专利名称：一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物及提取方法
技术领域：
本发明涉及ー类中药提取物，特别是涉及用于ー类抑制体外糖基化产物生成中药提取物及提取方法和应用。
背景技术：
糖尿病在中医学上属于“消渴证”范畴。糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症，其大血管病变性质为动脉粥样硬化，主要累及主动脉、冠状动脉等大血管，而糖尿病的微血管病变是糖尿病特有的慢性血管并发症，主要表现为视网膜、肾等微血管病变。临床统计表明，40% — 50%的糖尿病患者在发病10年后发生视网膜病变；约有2%的患者在发病15年后完全失明；5% 10%的患者在发病20年后恶化成终末期肾病。虽然糖尿病肾病发生发 展的确切病理机制目前尚不十分详尽，主要有非酶糖化学说、多元醇通路学说、蛋白激酶C激活学说、氧化应激等。但比较公认的假说是在长期高血糖状态下，葡萄糖分子可与体内蛋白质发生非酶糖基化反应，形成不可逆的强活性物质ー晚期糖基化终产物(AGEs)的結果。AGEs的生成是正常体内存在的ー种自然化学反应，即氨基酸和还原糖生成稳定的Amadori产物，这一反应由Maillard在1912年首次发现，称为Maillard反应。Maillard反应发生在体外或体内蛋白质等物质的氨基与糖的醛基上，不需酶的催化，但是ー个极为复杂的过程。首先蛋白质分子和糖类发生缩合反应，生成不稳定的薛夫碱(Shiff bases)，而后薛夫碱可发生分子内的重排而生成较为稳定的阿马多里(Amadori)重排产物。上述两步反应均为可逆性反应，生成的产物称为早期糖基化产物。此后该产物缓慢地经过一系列脱水、氧化及化学重排，产生高度活性的羰基化合物，如3-脱氧葡萄糖酮醒(3-deoxyglucosone, 3-DG),进而与蛋白质的自由氨基起反应，凝聚形成不可逆的终末产物，称之为晚期糖基化终产物(AGEs)。中医认为内热是消渴病发生发展的始动因素，进ー步可以伤阴导致肾阴虚，最后阴损及阳，而成阴阳俱虚之证。阴虚热盛贯穿糖尿病肾病的始末，尤多见于糖尿病肾病重症患者。而糖尿病肾病的西医病因病机研究发现AGEs是导致糖尿病肾病变的主要病因，AGEs的直接损伤作用以及通过RAGE信号通路引起的肾脏病变是糖尿病肾病发生发展的主要病理基础。故寻找药物直接抑制中医认为的“内热”物质基础——AGEs的生成是控制糖尿病血管病变的有效途径。
发明内容
发明目的本发明的目的在于提供ー类抑制体外糖基化产物生成中药提取物及提取方法和应用。技术方案ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于该中药提取物为生地2份和山茱萸I份的分煎水提物、合煎水提物、水提含药血清或水提醇沉有效部位。所述的ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于分煎水提物的提取方法，包括以下步骤各取生地2份、山茱萸I份，每次按4-12倍量加入蒸馏水后，分别提取2-4次，分别浓缩，按生地山茱萸=2 1混合均匀，得生地山茱萸分煎水提物。所述的ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于合煎水提物的提取方法，包括以下步骤取生地、山茱萸药材以2 1的比例混合均匀，加入8-12倍量蒸馏水后，反复提取2 4次，提取l_2h，合并提取液、浓缩，得生地山茱萸合煎水提物。所述的ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于，生地、山茱萸分煎和合煎水提液的含药血清提取方法，首先制备生地山茱萸分煎和合煎水提物；然后，选取SD大鼠，将生地山茱萸分煎和合煎水提物给大鼠灌胃，连续给药5-7天后，禁食，于末次给药1-2小时后取血，3000rpm离心10_20min，分离血清，于56°C水浴中灭活补体20_40min，经0.22 μ m微孔滤器除菌，-20°C保存备用，即得生地、山茱萸分煎和合煎水提物含药血清。