具有aaagugc种子序列的微小rna在制备白介素8抑制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种具有AAAGUGC种子序列的微小RNA在制备白介素8（interleukin8,IL8）抑制剂中的应用。具有AAAGUGC种子序列的微小RNA能够直接靶向IL8mRNA的3’非编码区，有效抑制IL8的分泌，减少细胞内源性IL8的产生。因此，具有AAAGUGC种子序列的微小RNA可作为内源性IL8生成抑制剂用于预防或治疗因IL8产生或增高所致的各种疾病或疾病状态。
【专利说明】具有AAAGUGC种子序列的微小RNA在制备白介素8抑制剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有AAAGUGC种子序列的微小RNA的新用途，尤其是一种具有AAAGUGC种子序列的微小RNA在制备白介素8抑制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]浸润和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因。1971年，Folkman等研究发现:肿瘤血管生成是肿瘤迅速生长、侵袭和转移的关键，其为肿瘤细胞输送所需的氧气和其他养分。目前研究认为与肿瘤血管新生有关的分子很多，包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(I3DGF)、转化生长因子β (TGFP )、白介素8 (interleukin 8，IL8)等，其中，VEGF及其受体已经成为肿瘤研究的热点课题和抗肿瘤生物治疗的一个重要靶点，为肿瘤的临床治疗提供了新的治疗途径和有效药物，是肿瘤治疗理论上的一个重大突破。
[0003]趋化因子(chemokines)是指能吸引细胞向一定方向移行的小分子分泌性蛋白质，是细胞因子超家族的成员，其中IL8是最早发现的趋化因子。在体内，IL8的细胞来源较为广泛，生理或病理的多种细胞刺激因素均可引发细胞IL8的表达，其中，脂多糖/内毒素(LPS)、白介素1β (ILli3)、肿瘤坏死因子a (TNF_a)等炎性信号可刺激组织中的单核、巨噬细胞产生IL8，缺氧、化疗药物、应激等可刺激许多肿瘤细胞及肿瘤微环境的细胞包括基质细胞(血管内皮细胞、成纤维细胞等)和肿瘤浸润的白细胞等产生IL8，植物血凝素(PHA)、佛波酯(TPA或PMA)等诱导剂也可诱导IL8的产生，雌激素、雄激素、地塞米松等类固醇激素亦可影响IL8产生。此外，许多疾病状态，其中在恶化和/或造成该疾病中涉及趋化因子IL8的过度表达。IL8与表达其受体的细胞特异性结合后，通过激活丝苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶(PTK)及Rho-鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPases)及其相关的信号传导通路，通过调节多种基因及蛋白的表达发挥其生物学作用。IL8对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T淋巴细胞有趋化作用，同时对中性粒细胞还有激活作用，可诱导其脱颗粒、呼吸爆发等，对入侵的病原体发挥吞噬杀伤和清除作用，在炎症反应中发挥重要作用。IL8与表达其受体的肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞特异性结合后，可影响内皮细胞的血管形成及内皮细胞和肿瘤细胞的增殖和生存，并在肿瘤局部还有促进肿瘤细胞、内皮细胞及肿瘤浸润中性粒细胞移动的作用。亦有研究发现，化疗药物及应激等引起的IL8反应可能与肿瘤细胞的化疗耐药有关。因此，IL8的表达与肿瘤血管形成、肿瘤发生与转移等密切相关。目前研究证实，趋化因子介导的疾病很多，包括:内毒素性休克、感染性休克、缺血再灌注损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、血管生成等。近年研究发现，内皮细胞、角质形成细胞、甚至肿瘤细胞等也可产生IL8，通过促进肿瘤血管形成等影响肿瘤细胞的增殖、存活及运动，在肿瘤发生、侵袭和转移中发挥重要的作用。因此，阻断IL8的生物学作用有望成为新的肿瘤治疗策略和手段。
[0004]众所周知，IL8的生物学作用是通过IL8与其受体CXCRl (IL8RA)、CXCR2 (IL8RB)特异性结合并启动一系列胞内信号级联反应实现的。参与这些环节中的任一因素出现异常都会影响信号转导过程的正常进行并影响最终的效应，其中，IL8与其受体的数量和功能是决定信号转导起始的关键。当然，信号转导过程的异常是否引起细胞功能的异常或疾病，还要受细胞和机体代偿调节功能的影响。目前临床对感染性疾病的治疗，除了应用抗生素和激素外，主要着眼于趋化因子的作用。细胞因子抑制剂治疗炎症性疾病主要为单克隆抗体、天然受体拮抗剂等，IL8及其受体衍生物或抑制物已成为临床研究的热点。人们已经制备并发明了多种IL8抑制剂，如抗IL8的单克隆抗体、IL8受体拮抗剂等，希望通过利用能与IL8特异性结合的抗IL8单克隆抗体或能与IL8受体CXCRl和/或CXCR2特异性结合的受体拮抗剂来阻断IL8与其受体的相互作用，从而达到预防或治疗由趋化因子IL8介导的疾病或疾病状态的目的。但至今为止，人们对能抑制细胞产生内源性IL8的抑制剂研究较少。
