专利名称：一种重组脊髓灰质炎病毒Ⅰ型病毒样颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的制备方法，特别涉及利用经过密码子优化的脊髓灰质炎病毒I型Pl基因和3ABC基因，通过酵母表达系统制备重组脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的方法。
背景技术：
脊髓灰质炎作为一种疾病，两百多年前已有文字记载，1789年Underwood首次对该病进行了描述[Underwood M. A Treatise of Children with General Directionsforanagement of Infants from Birth, 2nd ed. London:Matthews; 1789.]。从 1948 年开始，人类开始不断确定不同脊髓灰质炎病毒株的数量，小儿麻痹症国家基金委员会1951年报道了只有3型脊灰病毒可以引起脊灰，根据血清型分别命名为I、II、III型[CommitteeonTyping of the National Foundation for Infantile Paralysis.Immunologic classification ofpoliomyelitis viruses:a cooperative program for the typing ofone hundred strains. Am JHyg 54:191-274,1951]。脊髓灰质炎病毒的三种抗原类型(血清I、IIJII型)除了免疫原型不同外，其他方面都非常类似。每型的基因组序列都已完全确定，包括3种Sabin 口服脊灰疫苗株。对于脊髓灰质炎病毒来说，只有蛋白质外壳的编码序列是独特的，因为在自然循环中，侧面的序列经常会通过与相近的肠道病毒(肠道病毒C种)重组而发生变化。脊髓灰质炎病毒普遍存在、传染性高并具有季节性(温带气候国家更明显)，未免疫人群中几乎所有人均可感染脊髓灰质炎病毒，脊髓灰质炎病毒感染者中少数人(小于1%)可出现麻痹症状，如顿挫型、非麻痹型和麻痹型脊髓灰质炎，也可引起无菌性脑膜炎。I型脊髓灰质炎病毒在3种型中最具神经侵袭性，多数脊灰流行及地方性流行病例都是由I型脊髓灰质炎病毒引起的，其次为III型和II型。传播高峰发生在婴儿和小年龄儿童(热带地区)及学龄儿童(温带地区)。脊髓灰质炎是人传人疾病，通过粪-口、口- 口途径传播，少数情况通过共同媒介(如水、牛奶)传播。其感染性主要在麻痹出现前及出现后f 2周，因此其传染期可能达41周，家庭易感者或其接触者的继发感染率很高(可能因为粪-口传播)，大于 90%。脊髓灰质炎病毒属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae ),肠道病毒属(Enterovirus)。其毒粒为球形正二十面体立体对称,直径约为27_30nm,无包膜,其核衣壳包含单股正链RNA基因组，约由7500个核苷酸组成。其组成从5’端到3’端的方向依次为5’端非编码区，Pl区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。Pl区编码病毒的主要结构蛋白，即衣壳蛋白，其转录及翻译产物经蛋白酶水解后，最终得到4个蛋白产物，分别为VP4(1A)，VP2(1B), VP3 (IC)及VP4 (ID)，其衣壳结构由60个亚单位片段组成，每个片段由4种衣壳蛋白(从VPl到VP4)组成。脊髓灰质炎病毒主要的中和抗原位点位于VP1，VP2和VP3上，通过中和单克隆抗体反应模式已经确定了 4个中和抗原的位点，这样的定位已经被高分辨率X涉嫌晶体学所证实。
脊髓灰质炎可注射灭活疫苗(IPV)或口服减毒活疫苗(OPV)预防，尽管有两种非常有效的疫苗可以使用，脊髓灰质炎在世界范围内仍然是重要公共卫生问题。单价OPV可以克服一些三价OPV的局限性，包括3型Sabin株之间的相互干扰。因为三价OPV中II型组分比其他组分有明显较强的免疫原型，受种者通常II型血清首先发生阳转。相反，单价疫苗可以根据规划需求得到所要求的型特异性免疫应答。在发展中国家和发达国家单价OPV均表现出比三价OPV有较强的诱导型特异性免疫应答的免疫原型性。与OPV相关的主要不良反应是VAPP，其发生率是每100万OPV服疫苗中少于O. 3个病例，即< O. 3/100万剂；年平均VAPP的发病率为每100万人口发生O. 14例。免疫缺陷人群发生VAPP的风险性最高，几乎所有病例均发生在先天性或获得性免疫缺陷患者中。最近，一个带有历史因素的安全性问题被提出，与OPV—样，IPV中也含有猴病毒(SV40)，来自疫苗早期生产和使用过程中的原代恒河猴肾细胞[Butel JS, Lednicky JA. Cell and molecularbiology of simian virus 40: implications forhuman infections and disease. J NatlCanceer Inst 91:119-134,1999]。研究表明，SV40可以使培养的细胞发 生转化，并可导致动物产生肿瘤[Dang-Tan T, Mahmud SM, PuntoniR, Franco EL. Polio vaccines, SimianVirus 40, and human cancer: the epideminologicevidence for a causal association.Oncogene 23:6535-6540, 2004]。根据报道，接受IPV免疫的全身性红斑狼疮病人中约有6%发病。