所述的ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于生地水提醇沉有效部位的提取方法，包括以下步骤将生地粉碎，毎次4-10倍量水提l_2h，合并提取液，カロ70%こ醇醇沉，静置过滤得上清液和醇沉物，上清液挥至无醇味，上大孔树脂，用蒸馏水洗 脱，得寡糖部位；上清液继续用30%こ醇洗脱，收集醇洗脱液，得环烯醚帖苷部位；醇沉物加蒸馏水溶解，离心后取上清液，并挥至无醇味，得多糖部位。所述的ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于山茱萸水提醇沉有效部位的提取方法，包括以下步骤将山茱萸粉碎，毎次4-10倍量水提l_2h，合并提取液，加70%こ醇醇沉，上清液挥至无醇味，上大孔树脂，用10%こ醇洗脱，得环烯醚帖苷部位；醇沉物加水溶解，离心去除不溶物，得多糖部位；将水提药渣按I :6加入95%こ醇，85°C，提取2次后干燥得干浸膏，将干浸膏用10%Na0H洗涤，再用等倍量的酸性水溶液沉淀得三萜酸浸膏。所述的ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于，生地和山茱萸水提醇沉有效部位正交组合方法，包括以下步骤生地、山茱萸有效部位配伍将生地环烯醚萜苷(A)、寡糖(B)、多糖(C)和山茱萸环烯醚萜苷(D)、多糖(E)、三萜酸(F)共六个组分各按O、等效量、两倍量3个水平，用正交设计L18 (37)进行配伍组合。所述的ー类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于用HPLC法或UV法测定各有效部位含量，得生地环烯醚萜苷部位中梓醇含量为I. 91%，寡糖部位中水苏糖含量为26. 01%,多糖纯度为68. 52% ;山茱萸环烯醚萜苷部位中两苷含量为44. 8%，多糖纯度为65. 8%，三萜酸中两酸含量为20. 89%ο所述的中药提取物在制备抑制体外糖基化产物生成的药物中的应用。本发明生地和山茱萸药材分别为玄參科多年生草本植物地黄Rehmanniaglutinosa Libosch.的干燥的块根和山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. etZucc.的干燥成熟果肉。生地，为治疗糖尿病的“四大圣药”之一，现代研究表明生地的化学成分主要有环烯醚萜苷、糖类和氨基酸，药理研究表明生地具有改善造血功能、促进血管内皮细胞増殖、提高免疫、降血糖、保护肾脏、抗衰老及益智等。生地梓醇对四氧嘧啶致糖尿病小鼠有显著的降血糖作用、改善糖耐量、提高血清HDL-C含量、降低血清TC和TG水平；生地寡糖对链脲佐菌素和肾上腺素糖尿病模型均显示出降糖作用[17]，井能改善高脂糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用。山茱萸，现代化学研究表明山茱萸药效成分主要有环烯醚萜苷、三萜酸和多糖。其中环烯醚職苷具有降血糖、抗血小板聚集和抗血栓等作用；多糖具有抗氧化、抗衰老等作用；三萜酸具有抗炎、降脂、降血糖和抗癌作用。山茱萸こ酸こ酯提取部位、正丁醇提取部位、こ醇提取液具有降低血糖和升高胰岛素的水平。生地，味甘寒，归心、干、肾经，滋补肝肾，清热凉血；山茱萸，味酸涩微温，归肝，肾经，补益肝肾，涩精固脱。两药配伍，可以加强补益肝肾之功能，共奏滋肝肾而清虚热。前期的整体动物实验研究也发现，生地-山茱萸(2
I)配伍给药能改善糖尿病大鼠血糖水平、抑制蛋白尿、控制血脂、減少尿糖代谢，研究还发现药对能维持NO-ET与TXA2-PGI2平衡，心肌嗜酸变性、空泡变及肥大程度減少，胸主动脉内膜增厚程度降低，表明药对有保护血管、改善器质性病变；同时对肾皮质中AGEs也表现为较好的抑制效果。本发明中生地和山茱萸有效部位成分含量检测方法分别如下
