疫苗引发的针对Gag抗原的T细胞免疫应答谱。
[0015]生物材料保藏
[0016]含有pDRVI4.0 质粒的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 a (pDRVI4.0)已于2012年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号CGMCC N0.6514。
[0017]发明详述
[0018]除非另有说明，否则本说明书中所使用的科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。通常，本说明书中所使用的与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学有关的命名及其技术是本领域公知和常用的。
[0019]除非另有说明，否则本说明书中所使用的方法及技术一般根据本领域公知的和常规的方法和本说明书中所阐述的或引用的各种参考文献中所述的方式来进行。例如参见 Sambrook J.及 Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2000) ；Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.(2002) ;Harlow及Lane UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, N.Y.(1998);及Coligan 等人,Short Protocols in Protein Science, Wiley, John& Sons, Inc.(2003)。
[0020]在本说明书及权利要求书中，“包含”一词应理解为既可表示仅包括所 述的元件或元件的组，也可表示在所述的元件或元件的组的基础上不排除任何其它元件或元件的组。除非另有说明，否则当本说明书使用术语“一”、“一个”或“一种”时，其意味着“至少一个(种)”或“一或多个(种)”。
[0021]本说明书中所引用的所有出版物、专利及专利申请均以全文引用的方式并入本说明书中。
[0022]本发明提供一种DNA疫苗，其包含免疫学有效量的编码CyPA的第一多核苷酸和编码HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分别可操纵地连接于启动子，且所述DNA疫苗在接种于人类对象后允许在所述对象中表达所述CyPA和Gag蛋白或所述片段，并由此引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。
[0023]在本说明书中，术语“疫苗”是指被施用于动物体以产生或者增强针对特定疾病的免疫力的组合物。术语“DNA疫苗”，也称“核酸疫苗”或“基因疫苗”，是指包含编码免疫原或与免疫原相关的分子的真核表达质粒DNA的组合物，它可经一定途径进入动物体内，并在动物体内转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性两种免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。
[0024]现行临床试验研究显示，常规的基于HIV Gag的DNA疫苗诱导的特异性免疫应答较弱，通过改良疫苗载体及投送途径均不能有效引发针对Gag的细胞免疫应答，因此需要新的Gag特异性的基因佐剂以增强其免疫应答强度。
[0025]本发明人出乎预料地发现，与仅表达HIV Gag蛋白的DNA疫苗相比，本发明的DNA疫苗能够引发增强的Gag-特异性免疫应答。因此，在本发明的DNA疫苗中，编码CyPA的第一多核苷酸的作用类似于基因佐剂。
[0026]人肽基脯氨酸顺反异构酶亲环素A(Cyclophilin A，CyPA)的长度为165个氨基酸，具有8个双链反向平行β桶状结构，且其活性位点结构域位于桶状结构的一侧(Kallen, J., Spitzfaden, C., Zurini, M.GM., Wider, G, Widmer, H., Wu..thrich, K., andffalkinshaw, M.D.(1991).Structure of human cyclophilin and its binding sitefor cyclosporin A determined by isoX-ray crystallographyand NMR spectroscopy.Nature 353,276-279 ;Kallen，J.，and Walkinshaw,M.D.(1992).The X-ray structure ofa tetrapeptide bound to the active site of human cyclophilin A.FEB S Lett.300,286-290 ;Ke，H.，Mayrose, D.，andCao，W.(1993).Crystal structure of cyclophilinA complexedwith substrate Ala-Pro suggests a solvent-assisted mechanism ofcis-trans isomerization.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90，3324-3328)。CyPA 与 Gag 蛋白N末端相互结合时，能够形成一个约2.36人的晶体结构，CyPA活性位点与Gag蛋白的第85-93 位残基相互作用(Gamble TR, Vajdos FF, Yoo S, Worthylake DK, Houseweart M, etal.(1996)Crystal structure of human cyclophilin A bound to the amino-terminaldomain of HIV-1 capsid.Cell 87:1285-1294)。
