脂肪组织祖细胞在预防或治疗肝炎中的应用的制作方法

脂肪组织祖细胞在预防或治疗肝炎中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及脂肪组织祖细胞在预防或治疗肝炎中的应用。具体地，脂肪组织祖细胞(即SVF)这类脂肪组织有核细胞具有极其优异的预防或治疗肝炎(尤其是乙型肝炎)的作用。给需要的对象施用本发明的药物组合物，对于肝炎(尤其是乙型肝炎)有显著的预防或治疗作用，可以使多种表面抗原或抗体的定量下降，肝炎病毒DNA显著减少，并减低AST和ALT，促进了肝功能的修复。本发明还提供了一种预防和治疗肝炎的方法。
【专利说明】脂肪组织祖细胞在预防或治疗肝炎中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞及生物医药领域。具体地，本发明涉及脂肪组织祖细胞在预防或治疗肝炎中的应用。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎是世界上特别是我国的一种主要的疾病，其发病凶险，进展迅速，大部分患者预后不良，并且迅速出现大面积肝细胞坏死，从而导致肝功能严重受损，肝脏代谢、排泄和解毒的功能也有减退。乙型肝炎可以导致机体免疫能力下降，因此形成了恶性循环。
[0003]目前临床上针对乙型肝炎的治疗手段主要是血浆置换和肝移植，血浆置换费用庞大且危险性高，肝移植由于供体缺乏，很多患者在等待移植供体期间死亡。因此，及时有效的肝功能支持和促进肝细胞再生是帮助肝功能衰竭患者无需肝移植而自行恢复的重要医疗手段。
[0004]干细胞治疗是指将干细胞或由其分化产生的功能细胞植入病变部位以代偿病变细胞丧失的功能，或将细胞经体外遗传技术操作后用于疾病治疗的方法。自肝细胞移植治疗技术发展以来，治疗细胞从最初的同种异体成熟肝细胞，发展到异种肝细胞、胎肝细胞、肝干细胞、骨髓干细胞、脐血干细胞和胚胎干细胞。其中肝内的干细胞因取材困难、分离培养复杂而难以广泛应用；胎肝细胞和胚胎干细胞由于胚胎的来源涉及伦理学等问题，被限制应用。
[0005]脂肪组织通常被认为是贮存能量及内分泌器官，是软组织填充和吸脂处理的必要组织。同时还被认为是成体干细胞的有效来源，因为脂肪组织含有多种的祖细胞，可分化为多种谱系。脂肪组织中主要包含脂肪细胞、ASCs、血管内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及细胞外基质争SCs被认为是一种表现脂肪细胞和血管细胞的祖细膨目，它位于脂肪细胞之间、血管周围或细胞外基质中，可促进脂肪组织的转归。
[0006]脂肪组织中的祖细胞(SVF)含有非常复杂的细胞成分，包括内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞、成纤维细胞、前脂肪细胞和分化潜能确定的其它前体细胞等，这类脂肪组织中的有核细胞经培养可获得可塑性极强的脂肪组织来源的间充质干细胞。但脂肪组织的转归是一个很漫长的过程，成年人平均每年大约有10%左右的脂肪细胞被更新，而ASCs又存在于脂肪组织的间质血管碎片中。
[0007]目前本领域还没有一种有效的治疗肝炎的方法，因此迫切需要开发经济有效地预防或治疗肝炎的方法。

【发明内容】

[0008]本发明的目的就是提供脂肪组织祖细胞在治疗乙肝中的应用。
[0009]在本发明的第一方面，提供了一种脂肪组织祖细胞的用途，它被用于制备预防和/或治疗肝炎的药物组合物。
[0010]在另一优选例中，所述的肝炎选自下组:病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、或其组合。
[0011]在另一优选例中，所述的病毒性肝炎选自下组:甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝。
[0012]在另一优选例中，所述的肝炎为乙肝。
[0013]在另一优选例中，所述的脂肪组织祖细胞具有选自下组的任一或多种特征:
[0014]⑴30%以上的细胞具有表面抗原⑶29 ； [0015](ii)50%以上的细胞具有表面抗原⑶73 ；
[0016](iii)90%以上的细胞具有表面抗原⑶49d ；
[0017](iv)60%以上的细胞具有表面抗原⑶90。
[0018]在另一优选例中，35%以上的细胞具有表面抗原⑶29。
[0019]在另一优选例中，55%以上的细胞具有表面抗原⑶73。
[0020]在另一优选例中，92%以上的细胞具有表面抗原⑶49d。
[0021]在另一优选例中，65%以上的细胞具有表面抗原⑶90。
[0022]在另一优选例中，所述的脂肪组织祖细胞具有选自下组的任一或多种特征:
[0023](V) 85%以下的细胞具有表面抗原⑶34 ；
[0024](vi) 15%以下的细胞具有表面抗原⑶45。
[0025]在另一优选例中，80%以下的细胞具有表面抗原⑶34。
[0026]在另一优选例中，12%以下的细胞具有表面抗原⑶45。
[0027]在另一优选例中，所述的脂肪组织祖细胞分泌选自下组的细胞因子:干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人转化生长因子β (TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其
任意组合。
[0028]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的干细胞生长因子(HGF)的浓度≥0.5ng/ml ο
[0029]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的浓度≥35pg/ml,较佳地≥40pg/mL.[0030]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的人转化生长因子β (TGF-β)的浓度^ 150pg/ml,较佳地 > 180pg/ml。
[0031]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的白介素-2(IL_2)的浓度≥15pg/ml，较佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml。