I 生地I)环烯醚萜苷部位中梓醇采用HPLC測定生地环烯醚萜苷部位中梓醇的含量，色谱条件こ腈-O. 1%磷酸水(I 99)为流动相，检测波长210nm，柱温为30°C，流速为 O. 8mL · min-1, Venusil MP-C18 柱(4. 6_X 150mm, 5 μ m)。结果梓醇基线分离良好，进样量在O. 3^1. 8 μ g范围内，其峰面积与梓醇含量呈良好的线性关系，回归方程y=283. 61x-4. 84，相关系数r=0. 9998，方法学考察良好，结果为1.91%。见图I。2)多糖部位中多糖苯酚-硫酸法测定多糖含量。结果测得多糖含量为68. 52%。3)寡糖部位水苏糖用HPLC方法来測定生地寡糖部位中水苏糖的含量，色谱条件ZJ青-水(70 :30)为流动相，柱温为室温，流速为ImL · min-1, Lichrospher-NH2柱(4. 6mmX 150mm, 5 μ m),结果为 26. 01%。见图 2。2山茱萸I)环烯醚萜苷部位中马钱苷和莫诺苷的含量采用HPLC法測定。条件为色谱柱LichrospHer C18 柱(4. 6mmX 150mm, 5 μ m);流动相こ臆-水(10 90);流速 ImL · min-Ι ；进样量10 μ L ;柱温30°C ;检测波长240nm。两苷总量为44. 8%。见图3。2)多糖部位中多糖利用苯酚-硫酸法測定多糖含量，测得多糖含量为65.8%。3)三萜酸中齐墩果酸和熊果酸的含量采用ELSD法測定，条件为色谱柱weIchrom-C18 柱(250mmX4. 6mm, 5 μ m);流动相Me0H_l%NH4AC(85 :15);漂移管温度 90°C，气流2. 4L/min ;柱温30°C ;流速0. 8ml/min ;进样量20μ I。两酸含量为20. 89%。见图4。本发明药物提取物对体外抑制糖基化产物生成作用明显，以生地和山茱萸有效部位为例，试验方法如下200Μ的葡萄糖与牛血清白蛋白组成反应系统，再分别加入生地有效部位(环烯醚萜苷、寡糖、多糖)、山茱萸有效部位(环烯醚萜苷、多糖、三萜酸)，使其终浓度为1、0.5、0. I、O. 05、0. 01、0. 005和O. OOlg/し用氨基胍作阳性对照。同时另设其他对照(1)不加有效部位完整的非酶糖化系统；(2)不加有效部位不含Glu的系统；(3)不加有效部位不含白蛋白的系统；(4)加有效部位不含白蛋白的糖化系统；(5)加有效部位不含Glu的系统。37°C温孵2周后于530nm处测定早期糖化蛋白(果糖胺)；37°C温孵4周后于激发波长360nm，发射波长460nm处测定AGEs的荧光度值(F)。结果显示，生地寡糖部位、山茱萸环烯醚萜苷部位对果糖胺抑制作用较强，而生地环烯醚萜苷部位和生地多糖部位对AGEs的抑制作用较强。见图5、6。
本发明的有益效果1、同时对生地、山茱萸两味药材的有效部位进行了较为系统的提取分离，并对其中成分进行含量測定；2、利用体外糖基化生成模型，较为系统地对生地、山茱萸及其配伍水提液，生地、山茱萸有效部位及其配伍；对生地、山茱萸共六个有效部位进行配伍组合，进而确定其抑制糖基化产物的最佳配伍比。因此本发明提供的新的药物制备提取物可作为有效抑制体外糖基化产物生成的药物。
图I梓醇对照品及样品色谱图(A对照品；B样品)图2水苏糖对照品及样品色谱图(A对照品；B样品)图3对照品及样品色谱图(A马钱苷对照品；B马钱苷样品；C莫诺苷对照品；D莫诺苷样品)图4对照品及样品色谱图(A-1齐墩果酸对照品；A-2熊果酸对照品；B_1齐墩果酸 样品；B-2熊果酸样品)
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例I药物分煎水提液的提取エ艺步骤生地水提液将生地500g粉碎后过40目筛，进行3次提取，第一次加入10倍量水，提取2h，过滤得提取液I ;第二次在药渣中加入6倍量水，提取lh，得提取液II ;第三次在药渣中加入4倍量水，提取Ih，得提取液III，合并各次提取液，浓缩至I. 5g生药/mL ;山茱萸水提液山茱萸药材250g加12倍量的水提取2次，每次2小时，合并提取液，浓缩至1.5g生药/mL，将上述浓缩的生地、山茱萸提取液按2 :1的比例混合均匀即得。实施例2药物合煎水提液的提取エ艺步骤称取生地500g、山茱萸250g混合均匀粉碎，过40目筛，进行3次提取。第一次加入10倍量水，提取2h，过滤得提取液I ;第二次在药渣中加入6倍量水，提取lh，得提取液