[0027]在优选的实施方式中，用于本发明的DNA疫苗中的所述CyPA是来源于人的CyPA，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。用于本发明的DNA疫苗中的所述CyPA也可以是人CyPA的变体。所述CyPA的变体可以是天然存在的，例如来源于非人灵长类动物(例如恒河猴、黑猩猩)、鼠(例如小鼠、褐家鼠)、牛、节肢动物(例如家蚕)、鱼类(例如斑马鱼)、两栖类动物(例如非洲爪蛙)的CyPA。
[0028]用于本发明的DNA疫苗中的所述CyPA也涵盖通过一或几个氨基酸的缺失、插入或取代而衍生自SEQ ID NO:1且基本上保持人CyPA的功能活性的人工变体。
[0029]在一些实施方式中，可用于本发明的DNA疫苗中的所述CyPA的天然存在的变体或人工变体包含与SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相同性的氨基酸序列，且所述变体基本上保持人CyPA的功能活性。
[0030]多肽或蛋白质的序列相似性(亦称为序列相同性)通常使用序列分析软件来量测。蛋白质分析软件使用归因于各种取代、缺失及其它修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性的度量来匹配相似的序列。举例而言，GCG含有诸如“Gap”及“Bestfit”的程序，其在默认参数下用于测定密切相关多肽(诸如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列相同性。例如参见6.1版GCG。多肽序列亦可使用FASTA(6.1版GCG中`的程序)，使用默认或推荐参数来比较。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查询及搜索序列之间的最优选重叠区域的比对及序列相同性百分比(Pearson, Methods Enzymo1.183:63-98(1990) ；Pearson, Methods Mol.Biol.132:185-219 (2000))。当将本发明的氨基酸序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库作比较时，替代算法为使用默认参数的计算机程序BLAST,尤其为blastp或tblastn。例如参见Altschul 等人，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990) ;Altschul 等人,Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。
[0031]当需要比对时，比对序列的最大同源性。变异位点可出现于多肽的任何位置，只要生物活性实质上类似于SEQ ID NO:1所示的人CyPA即可。
[0032]关于如何产生沉默氨基酸取代的教导可参见Bowie等人，Science, 247:1306-1310(1990)中，该文献揭示了蛋白质对氨基酸取代的容许度(tolerance)是惊人的。
[0033]在蛋白质中引入氨基酸突变的方法是本领域技术人员所熟知的。例如参见Ausubel (编)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.(1994) ；T.Maniatis, E.F.Fritsch 及 J.Sambrook, Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)。
[0034]也可使用市售试剂盒(诸如“QuikChangeTM定点诱变试剂盒”(Stratagene))或直接通过肽合成来引入突变。本领域技术人员能够通过置换不显著影响CyPA的功能的保守性氨基酸来产生CyPA的功能活性变体。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基经另一具有化学性质(例如电荷或疏水性)类似的侧链R基团的氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或两个以上氨基酸序列互不相同之处为保守性取代的情况下，可调高序列相同性或相似度百分比以校正该取代的保守性质。进行此调节的方式为本领域技术人员所熟知。例如参见Pearson，MethodsMol.Biol.243:307-31(1994)。
[0035]具有化学性质类似的侧链的氨基酸组的实例包括:(I)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链:丝氨酸及苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链:天冬酰胺及谷氨酰胺；(4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链:天冬氨酸及谷氨酸；及(7)含硫侧链:半胱氨酸及甲硫氨酸。优选保守性氨基酸取代组为:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0036]或者，保守性置换是Gonnet等人，Science 256:1443-45 (1992)中所揭示的PAM250对数似然矩阵具有正值的任何改变。“中度保守性”置换为PAM250对数似然矩阵具有非负值的任何改变。