[0005]微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一类长度为19-25核苷酸(nt)的内源性单链非编码RNA，普遍存在于真核生物中。目前，miRNA的生物合成过程已被初步阐明:首先，核
基因组中miRNA基因在RNA聚合酶Π的作用下转录出具有帽子结构、多聚腺苷酸尾、并有
莖一环结构的初始miRNA(pr1-miRNA),后者被RNase III Drosha及其辅助因子Pasha /DGCB8构成的复合体剪切成长度约70nt的莖环状前体miRNA (pre-miRNA), pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5的作用下由核转到胞质中；然后，一种叫Dicer的核酶在反向激活的RNA结合蛋白(trans-activating region RNA- bindingprotein, TRBP)和AG02的协助下识别前体miRNA双链的5'末端磷酸及3'末端突出，在RNA聚合酶III的参与下，在茎干的两个螺旋转弯处切成21~25 nt长的双链miRNA(miRNA: miRNA*)，随后双链miRNA在解旋酶(helicase)的作用下，最终形成成熟的单链miRNA (多数为miRNA，miRNA*通常被降解)并进入核蛋白复合体并参与形成RNA诱导的沉默复合体(miRNA-assoc iated RNA-1nduced silencing complex, miRISC)。成熟体 miRNA可与靶基因信使RNA (mRNA)的3’-非编码区(3’-UTR)完全或不完全互补结合，诱导靶基因mRNA降解和/或抑制靶基因的翻译，在转录后水平调控靶基因的表达，从而发挥其生物学功能。目前，许多证据表明miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程中发挥重要的调节作用，参与人体大约30%的基因调节，并与肿瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊乱及代谢紊乱等多种疾病有关。
[0006]一般来说，microRNA 5’ -端的2~8个碱基可与靶基因完全配对，这一段序列被称之为microRNA的种子(seed)序列。具有“AAAGUGC”种子序列的人microRNAs,包括miR-17、miR_20ab、miR_106ab、miR_519d、miR-93 等，其序列分别由以下核苷酸组成:
hsa-miR-17 (MIMAT0000070)的序列为:
5’ -CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.1)
hsa-miR-20a (MIMAT0 000075)的序列为:
5’ -UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.2)
hsa-miR-106a (MIMAT0000103)的序列为:
5’ -AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.3)
hsa-miR-519d (MIMAT0002853)的序列为:
5’ -CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG-3’，(SEQ ID N0.4)hsa-miR-93 (MIMAT0000093)的序列为:
5’ -CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.5)
目前，虽然关于微小RNA (包括具有AAAGUGC种子序列的微小RNA)的研究报道很多，但迄今为止还没有关于具有AAAGUGC种子序列的微小RNA在制备白介素8抑制剂中应用的相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明是发现了具有AAAGUGC种子序列的微小RNA可以与白介素8基因mRNA的3’非编码区(3，UTR)593~600位置的GCACUUU (A)完全互补结合，即具有AAAGUGC种子序列的微小RNA可以直接靶向IL8 mRNA的3’非编码区，调控IL8的表达，从而发明了一种具有AAAGUGC种子序列的微小RNA在制备趋化因子白介素8 (interleukin 8，IL8)抑制剂中的应用。
[0008]将本发明所述的具有AAAGUGC种子序列的微小RNA如miR-17、miR-20a、miR-106a的模拟物转染恶性肿瘤细胞如膀胱癌细胞T24及诱导分化处理的白血病细胞NB4，miR-17、miR-20a、miR-106a的模拟物均能减少细胞内源性IL8的分泌，表明具有AAAGUGC种子序列的微小RNA可作为细胞内源性IL8生成抑制剂在制备趋化因子白介素8抑制剂中应用。
[0009]本发明所述的具有AAAGUGC种子序列的微小RNA能够减少细胞内源性IL8的产生，可用于预防或治疗因IL8产生或增高所致的各种疾病或疾病状态，如炎症、内毒素性休克、感染性休克、缺血再灌注损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、血管生成及某些恶性肿瘤等，其中，尤其用于预防或治疗某些能自分泌IL8的恶性肿瘤及在抗肿瘤治疗如化疗或应激等状态下IL8表达或产生增多的恶性肿瘤。`【具体实施方式】
[0010]实施例1:
1.1L8是miR-17的直接靶基因