II;第三次在药渣中加入4倍量水，提取lh，得提取液III，合并各次提取液。实施例3生地有效部位的提取エ艺流程将生地400g粉碎后过40目筛，进行3次提取。第一次加入10倍量水，提取2h，过滤得提取液I ;第二次在药渣中加入6倍量水，提取lh，得提取液II ;第三次在药渣中加入4倍量水，提取lh，得提取液III，合并各次提取液，浓缩至Ig生药/mL，加醇至浓度为70%醇沉，静置24h，过滤得上清液和醇沉物。寡糖将上清液挥至无醇味，并定容至O. 5g生药/mL，上大孔树脂，用蒸馏水洗脱，洗至Molish反应为阴性，收集水洗脱液，浓缩，喷雾干燥，得寡糖粉末48. 54g，得率为12. 14%。环烯醚萜苷将上述的上清液再用30%こ醇洗脱，流速为I. 8BV/h (lmL/min)收集醇洗脱液，浓缩喷雾干燥，得环烯醚萜苷粉末4. 52g，得率为I. 13%。多糖将醇沉滤饼加蒸馏水溶解(滤饼相当于山茱萸药材量)，加水至多糖浓度为O. 25g生药/mL，离心(IOmin, 5000rpm)，去除不溶物，上清液挥至无醇味，喷雾干燥，得多糖粉末129. 31g，得率为32. 33%。实施例4山茱萸有效部位的提取エ艺流程山茱萸药材300g加12倍量的水提取2次，每次2小时，合并提取液，浓缩至Ig生药/mL，加醇至浓度为70%醇沉，静置24小吋，过滤得上清液和醇沉物。环烯醚萜苷将上清液挥至无醇味，并定容至O. 5g生药/mL，上大孔树脂，用蒸馏水洗脱，洗至Molish反应为阴性，弃去水洗脱液；用10%こ醇洗脱，流速为I. 8BV/h (lmL/min)收集醇洗脱液，浓缩喷雾干燥，得环烯醚萜苷粉末5. 62g，得率为I. 87%。多糖将醇沉滤饼加蒸馏水溶解(滤饼相当于山茱萸药材量)，加水至多糖浓度为O. 25g生药/mL，离心(IOmin, 5000rpm)，去除不溶物，上清液挥至无醇味，喷雾干燥，得多糖粉末34g，得率为11.33%。
三萜酸将水提后药渣浙干，按I :6 (溶剂未水提之前的药材质量)95%こ醇在850C，提取2. 5h和I. 5h各一次，旋转蒸发除去溶剂，真空干燥得干浸膏。将干浸膏加40倍量无水こ醇溶解，离心(IOmin, 5000rpm)，去除不溶物，上清液用10%Na0H调节溶液pH值为14,水浴加热IOmin,离心去除不溶物(IOmin, 5000rpm),上清液先用5%HC1酸化至pH为3,再用等体积PH为3的盐酸水溶液沉淀，静置后离心(IOmin, 5000rpm),所得沉淀水洗后蒸干，得三萜酸I. 41g，得率为O. 47%。实施例5生地、山茱萸分煎水提液和合煎水提液抑制体外糖基化产物生成按实施例I和2方法制备生地、山茱萸分煎水提液和合煎水提液。体外牛血清白蛋白糖化系统取葡萄糖终浓度为200mmol/L，牛血清白蛋白终浓度40g/L，分别加入生地山茱萸分煎水提液和生地山茱萸合煎水提液，该反应系统用3mmol/LNaN3防腐。用氨基胍作阳性对照。同时另设其他对照(I)不加水提液完整的非酶糖化系统；(2)不加水提液不含Glu的系统；(3)不加水提液不含白蛋白的系统；(4)加有水提液不含白蛋白的糖化系统；(5)加有水提液不含Glu的系统。早期糖化蛋白(果糖胺)的测定反应系统于37°C温孵2周后，取反应液12. 5 μ L，加10%NBT lmL, 37°C孵育15min后用15%こ酸25 μ L和冷浴终止反应，然后于530nm处比色。计算对果糖胺抑制率。糖化终末产物(AGEs)的测定反应系统于37°C温孵4周后，于激发波长360nm，发射波长460nm处测定AGEs的荧光度值(F)。计算对AGEs抑制率。表I生地、山茱萸对早期糖化蛋白(果糖胺)的影响(n=3)
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幻.4"I )44.3_ 4r^-5130.713.1(11)44表2生地、山茱萸对晚期糖基化产物(AGEs)的影响(η=3)
权利要求
1.一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于该中药提取物为生地2份和山茱萸I份的分煎水提物、合煎水提物、水提含药血清或水提醇沉有效部位。
2.根据权利要求I所述的一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于分煎水提物的提取方法，包括以下步骤各取生地2份、山茱萸I份，每次按4-12倍量加入蒸馏水后，分别提取2-4次，分别浓缩，按生地山茱萸=2 1混合均匀，得生地山茱萸分煎水提物。