[0037]人CyPA的功能活性变体亦可使用杂交技术来分离。简言之，使用与编码CyPA(例如SEQ ID NO:1)的核酸序列的全部或一部分具有高同源性的DNA来制备功能活性肽。因此，可用于本发明的CyPA也包括功能上等同于SEQ ID NO:1的人CyPA且由与编码SEQ IDN0:1的核酸或其互补序列杂交的核酸分子编码的肽。本领域技术人员可容易地使用易于得到的密码子表来确定编码本发明的肽的核酸序列。
[0038]编码人CyPA的功能活性变体的核酸的杂交严格性为例如10%甲酰胺、5X SSPE、IX登哈特溶液(Denhart，s soluti`on)及IX鲑鱼精DNA(低严格性条件)。更优选条件为25%甲酰胺、5XSSPE、1X登哈特溶液及IX鲑鱼精DNA (中等严格性条件)，且甚至更优选条件为50%甲酰胺、5XSSPE、1X登哈特溶液及IX鲑鱼精DNA(高严格性条件)。然而，除上述甲酰胺浓度外，若干种因素可影响杂交严格性，且本领域技术人员可适当地选择这些因素以达到类似严格性。
[0039]编码人CyPA的功能活性变体的核酸分子也可通过基因扩增方法来分离，例如使用编码人CyPA的核酸分子的一部分作为探针的PCR方法。
[0040]在一些实施方式中，可用于本发明的DNA疫苗中的所述CyPA包含选自如下一组的氨基酸序列:SEQ ID NO:1 (人 CyPA)、SEQ ID NO:2 (恒河猴，100% ), SEQ ID NO:3 (黑猩猩，100% )、SEQ ID NO:4(小鼠，95.8% )、SEQ ID NO:5 (褐家鼠，95.6% )、SEQ ID NO:6 (牛，79.2% )、SEQ ID NO:7 (家蚕，70.9% )、SEQ ID NO:8 (斑马鱼，73.8% )和 SEQ IDNO:9(非洲爪蛙，75.6%)，其中括号内给出的是CyPA的物种来源及其与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相同性。
[0041]在本发明的DNA疫苗中，所述HIV的Gag蛋白来自HIV-1或HIV-2。所述HIV-1包括但不限于以下亚型:A、B、C、D、F、G、H、J、K以及流行性重组型(circulating recombinantform, CRF)病毒 CRFO 1_AE、CRF02_AG, CRFO3_AB, CRF04_cpx、CRF05_DF, CRF06_cpx,CRF07_BC、CRF08_BC、CRF09_cpx、CRF10_CD、CRFll_cpx、CRF12_BF、CRF13_cpx、CRF14_
BG、CRF15_01B、CRF16_A2D、CRF17_BF、CRF18_cpx、CRF19_cpx、CRF20_BG、CRF21_A2D、CRF22_01A1、CRF23_BG、CRF24_BG、CRF25_cpx、CRF26_AU、CRF27_cpx、CRF28_BF、CRF29_BF、CRF30_0206,CRF31_BC、CRF32_06A1、CRF33_01B、CRF34_01B、CRF35_AD、CRF36_cpx、CRF37_cpx、CRF38_BF、CRF39_BF、CRF40_BF、CRF41_CD、CRF42_BF、CRF43_02G、CRF44_BF、CRF45_cpx、CRF46_BF、CRF47_BF、CRF48_01B、CRF49_cpx、CRF50_A1D、CRF51_01B、CRF52_01B、CRF53_01B 和 CRF54_01B。
[0042]在本发明的DNA疫苗中，所述Gag蛋白包含与SEQ ID NO: 10 (Gag蛋白的标准氨基酸序列，来源于HIV-1 B亚型HXB2参考株)具有至少80%、85%、90%或95%相同性的氨基酸序列。在一些【具体实施方式】中，用于本发明的DNA疫苗中的所述Gag蛋白包含SEQ IDNO: 11所示的HIV-1 B’ /C亚型CN54株Gag蛋白的氨基酸序列。
[0043]HIV-1 Gag前体蛋白P55剪切后，产生包膜蛋白P24，其参与到病毒颗粒的组装及后续病毒侵染细胞等过程。CyPA与HIV-1 Gag P24的N末端存在特异性相互作用，并使得CyPA这种胞衆宿主蛋白特异性地参入到病毒颗粒中(Franke EK, Yuan HE, LubanJ.Specific incorporation of cyclophilin A into HIV-1 virions.Nature 1994 ；372:359-62 ；Thali M, Bukovsky A, Kondo E, Rosenwirth B, Walsh CT, Sodroski J, etal.Functional association of cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994 ；372:363-5)。因此，在另外一些实施方式中，本发明的DNA疫苗中使用的是Gag蛋白的免疫原性片段，例如包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的Gag蛋白的免疫原性片段P24。
[0044]在本发明的DNA疫苗的一些实施方式中，可以对编码CyPA的所述第一多核苷酸和/或编码HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸进行密码子优化，适合于在人类对象中表达。密码子优化的策略 是本领域人员已知的。