[0032]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的浓度≥15pg/ml，较佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml,最佳地≥40pg/ml。
[0033]在本发明的第二方面，提供了一种用于预防和/或治疗肝炎的药物组合物，所述的药物组合物包括:有效量的脂肪组织祖细胞，以及药学上可接受的载体。
[0034]在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
[0035]在另一优选例中，所述的药物组合物为皮下注射试剂。
[0036]在另一优选例中，所述的皮下注射试剂中脂肪组织祖细胞的浓度为0.1-100X104个/ml，较佳地为1-10 X IO4个/ml，更佳地为2-5 X IO5个/ml。
[0037]在本发明的第三方面，提供了一种预防和/或治疗肝炎的方法，包括步骤:给需要的对象施用脂肪组织祖细胞、或含有脂肪组织祖细胞的药物组合物。
[0038]在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。
[0039]在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为鼠、兔、牛、羊、猪等。
[0040]在另 一优选例中，所述方法包括步骤:给需要的对象静脉回输所述的脂肪组织祖细胞，或含有脂肪组织祖细胞的药物组合物。
[0041]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】

【附图说明】
[0042]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0043]图1显示了用流式细胞仪法对制备的脂肪组织祖细胞进行表面抗原标记表达的分析结果。
【具体实施方式】
[0044]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，脂肪组织祖细胞具有极其优异的预防或治疗肝炎(尤其是乙型肝炎)的作用。具体地，给需要的对象施用本发明的含有脂肪组织祖细胞的药物组合物，对于肝炎有显著的预防或治疗作用，可以使多种表面抗原下降，病毒DNA显著减少，并减低ALT，促进肝功能的修复。本发明还提供了一种预防和治疗肝炎的方法以及含有脂肪组织祖细胞的药物组合物。在此基础上完成了本发明。
[0045]术语
[0046]如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95%以上“指≥95%, “0.2%以下”指≤0.2%。
[0047]肝炎
[0048]如本文所用，术语“肝炎”任选自下组:病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、或其组合。本发明所述的肝炎优选为病毒性肝炎，病毒性肝炎可以选自下组:甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝。
[0049]在本发明中，所述的肝炎优选为乙肝。
[0050]脂肪
[0051]自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织，包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。
[0052]在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。
[0053]脂肪组织祖细胞
[0054]间质血管碎片(SVF,Stromal Vascular fraction)
[0055]如本文所用，术语“脂肪组织祖细胞”、“ SVF “、“脂肪组织有核细胞”或“间质血管碎片”可以互换使用。
[0056]脂肪组织祖细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。脂肪组织祖细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，它取材容易、体内储备量大、适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。脂肪组织祖细胞是干细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化，从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片。间质血管碎片中含有丰富的间充质细胞，可分化为多种谱系的细胞，是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞，
[0057]本领域的技术人员能够使用通用的方法进行脂肪组织祖细胞的分离和纯化。
[0058]如本文所用，术语“分离方法”、“本发明方发明方法”、“脂肪组织祖细胞的分离方法”可以互换使用，都指从原始的脂肪组织中获得分离的脂肪组织祖细胞的方法和过程。对于获得的脂肪组织祖细胞的脂肪细胞材料，首先进行洗涤，除去血细胞；脂肪破碎，消化；去除未消化的组织，获得含脂肪组织祖细胞的滤液；离心得到脂肪组织祖细胞。得到的脂肪组织祖细胞可以用于进一步传代、培养或冻存。[0059]在一个优选的实施例中，分离脂肪组织祖细胞可以包括步骤(但不限于):将吸脂后的脂肪用PBS反复冲洗两次，然后在37°C条件下用胶原酶消化30min，1200g离心IOmin后即获得高密度的SVF碎片，其中主要包括间质细胞、血管内皮细胞和壁细胞。另外，脂肪组织祖细胞中也包括一些血管来源的细胞，如白细胞和红细胞等，各种细胞之间具有协同效应。
[0060]脂肪组织祖细胞的抗原检测
[0061]用本发明使用的脂肪组织祖细胞具有很高的纯度，基本上不含有其他类型的细胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。