病毒样颗粒在形态上和真实的病毒类似，并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以病毒样颗粒为抗病毒预防性疫苗的开发提供了理想的备选方案。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的制备方法具体可包括如下步骤I)将脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因和3ABC基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2)用步骤I)得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述Pl基因和所述3ABC基因的重组酵母细胞；3)裂解步骤2)得到的重组酵母细胞，分离得到重组的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒。上述步骤I)中，所述Pl基因和所述3ABC基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型脊髓灰质炎病毒I型Pl蛋白和野生型脊髓灰质炎病毒I型3ABC蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型脊髓灰质炎病毒I型Pl基因和脊髓灰质炎病毒I型3ABC基因的密码子替换为酵母细胞偏好(高频使用)的密码子。所述优化还包括对Pl基因序列和3ABC基因序列的其他改造，以适合在酵母细胞中表达。本发明中使用的术语“偏好的密码子”具有本领域公知的含义,也称为密码子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。在本发明的一个实施例中，上述步骤I)中所述Pl基因(经过密码子优化的基因，命名为Polio I PlY)的核苷酸序列为序列表中序列I所示；所述3ABC基因(经过密码子优化的基因，命名为Polio I 3ABCY)的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。上述步骤2)中，所述目的酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述目的酵母细胞具体为酿酒酵母INVSCl。所述Pl基因和所述3ABC基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述Pl基因的启动子方向和驱动所述3ABC基因的启动子方向相反。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为将所述Pl基因和所述3ABC基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处得到的重组质粒，具体可将所述Pl基因插入到所述pESC-URA的多克隆位点I (MCS1/FLAG)的SpeI和Pac I之间，将所述3ABC基因插入到所述pESC-URA的多克隆 位点2 (MCS2/myc)的BamH I和Xho I之间，得到的重组质粒。利用本发明所提供的方法制备得到的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因和3ABC基因。本发明所提供的密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因(Polio I PlY)的核苷酸序列为序列表中序列I所示；本发明所提供的密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的3ABC基因(Polio I 3ABCY)的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。其中，序列I由2646个核苷酸组成，为优化后脊髓灰质炎病毒I型Pl基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列5所示的蛋白，序列5由881个氨基酸组成；序列2由882个核苷酸组成，为优化后的脊髓灰质炎病毒I型3ABC基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列6所示的蛋白，序列6由293个氨基酸组成。含有上述密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体可为将所述Pl基因和所述3ABC基因分别插入到pESC-URA质粒的两个多克隆位点处，得到的重组质粒。所述重组菌可为携带有上述密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因的重组酵母细胞。所述酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述酵母细胞具体为酿酒酵母INVSCl。所述表达盒由能够启动所述密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因表达的启动子，所述密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因，以及转录终止子组成。在本发明的一个实施例中，所述启动子具体为酿酒酵母GALl和GAL10启动子，当然也可以使用其他公知的酵母启动子的任何一种，如GAL7、ADHU ADH3和PGK启动子，或者其他真核基因启动子。