[0045]在一些实施方式中,本发明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸和第二多核苷酸由同一表达载体携带，优选地，所述编码CyPA的第一多核苷酸与编码HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸被分别表达。在另外一些实施方式中，本发明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸与第二多核苷酸由不同表达载体携带。
[0046]本发明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分别可操纵地连接于启动子或置于其他表达调控元件的控制下，以使得本发明的DNA疫苗在接种于人类对象后能够在所述对象中表达所述CyPA和Gag蛋白或所述片段。启动子可以是任何适合于真核表达载体的启动子，例如CMV或SV40启动子。表达调控元件例如为具有双链发卡结构 RNA 兀件(Li D, Liu Y, Zhang Y, Xu J, Hong K, et al.(2007)Adjuvant effectsof plasmid-generated hairpin RNA molecules on DNA vaccination.Vaccine 25:6992-7000.)，或某些具备增强外源基因表达功能的增强型元件(Li HS，Liu Y，Li DF7ZhangRR, Tang HL, et al.(2007)Enhancement of DNA vaccine-1nduced immune responses bya 72-bp element from SV40 enhancer.Chin Med J(Engl) 120:496-502 ；Sun J,Li D,HaoY, Zhang Y, Fan ff, et al.(2009)Posttranscriptional regulatory elements enhanceantigen expression and DNA vaccine efficacy.DNA Cell Biol 28:233-240)。优选地，用于构建本发明的DNA疫苗的载体是真核细胞表达载体或其优化形式。通常含有CMV或SV40启动子，卡那霉素抗性基因，以及一些其他调节优化基因元件如BCGpA和Exon等。
[0047]在一些实施方式中,本发明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸与第二多核苷酸的比例是大约1: 10至大约10: 1，例如大约1: 8至大约8: 1，大约1: 5至大约5: 1，大约1: 4至大约4: 1，大约1: 3至大约3: 1，或大约1: 2至大约2: I。优选地，所述第一多核苷酸与第二多核苷酸的比例是大约1:1。所述比例优选地指摩尔比或拷贝数比，不过，鉴于载体的长度一般远大于所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的长度，因此质量比在大多数情况下近似于摩尔比或拷贝数比。例如质量比与摩尔比或拷贝数比的实际差异在10%左右是允许的。也可以通过使用不同的表达调控元件例如启动子来改变所述CyPA和Gag蛋白的表达水平来调节本发明的DNA疫苗在体内实际产生的CyPA和Gag蛋白的水平。 [0048]本发明的DNA疫苗还包含药用可接受的赋形剂。术语“赋形剂”在本说明书中用于描述除活性成份(即所述第一多核苷酸和第二多核苷酸)外的任何成份。赋形剂的选择将在很大程度上视例如特定施用方式、赋形剂对溶解性及稳定性的作用及剂型的性质等因素而定。在本说明书中，“药用可接受的赋形剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂及生理学上相容的类似物。药用可接受的赋形剂的一些实例为水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其类似物以及其组合。在多数情况下，优选该组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。药用可接受的物质的其它实例为湿润剂或少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增加活性成份的存放期或增强活性成份的有效性。
[0049]本发明的疫苗及其制备方法对于本领域技术人员为显而易知。疫苗组合物及其制备方法可见于例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences,第 19 版(Mack PublishingCompany, 1995)中。疫苗组合物优选在GMP条件下制造。
[0050]本发明的DNA疫苗组合物可以单一单位剂量形式或以多单一单位剂量形式整批制备并包装。在本说明书中，“单位剂量”为包含预定量活性成份的DNA疫苗组合物的个别量。活性成份的量一般等于向个体施用的活性成份的剂量或该剂量的合适部分(例如该剂量的一半或三分之一)。
[0051]可选择多种方法来检测本发明的DNA疫苗诱导的特异性免疫应答。例如，针对细胞免疫应答反应，可以通过ELISP0T技术检测抗原特异性刺激后免疫细胞分泌的细胞因子的水平来测定免疫应答的强度，或者可以通过流式细胞术检测抗原刺激后不同免疫细胞亚群来分析多种细胞因子的强度，由此分析多功能细胞免疫应答反应水平。针对体液免疫应答，可以通过ELISA技术检测疫苗诱导的抗原特异性结合抗体强度，通过中和抗体技术可以检测疫苗诱导的抗原特异性中和抗体水平及广谱程度，从而反映疫苗针对病原体潜在的保护性。可以采用商品化的试剂盒来检测本发明的DNA疫苗诱导的特异性免疫应答。