[0062]脂肪组织祖细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有⑶3、⑶13、D29、⑶34、⑶45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 等。
[0063]⑶34抗原是一种高度糖基化I型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.2%，更佳地，≤0.2%。
[0064]⑶45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有⑶45的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为< 0.1%。
[0065]⑶29、⑶73、⑶49d、⑶90等主要存在于脂肪间充质干细胞表面。
[0066]带有⑶29的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为> 30%,更佳地> 32%，最佳地≥35%。
[0067]带有⑶73的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为> 50%,更佳地> 60%,最佳地≥70%ο
[0068]带有⑶49d的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为> 85%，更佳地> 90%,最佳地≥ 95%。
[0069]带有⑶90的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为> 55%，更佳地> 60%,最佳地≥65%。
[0070]本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪组织祖细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人,美国专利N0.4，946，778);或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。
[0071]脂肪组织祖细胞的细胞分泌因子的检测
[0072]本发明的脂肪组织祖细胞能分泌多种细胞因子，如干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人转化生长因子β (TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)等。本领域的普通技术人员可以使用常规方法对分泌的细胞因子进行检测。如使用常规的ELISA法。
[0073]本发明使用的所述的脂肪组织祖细胞分泌选自下组的细胞因子:干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人转化生长因子β (TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其组合。
[0074]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的干细胞生长因子(HGF)的浓度≥0.5ng/ml ο
[0075]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的浓度≥35pg/ml,较佳地≥40pg/mL.[0076]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的人转化生长因子β (TGF-β)的浓度≥150pg/ml,较佳地 ≥ 180pg/ml。
[0077]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的白介素-2(IL_2)的浓度≥15pg/ml，较佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml。
[0078]在另一优选例中，脂肪组织祖细胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的浓度≥15pg/ml,较佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml,最佳地≥40pg/ml。
[0079]药物组合物
[0080]本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的脂肪组织祖细胞，以及药学上可接受的载体。
[0081]通常，可将脂肪组织祖细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为7-8。
[0082]如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0083]如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0084]本发明的药物组合物含有安全有效量的脂肪组织祖细胞以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
[0085]本发明所述脂肪组织祖细胞的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
[0086]本发明的药物组合物优选为皮下注射试剂。在另一优选例中，所述的皮下注射试剂中脂肪组织祖细胞的浓度为0.1-100X 104个/ml，较佳地为1-10X IO4个/ml，更佳地为2X IO5 个/ml。
[0087]本发明的主要优点:
[0088](I)脂肪组织祖细 胞对于肝炎(特别是乙肝)有显著的预防或治疗作用；
[0089](2)脂肪组织祖细胞使乙肝细胞多种表面抗原下降，病毒DNA显著减少，并减低谷丙转氨酶ALT ；
[0090](3)脂肪组织祖细胞可以促进肝功能的修复。
[0091]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0092]实验试剂及耗材
[0093]无菌手术器械及耗材
[0094]无菌长柄手术镊子、无菌100微米滤网、灭菌40微米滤网、离心管
[0095]无菌试剂