在本发明的一个实施例中，所述转录终止子具体为ADHl和CYCl终止子。上述密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因在制备下述a)或b)中的应用也属于本发明的保护范围a)脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒；b)以脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。本发明还涉及并提供了在重组宿主细胞中同时表达Polio I Pl蛋白和3ABC蛋白的方法，该方法包括(I)将含有编码PoliO I Pl蛋白和3ABC蛋白的编码基因的重组表达载体导入重组宿主细胞，如重组的酵母细胞(酿酒酵母INVSCl )。(2)在允许所述的PolioI Pl蛋白和3ABC蛋白同时表达的条件下培养重组宿主细胞，如重组的酵母细胞(酿酒酵母 INVSCl)。本发明对野生型的脊髓灰质炎病毒I型(Poliovirus I，Polio I )的Pl基因或3ABC基因进行了酵母细胞偏好型密码子优化。在本发明中，Polio I Pl蛋白和Polio I 3ABC蛋白在酵母细胞中同时表达，Polio I 3ABC蛋白对Polio I Pl蛋白进行酶切后得到VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白(3ABC是3C的前体，由3ABC蛋白产生的3C蛋白为一种蛋白酶，可将Pl蛋白水解为VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白)。这四种结构蛋白··进而自行组装成脊髓灰质炎病毒I型的病毒样颗粒(Polio I VLPs)。实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统(酿酒酵母INVSC1)中成功的制备了Polio I VLPs，本发明对Pl基因和3ABC基因的密码子优化提高了Polio I VLPs在酵母表达系统中的产量。所述Polio I VLPs可以用于制备基于VLP的Polio I单价预防性疫苗。
图I为pESC-3ABCY质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bpDNAMarker ;泳道B为pESC-URA质粒对照；泳道C为pESC_3ABCY质粒。图2为pESC-3ABCY质粒的BamH I及Xho I酶切鉴定结果。其中，用泳道A和泳道B为pESC-3ABCY质粒的BamHI及Xho I酶切鉴定结果；泳道C为15000bp DNAMarker0图3为PESC-P1Y-3ABCY质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bpDNAMarker ;泳道B为pESC_3ABCY质粒对照；泳道C为pESC_PlY_3ABCY质粒。图4为PESC-P1Y-3ABCY质粒的Spe I及Pac I酶切鉴定结果。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker ;泳道 B 为 pESC_PlY_3ABCY 质粒的 Spe I 及 Pac I 酶切鉴定结果。图5为Western Blot鉴定重组Polio I衣壳蛋白的表达。其中，泳道A为蛋白分子量对照；泳道B为INVSCl/pESC-PlY-3ABCY蛋白提取物；泳道C为Polio I阳性对照蛋白样品。图6为通过透射电镜技术显现的Polio I病毒样颗粒(VLPs)的代表样品(实验组待测样品)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例UPolio I Pl基因和Polio I 3ABC基因的密码子优化及全基因合成以下按分步骤详细描述Polio I Pl基因和Polio I 3ABC基因的密码子优化及全基因合成的流程。UPolio I Pl基因和Polio I 3ABC基因的密码子优化根据野生型Polio I Pl基因序列(如序列表中序列3所示，该基因命名为Polio I PlW)和野生型Polio I 3ABC基因序列(如序列表中序列4所示，该基因命名为Polio I 3ABCW)，经过设计和反复验证得到适合于在酵母细胞中表达的优化型Polio IPl基因序列和优化型Polio I 3ABC基因序列，即将Polio I病毒的Pl基因序列和3ABC基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成含有如Sharp PM等(Sharp PM, CoweE.Synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae. Yeast, 1991, 7(7):657-678.)所描述的酵母优选密码子的优化序列，从而提高Polio I Pl蛋白和Polio I 3ABC蛋白在酵母细胞培养环境中的表达水平。根据上述方法，最终获得按酵母密码子偏好设计的优化型Polio I Pl基因和Polio I 3ABC基因，分别命名为Polio I PlY和Polio I 3ABCY，其基因序列分别为序列 表中序列I和序列2。Polio I PlY基因(序列I)编码的蛋白与序列3所示野生型Polio IPl基因编码的蛋白一致，均为序列表中序列5所不氣基酸序列组成的蛋白；Polio I 3ABCY基因(序列2)编码的蛋白与序列4所示野生型Polio I 3ABC基因编码的蛋白一致，均为序列表中序列6所示氨基酸序列组成的蛋白。