3.根据权利要求I所述的一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于合煎水提物的提取方法，包括以下步骤取生地、山茱萸药材以2 1的比例混合均匀，加入8-12倍量蒸馏水后，反复提取2 4次，提取l-2h，合并提取液、浓缩，得生地山茱萸合煎水提物。
4.根据权利要求I所述的一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于，生地、山茱萸分煎和合煎水提液的含药血清提取方法，首先制备生地山茱萸分煎和合煎水提物；然后，选取SD大鼠，将生地山茱萸分煎和合煎水提物分别给大鼠灌胃，连续给药5-7天后，禁食，于末次给药1-2小时后取血，3000rpm离心10_20min，分离血清，于56°C水浴中灭活补体20-40min，经0. 22 y m微孔滤器除菌，_20°C保存备用，即得生地、山茱萸分煎和合煎水提物含药血清。
5.根据权利要求I所述的一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于生地水提醇沉有效部位的提取方法，包括以下步骤将生地粉碎，每次4-10倍量水提l-2h，合并提取液，加70%乙醇醇沉，静置过滤得上清液和醇沉物，上清液挥至无醇味，上大孔树脂，用蒸馏水洗脱，得寡糖部位；上清液继续用30%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，得环烯醚帖苷部位；醇沉物加蒸馏水溶解，离心后取上清液，并挥至无醇味，得多糖部位。
6.根据权利要求I所述的一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于山茱萸水提醇沉有效部位的提取方法，包括以下步骤将山茱萸粉碎，每次4-10倍量水提l_2h，合并提取液，加70%乙醇醇沉，上清液挥至无醇味，上大孔树脂，用10%乙醇洗脱，得环烯醚帖苷部位；醇沉物加水溶解，离心去除不溶物，得多糖部位；将水提药渣按I :6加入95%乙醇，85°C，提取2次后干燥得干浸膏，将干浸膏用10%Na0H洗涤，再用等倍量的酸性水溶液沉淀得三萜酸浸膏。
7.根据权利要求5、6所述的一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于，生地和山茱萸水提醇沉有效部位正交组合方法，包括以下步骤生地、山茱萸有效部位配伍将生地环烯醚萜苷(A)、寡糖(B)、多糖(C)和山茱萸环烯醚萜苷(D)、多糖(E)、三萜酸(F)共六个组分各按O、等效量、两倍量3个水平，用正交设计L18 (37)进行配伍组合。
8.根据权利要求5、6所述的一类抑制体外糖基化产物生成的中药提取物，其特征在于用HPLC法或UV法测定各有效部位含量，得生地环烯醚萜苷部位中梓醇含量为I. 91%，寡糖部位中水苏糖含量为26. 01%，多糖纯度为68. 52% ;山茱萸环烯醚萜苷部位中两苷含量为44. 8%，多糖纯度为65. 8%，三萜酸中两酸含量为20. 89%。
9.如权利要求I所述的中药提取物在制备抑制体外糖基化产物生成的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一类中药提取物，该提取物分为生地山茱萸分煎水提液水提物，生地山茱萸合煎水提液水提物，生地、山茱萸分煎和合煎水提液物含药血清，生地有效部位——环烯醚帖苷、寡糖、多糖与山茱萸有效部位——环烯醚帖苷、多糖、三萜酸，及6个有效部位的正交配伍组合。其中有效部位含量分别为生地环烯醚萜苷部位中梓醇含量为1.91%，多糖纯度为68.52%；山茱萸环烯醚萜苷部位中两苷含量为44.8%等。以体外AGEs生成模型为研究对象，对该类中药提取物进行较为系统的筛选研究，结果表明，该类中药提取物可显著抑制体外糖基化产物——果糖胺(前期)和AGEs(晚期)的生成，因此本发明为中医临床应用生地、山茱萸治疗糖尿病肾病等血管病变提供实验依据。
文档编号A61P9/14GK102824463SQ20121035781
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者许惠琴, 赵晓莉, 赵腾斐, 狄留庆, 农伟虎, 吕高虹, 崔小兵 申请人:南京中医药大学