[0096]DMEM (无血清培养基)
[0097]I型胶原酶(现配现用):(λ 1%胶原酶I配制方法:称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培养基中，用之前37°C预热。
[0098]氯化钠注射液
[0099]实施例1
[0100]脂肪组织祖细胞的分离
[0101]1.接收脂肪组织
[0102]用75%的酒精擦拭无菌的接收脂肪组织的采集瓶外壁；无菌针管从人体吸取深层脂肪组织，Ih内将其移至接收容器内。
[0103]2.分装脂肪组织
[0104]每一 50ml离心管分装脂肪组织20ml，IOml移液管于脂肪采集瓶吸取下层红色液体，弃掉，将剩余的上层脂肪混匀后进行分装。
[0105]3.洗涤脂肪组织
[0106]洗涤脂肪组织，除去血细胞。向离心管中加入20ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。
[0107]4.胶原酶I消化
[0108]加入等量新配制的预热(提前半小时于37°C的振荡培养箱预热)的胶原酶I溶液，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5~10秒，置于振荡培养箱中，370C，IOOrpm,消化40分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5~10秒，直到组织看起来较为平滑。
[0109]5.分离脂肪组织祖细胞(SVF)[0110]将消化后的组织用无菌100目滤网分装到50ml的离心管中，室温1500rpm离心5分钟，得到的沉淀即为脂肪组织祖细胞。
[0111]6.净化沉淀
[0112]离心后，脂肪组织祖细胞沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意:在脂肪组织祖细胞沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温1500rpm离心5分钟。45ml生理盐水悬浮细胞，，再次室温1500rpm离心5分钟，离心后加IOml生理盐水悬浮。再经过40目筛过滤后得到细胞混合液。
[0113]实施例2
[0114]脂肪组织祖细胞的鉴定
[0115]1.脂肪组织祖细胞的流式检测
[0116]通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为I X IO5HiL-1，800r/min(120g)，离心5min，弃掉上清，用4°C的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800r/min,离心5min,之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至ImL,加入抗体5~10 μ L，避光，冰上放置30min。用D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2~3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约200至300 μ L的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测。
[0117]脂肪组织祖细胞的流式检测结果见表1。
[0118]表1
[0119]
【权利要求】
1.一种脂肪组织祖细胞的用途，其特征在于，它被用于制备预防和/或治疗肝炎的药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝炎选自下组:病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、或其组合。
3.如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪组织祖细胞具有选自下组的任一或多种特征: (i)30%以上的细胞具有表面抗原⑶29 ； (?)50%以上的细胞具有表面抗原⑶73 ； (iii)90%以上的细胞具有表面抗原⑶49d； (iv)60%以上的细胞具有表面抗原⑶90。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪组织祖细胞具有选自下组的任一或多种特征: (V) 85%以下的细胞具有表面抗原CD34 ； (vi) 15%以下的细胞具有表面抗原⑶45。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪组织祖细胞分泌选自下组的细胞因子:干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人转化生长因子β (TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其任意组合。
6.一种用于预防和/或治疗肝炎的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括:有效量的脂肪组织祖细胞，以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为皮下注射试剂。
8.一种预防和/或治疗肝炎的方法，其特征在于，包括步骤:给需要的对象施用脂肪组织祖细胞、或施用含有脂肪组织祖细胞的药物组合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的对象为人或非人哺乳动物。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括步骤:给需要的对象静脉回输所述的脂肪组织祖细胞，或含有脂肪组织祖细胞的药物组合物。
【文档编号】A61K39/00GK103655614SQ201210350363
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月19日 优先权日:2012年9月19日
【发明者】曹卫, 吕伟麟, 赵彬彬, 卡尤姆, 黄国涛 申请人:臻景生物技术（上海）有限公司, 臻景生物技术（无锡）有限公司