[0052]本发明还提供在人类对象中预防或治疗HIV感染的方法，其包括给所述对象施用如上所述的本发明的DNA疫苗，由此在所述对象中引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。
[0053]本领域所接受的任何施用DNA疫苗的方法均可适当地用于本发明的方法中。例如，可通过选自肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、淋巴管注射和粘膜免疫的一或多种途径给所述对象施用本发明的DNA疫苗组合物。优选地，可通过肌肉注射和淋巴管注射施用本发明的DNA疫苗组合物。[0054]注射的DNA在肌肉细胞中以环型分子存在，不能复制，并不能整合到宿主细胞染色体中。肌肉细胞中特有的横管系统与细胞外空间有直接交通，因而可介导质粒DNA的内吞作用。而且横纹肌中溶酶体和DNA酶的含量较低，可能也是质粒DNA能在细胞中存在较长时间的原因。
[0055]对于特定的施用方式，例如皮下注射，也可采用例如微离子轰击介导的DNA免疫，即基因枪。其技术依据是亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将包裹有金粉或钨粉的DNA质粒，借助高能电场以极快的速度轰击动物表皮组织，能获得满意的免疫效果。而对于粘膜免疫，可以将本发明的DNA疫苗包囊化于脂质体中进行施用。
[0056]本发明的例示性、非限制性DNA疫苗组合物为呈无菌水溶液的配制物，其pH值在约6.5至约7.5的范围内且包含约0.lmg/mL至约5mg/mL本发明的DNA疫苗、约I毫摩尔至约100毫摩尔磷酸盐缓冲液(含约80毫摩尔磷酸氢二钠，20毫摩尔磷酸二氢钠，1.53摩尔氯化钠)。
[0057]应了解用于任何特定对象的特定剂量视多种因素而定，包括所用DNA疫苗的活性、对象的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、药物组合及进行治疗的特定疾病的严重程度。
[0058]举例而言，本发明的DNA疫苗组合物可以约0.1 μ g至约20mg的剂量向个体施用，例如约0.1 μ g至约5 μ g、约5 μ g至约10 μ g、约10 μ g至约25 μ g、约25 μ g至约50 μ g、约 50 μ g 至约 100 μ g、约 100 μ g 至约 500 μ g、约 500 μ g 至约 lmg、约 Img 至约 2mg,约 2mg至约10mg。
[0059]免疫治疗可包含初始免疫，随后为(例如一次、两次、三次或三次以上)加强免疫。优选地，给所述对象施用两次或更多次包含本发明的DNA疫苗的疫苗组合物，两次施用的间隔为2至4周。优选地，给所述对象施用3次包含本发明的DNA疫苗的疫苗组合物。
[0060]优选地，包含本发明的DNA疫苗的疫苗组合物在对象中引发Gag-特异性的抗HIV细胞免疫应答。这种免疫应答的特点是CyPA特异性增强Gag细胞免疫应答，提高Gag DNA疫苗的免疫原性。且该免疫应答主要侧重于细胞免疫应答，对于体液免疫反应则无显著性提高。无意于受到任何理论的约束，这种增强性的免疫应答被认为是与CyPA与Gag的相互作用有关。例如，CyPA可能促使宿主细胞提呈Gag抗原片段，以达到增强免疫原性的作用。
[0061]通过以下实施例进一步阐述本发明，这些实施例不应视为对本发明的限定。
实施例
[0062]实施例1:构建 pDRVI4.0_gp 1455m 及 pDRVI4.0-gag
[0063]pDRVI4.0是由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建的DNA疫苗载体，其以pDRVISVl.0为模板，运用PCR并结合克隆的方法，删除pDRVISVl.0中非必要序列，构建成功包含扩增复制子ColEl和卡那霉素抗性基因Kan、CMV启动子、CMV启动子上游的72bp单拷贝SV40增强子，BCGpA调节序列等元件的pDRVI4.0质粒(徐智勇，新一代HIV DNA疫苗优化设计及DNA疫苗导入技术的研究，硕士毕业论文)。含有该质粒的大肠杆菌已于2012年9月5日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏号CGMCC N0.6514。pDRVI4.0 的序列如 SEQ ID NO:147 所示。
[0064]通过EcoRV及SalI双酶切pDRVI4.0质粒将其线性化。用EcoRV及SalI双酶切PDRVISV1455M质粒。pDRVISV1455M是在DNA疫苗载体pDRVISVl.0基础上构建携带遗传密码子优化的HIV-1B’ /C重组毒株CN54env基因的质粒，其构建过程已在中国专利申请200810097471.3 (CN101591379A)中公开，含有该质粒的大肠杆菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC N0.2514。回收gpl455m片段(SEQ ID N0:148，其编码SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列)。将gpl455m片段连接进入pDRVI4.0质粒中，即获得pDRVI4.0_gpl455m。
[0065]通过EcoRV及Sail双酶切pDRVI4.0质粒将其线性化。用EcoRV及SalI双酶切pCRScript-gpnef质粒。pCRScript-gpnef是携带遗传密码优化的HIV-1B’ /C重组毒株CN54Gag蛋白的编码序列的质粒，含有该质粒的大肠杆菌保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCN0.1003。回收Gag片段(SEQ ID NO: 149，其编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)。将Gag片段连接进入pDRVI4.0质粒中，即获得pDRVI4.0_Gag。