首先，本发明通过在线microRNA靶基因分析软件分析了 IL8 mRNA 3’ UTR上可能存在的microRNA结合位点，结果发现:IL8 mRNA 3’ UTR中只包含I个miR-17的结合位点，位于593-600处，并且该结合位点在脊椎动物中具有广泛保守性。然后，构建了包含miR-17结合位点的IL8的3’ UTR报告基因载体以及将上述结合位点突变的3’ UTR的报告基因载体。具体实验方法如下:
a.以NB4细胞的基因组DNA为模板，使用IL8 mRNA 3’ UTR的特异性引物IL8-3’UTR-F/R (序列见下)扩增了 960-bp大小的截短的IL8 mRNA 3’ UTR，其中包含miR-17的结合位点。扩增IL8 mRNA 3’ UTR的引物序列如下:
IL8-3’ UTR-F:TATTGTGTGGGTCTGTTGTA (SEQ ID N0.6)
IL8-3’ UTR-R:TATTGACTGTGGAGTTTTGG (SEQ ID N0.7),扩增片段长 960bp。
[0011]b.将a步骤所得的野生型IL8 mRNA 3’ UTR片段(960_bp)定向构建到荧光素酶报告基因载体PS1-CHECK中的荧光素酶基因编码区下游3’ UTR的多克隆酶切位点。为了进一步验证miR-17是否通过该结合位点结合到IL8 mRNA 3’ UTR进而抑制IL8基因的表达，利用定点突变的技术，将miR-17的结合位点2，4，6和8位碱基进行突变。IL8 mRNA3’ UTR保守位点的定点突变带入引物序列为:
IL8-3’ UTR-mutant-F:
GTTGTGAGGACATGTGGAACCTCATAAAGTTTTTTCATCATAAC (SEQ ID N0.8)
IL8-3’ UTR-mutant-R:
GTTATGATGAAAAAACTTTATGAGGTTCCACATGTCCTCACAAC (SEQ ID N0.9)c.为了分析miR-17是否可以直接作用于IL8基因mRNA 3’ UTR并抑制IL8基因的表达，将构建的IL8 mRNA 3’ UTR报告基因及其突变体分别与miR-17模拟物和阴性对照模拟物共转染，检测报告基因的表达情况，进而分析miR-17对IL8 mRNA 3’ UTR靶向情况。其中,miR-17模拟物和阴性对照模拟物(negative control, NC)均由RNA双链构成,其序列分别为:
MiR-17模拟物:
正义链:CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG (SEQ ID N0.10)
反义链:ACCUGCACUGUAAGCACUUUGUU (SEQ ID N0.11)
阴性对照(negative control, NC)模拟物:
正义链:UUCUCCGAAAGUGUCACGUTT (SEQ ID N0.12)
反义链:ACGUGACACGUUCGGAGAATT (SEQ ID N0.13)
具体方法如下:转染前一天，24孔细胞培养板每孔接种2.0 X IO5个293T细胞，培养液体积为每孔500μ1。20小时后待细胞融合度达85~90%时进行转染。先用50μ1的OPT1-MEM稀释IOOng野生型或者突变形式的IL8 mRNA 3’UTR报告基因载体和IOOnmol miR-17模拟物或对照模拟物，然后再用50μ1的OPT1-MEM稀释1.44μ1的Iipofectamine 2000,用枪头轻轻混匀，室温静置5分钟。将稀释的Iipofectamine 2000吸出加入到稀释的质粒和RNA中，轻轻用枪头混匀，室温静置20分钟。然后将制备好的复合物轻轻滴入到每孔培养液中，动作要轻柔，以免造成293Τ细胞与培养孔底脱离。加好复合物后，再将24孔细胞培养板轻柔的前后左右震荡混匀。转染24小时后，收获细胞进行报告基因分析。将细胞培养板孔中培养液弃去，在每孔中加入500μ1的预冷PBS;再弃去PBS，每孔加入120μ1平衡到室温的IX裂解液。将24孔细胞培养板置于摇床上震荡15分钟，然后将孔中的裂解液全部吸出转移到1.5 ml离心管中，4 °C，12 000 g离心2分钟，取出5μ1上清于新的离心管中，并加入45μ1的IX裂解液，将上清稀释10倍。上机检测时，在试管中加入40 μ? LAR底物，加入5μ1稀释的上清，立即置于荧光检测仪，读取荧光素酶的荧光值。然后在同一管中加入40μ1 Stop & Glo液,立即置于荧光检测仪,读取海胆荧光素酶荧光值。计算每一个样品的海胆荧光素酶的荧光值与荧光素酶的荧光值的比值，从而对每一个样品的荧光值进行标准化，即可用来表示每个样品的荧光强度。检测结果发现:当miR-17模拟物和野生型IL8 mRNA的3’ UTR报告基因载体共转染时，与阴性对照模拟物相t匕，miR-17模拟物可以显著抑制荧光素酶活性；而miR-17模拟物和突变形式的IL8 mRNA3’ UTR报告基因载体共转染后，荧光素酶的活性明显回复(见表1)，说明IL8 mRNA 3’ UTR保守位点是miR-17结合的位点。
[0012]表1:miR-17模拟物对IL8 3’ UTR靶向作用的报告基因分析
-丨野生型IL83’ UTR 丨突变型IL83’ UTR
【权利要求】
1.一种具有AAAGUGC种子 序列的微小RNA在制备白介素8抑制剂中的应用。
【文档编号】A61P19/02GK103656676SQ201210350242
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月20日 优先权日:2012年9月20日
【发明者】李传刚, 李墨林 申请人:大连医科大学