[0066]实施例2:构建 pDRVI4.0-Mouse CyPA
[0067]1.小鼠树突状细胞原代培养
[0068]选取5周龄C57BL/6雄性小鼠(维通利华实验动物技术有限公司)经颈椎脱位法处死，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPM1-1640培养基(Gibco公司)中4°C，直至所有骨样本收集完毕。剔除股骨、胫骨上的肉，将骨浸泡在70%酒精中2min进行无菌处理，再用预冷的RPM1-1640洗涤2次。用Iml注射器吸取RPM1-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到无菌培养皿中，反复4~6遍。收集培养皿中的骨髓细胞悬液，1200rpm离心IOmin0弃去上清,加入5ml无菌红细胞裂解液(Tris 1.3g、NH4Cl3.55g,用双蒸水定容至终体积为500ml，调pH值至7.2，高压灭菌)，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次1200rpm离心lOmin，弃上清。用RPM1-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基(440ml的RPM1-1640细胞培养液中加入50ml的胎牛血清(Gibco公司)，5ml青霉素/链霉素，5ml谷氨酰氨)悬浮，调整细胞浓度至I X IO6细胞/ml，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4ml，再加入重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(购自R&D公司，货号415-ML-050)至终浓度10ng/ml,白细胞介素4 (IL-4)(购自R&D公司，货号404-ML-050-CF)至终浓度10ng/ml。将细胞培养板放入37°C，含5% C02的孵箱中培养。48小时后轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞，补充加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF。继续培养至第5天，半量换液，并补足rmGM-CSF及IL-4 ;尽量保留悬浮细胞。继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell,BMDC)。用PE标记的CDllc单克隆荧光抗体(eBioscience，货号17-0114-82)标记BMDC，通过流式细胞仪检测BMDC纯度，其纯度达到80%以上。
[0069]2.提取总RNA提取
[0070]参照RNeasy Plus Kit试剂盒(Qiagen公司，货号74134)说明书，提取BMDC的总RNA。
[0071]3.反转录合成cDNA
[0072]参照Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit 试剂盒(Roche 公司，货号05-091-284-001)说明书，进入如下逆转录反应:反应体系1(总体积11.4 μ 1，包含
5.4μ I总RNA，2.0μ I随机引物6聚体及4.0 μ I水)，65°C反应lOmin，立即置于冰上骤冷；配置反应体系 2 (包含 4.0 μ I Transcriptor High Fidelity Reverse TranscriptaseReaction Buffer,0.5 μ I Protector RNase Inhibitor,2.0 μ I dNTp,1.0 μ I DTT,1.1 μ ITranscriptor High Fidelity Reverse Transcriptase);将反应体系 2加入骤冷后的反应体系I中，再置于50°C反应30min，然后85°C反应5min。
[0073]4.PCR扩增小鼠CyPA的编码序列
[0074]扩增引物序列为if 向引物 AAAACTGCAGATGGTCAACCCCACCGTGTTCTTC (SEQ ID NO:14)(下划线为引入的酶切位点 PstI)，反向引物 GCTCTAGATTAGAGCTGTCCACAGTCGGAAATG(SEQ ID NO:15)(下划线为引入的酶切位点XbaI) οδΟμΙ反应体系中加入4.5μ I cDNA。反应条件为 98°C预变性 10min，98°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin，重复 30 个循环，72°C延伸 IOmin0
[0075]5.构建 pDRVI4.0-Mouse CyPA
[0076]通过PstI 及 XbaI (New England BioLabs 公司)双酶切上述 CyPA PCR 产物及pDRVI4.0质粒，分别进行酶切产物的回收(详见QIAquickPCR Purification Kit (货号28104)说明书)，连接转化，挑取阳性克隆即获得pDRVI4.0-Mouse CyPA，其携带小鼠来源的CyPA的编码序列(SEQ ID NO:150，其编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，NCBI参考序列:NM 008907.1)。
[0077]实施例3:构建 pDRVI4.0-Homo CyPA
[0078]1.人CyPA编码序列的合成
[0079]委托金唯智生物科技有限公司合成人CyPA(SEQ ID NO:1，NCBI参考序列:匪021130.3)的编码序列(SEQ ID NO:151)，并在5’端添加PstI酶切位点，3’端添加XbaI酶切位点。通过平末端连接至PUC57质粒中，获得pUC57-Homo CYPA。
`[0080]2.构建 pDRVI4.0-Homo CyPA
[0081]通过PstI 及 XbaI (New England BioLabs 公司)双酶切处理 pUC57_Homo CYPA 及PDRVI4.0质粒，将上述酶切后人CyPA片段及pDRVI4.0进行PCR回收(详见QIAquickPCRPurification Kit (货号 28104)说明书)，连接进入 pDRVI4.0,即得 pDRVI4.0-HomoCyPA(图1)，其携带人来源的CyPA的编码序列。
[0082]实施例4:构建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA 及 pDRVI4.0-gag/Homo CyPAmut
[0083]1.构建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA
[0084]1.1.扩增含有人CyPA的表达盒
[0085]PCR 扩增 pDRVI4.0-Homo CyPA 质粒中的 SV40-CMV-Exon-HomoCyPA-BGHpA 的表达盒，正向引物TATTACTGTGACGTTGAATTCTGGTTGC(SEQ ID NO: 16),反向引物 CCGGAATTCAGATCTGGATCCAACGTCGGTACC (SEQ ID NO:17)(下划线为引入的酶切位点EcoRI)。反应条件为94°C预变性10min，94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min，重复30个循环，72°C延伸lOmin。胶回收上述扩增产物(详见 QIAquick Gel Extraction Kit (货号 28704)说明书)。
[0086]1.2.构建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA
[0087]利用EcoRI (New England BioLabs公司)酶切上述人CyPA表达盒PCR产物及pDRVI4.Ο-gag,回收(详见 QIAquickPCR Purification Kit (货号 28104)说明书)，连接转化，挑选阳性克隆，即得到PDRVI4.0-gag/Homo CyPA (图2)。其包含Gag和Homo CyPA两个表达盒，分别都具有CMV启动子，SV40增强子，Exon及BGHpA调节元件。
[0088]2.构建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPAmut[0089]2.1.对 pDRVI4.0-Homo CyPA 进行突变
[0090]选择人CyPA序列中如下位点进行突变:H54Q/R55A/F60A，正向引物GTTATAAGGGTTCCTGCTTTCAGGCAATTATTCCAGGGGCTATGTGTCAGGGTGG (SRO ID NO: 18)(下划线为突变位点改变后的碱基序列)，反向引物 CCACCCTGACACATAGCCCCTGGAATAATTGCCTGAAAGCAGGAACCCTTATAAC (SEQ ID NO:19)。反应条件为 95°C预变性 lmin，95°C 30s, 55°C lmin，72°C 3.5min，重复18个循环，72°C延伸lOmin。PCR产物直接进行转换，挑取阳性克隆，即得pDRVI4.0-HomoCyPAmut，其携带编码具有H54Q/R55A/F60A突变的人CyPA的核苷酸序列(SEQ ID N0:152,其编码如SEQ ID NO:153所示的人CyPA突变体的氨基酸序列)。
[0091]2.2.扩增含有人CyPAmut的表达盒
[0092]PCR 扩增 pDRVI4.0-Homo CyPAmut 质粒中的 SV40-CMV-Exon-HomoCyPAmut-BGHpA的表达盒，正向引物TATTACTGTGACGTTGAATTCTGGTTGC(SEQ ID NO:20),反向引物ccggaattcAGATCTGGATCCAACGTCGGTACC(SEQ ID NO:21)(下划线为引入的酶切位点EcoRI)。反应条件为 94°C预变性 10min，94°C 30s, 60°C 30s, 720C 2min，重复 30 个循环，72?延伸 lOmin。胶回收上述扩增产物(详见QIAquick Gel Extraction Kit (货号28704)说明书)。
[0093]2.3.构建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA
[0094]利用EcoRI (New England BioLabs公司)酶切上述人CyPAmut表达盒PCR产物及pDRVI4.Ο-gag,回收(详见 QIAquickPCR Purification Kit (货号 28104)说明书)，连接转化，挑选阳性克隆，得到pDRVI4.0-gag/Homo CyPAmut,其包含Gag和Homo CyPAmut两个表达盒，分别都具有CMV启动子，SV40增强子，Exon及BGHpA调节元件。
[0095]实施例5:动物免疫接种方案和免疫应答检测
[0096]1.免疫接种方案
`[0097]方案I
[0098]首先为了验证CyPA的的编码序列佐剂效应，并考虑可能潜在的种属差异性，先构建了含有小鼠CyPA的编码序列的pDRVI4.0-Mouse CyPA质粒。为了验证pDRVI4.0-MouseCyPA特异性针对HIV-1 Gag的反应，构建表达HIV-1 gpl455m的pDRVI4.0_gpl455m作为对照之一。方案I的具体接种情况见表1。
[0099]上述各组均是免疫三针，第0，2，4周免疫，第6周处死老鼠，检测特异性细胞及体液免疫应答。
[0100]表1
【权利要求】
1.一种DNA疫苗，其包含免疫学有效量的编码CyPA的第一多核苷酸和编码HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分别可操纵地连接于启动子，且所述DNA疫苗在接种于人类对象后允许在所述对象中表达所述CyPA和Gag蛋白或所述片段，并由此引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。
2.权利要求1的DNA疫苗，其中所述CyPA包含与SEQID NO:1所示的人CyPA具有至少70%相同性的氨基酸序列。
3.权利要求1的DNA疫苗，其中所述CyPA是来源于灵长类、鼠、牛、节肢动物、鱼类或两栖类动物的CyPA。
4.权利要求3的DNA疫苗，其中所述CyPA包含选自如下一组的氨基酸序列:SEQIDNO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
5.权利要求1的DNA疫苗，其中所述HIV的Gag蛋白来自HIV-1或HIV-2。
6.权利要求5的DNA疫苗，其中所述HIV-1选自以下亚型:A、B、C、D、F、G、H、J、K、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF03_AB、CRF04_cpx、CRF05_DF、CRF06_cpx、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF09_cpx、CRF10_CD、CRFIl_cpx、CRF12_BF、CRF13_cpx、CRF14_BG、CRF15_01B、CRF16_A2D、CRF17_BF、CRFl8_cpx、CRFl9_cpx、CRF20_BG、CRF21_A2D、CRF22_0IAl、CRF23_BG、CRF24_BG、CRF25_cpx、CRF26_AU、CRF27_cpx、CRF28_BF、CRF29_BF、CRF30_0206、CRF31_BC、CRF32_06A1、CRF33_01B、CRF34_01B, CRF35_AD、CRF36_cpx、CRF37_cpx、CRF38_BF、CRF39_BF、CRF40_BF、CRF41_CD、CRF42_BF、CRF43_02G、CRF44_BF、CRF45_cpx、CRF46_BF、CRF47_BF、CRF48_01B、CRF49_cpx、CRF50_A1D、CRF51_01B、CRF52_01B、CRF53_01B 和 CRF54_01B。
7.权利要求1的DNA疫苗，其中所述Gag蛋白包含与SEQID NO:10具有至少80%相同性的氨基酸序列。
8.权利要求7的DNA疫苗，其中所述Gag蛋白包含SEQID NO: 11所示的氨基酸序列。
9.权利要求1的DNA疫苗，其中所述Gag蛋白的免疫原性片段包含SEQID NO:12所示的氨基酸序列。
10.权利要求1的DNA疫苗，其中所述第一多核苷酸和/或第二多核苷酸已经密码子优化，适合于在人类对象中表达。
11.权利要求1的DNA疫苗,其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸由同一表达载体携带。
12.权利要求11的DNA疫苗，其中所述CyPA与HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段被分别表达。
13.权利要求1的DNA疫苗,其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸由不同表达载体携带。
14.权利要求1的DNA疫苗，其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸的比例是大约I: 10至大约10: I。
15.权利要求11的DNA疫苗，其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸的比例是大约I: 10
16.权利要求1的DNA疫苗，其还包含药用可接受的赋形剂。
17.在人类对象中预防或治疗HIV感染的方法，其包括给所述对象施用权利要求1-16中任一项的DNA疫苗，由此在所述对象中引发Gag-特异性的抗HIV免疫应答。
18.权利要求17的方法，其中给所述对象施用两次或更多次所述DNA疫苗，两次施用的间隔为2至4周。
19.权利要求17的方法，其中给所述对象施用3次所述DNA疫苗。
20.权利要求17的方法，其中通过选自肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、淋巴管注射和粘膜免疫的一或多种途径给所述对象施用所述DNA疫苗。
21.权利要求17的方法， 其中所述Gag-特异性的抗HIV免疫应答是细胞免疫应答。
【文档编号】A61K39/21GK103656675SQ201210341820
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2012年9月7日
【发明者】邵一鸣, 侯爵, 刘颖 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心