2、密码子优化型Polio I Pl基因和Polio I 3ABC基因的全基因合成使用序列重叠延伸PCR法全基因合成Polio I PlY和Polio I 3ABCY，具体方法如下根据优化PoliO I PlY和Polio I 3ABCY的基因序列合成多条IOObp的上下游片段，两片段间3’端互补重叠15bp，所述上下游片段互为模板、引物进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒回收扩增片段，再以此相邻的回收片段互为引物、模板进行下一轮PCR扩增，得到拼接序列，再以相邻拼接序列互为模板、引物进行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互为模板、引物进行PCR拼接，依此类推最终合成全长的密码子优化型Polio I Pl基因和 Polio I 3ABC 基因，即 Polio I PlY 和 Polio I 3ABCY。实施例2、携带Polio I PlY和Polio I 3ABCY的酵母重组表达载体的构建I、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备从37°C培养16 20h的新鲜平板上挑取DH5a单菌落(Takara公司，产品目录号为D9057S)，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜(12 16h)。次日从上述培养物中吸取O. 5ml按体积比1:100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的0D600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4°C条件下,4000rpm离心IOmin,弃上清,将管倒置Imin,使残留培养液流尽，以IOml用冰预冷的IOOmM的CaCl2溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4°C, 4000rpm离心lOmin,弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15%甘油的IOOmM的CaCl2溶液重悬细菌沉淀，分装成200 μ I每管，_80°C保存备用。2、pESC-URA 质粒的转化用无菌吸头分别吸取I μ g pESC-URA质粒(一种具有双向启动子的酵母表达质粒，购自Angilent technologies，产品目录号为217454)加入200 μ I上述步骤I制备的DH5 α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却I 2min。每管加入800 μ I不含抗生素的LB培养基(蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素购自北京欣经科公司，NaCl购自国药化学试剂有限公司)，将管转移至37°C摇床上，温育45min (转速<150rpm)。取50 μ I已转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的LB平板表面，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37°C培养12 16h。3、pESC-URA质粒的小量制备挑取经上述步骤2转化培养所得的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜。将培养物移入I. 5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30_60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100 μ I预冷的溶液I (终浓度为50mmol/L的葡萄糖，终浓度为25mmol/L的Tris-HCl，终浓度为10mmol/L的EDTA，pH8. O)重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200 μ I新鲜配制的溶液II (终浓度为O. 2mol/L的NaOH，终浓度为质量百分含量1%的SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150 μ I预冷的溶液IIK配制IOOml溶液III 5mol/L KAc 60ml,冰乙酸 11. 5ml,水 28. 5ml)温和混勻，冰浴 lOmin, 12000rpm 离心lOmin，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉 淀30min, 12000rpm离心lOmin,弃上清,沉淀用70%乙醇洗一次,室温晾干后,用30 μ I含RNaseA (100μ g/ml)的 TE (pH 8. 0)溶解沉淀，37°C水浴 3(T60min 后置 _20°C保存备用。4、酵母重组表达载体pESC-3ABCY的构建将实施例I得到的Polio I 3ABCY基因克隆到pESC-URA质粒的多克隆位点2(MCS2/myc)的BamH I和XhoI之间，得到酵母重组表达载体pESC_3ABCY。具体按照如下步骤进行I)将实施例I得到的Polio I 3ABCY基因(如序列表中序列2所示)的5’端和3’端分别引入限制性内切酶BamHI和Xho I (限制性内切酶BamHI及Xho I购自大连宝生物工程有限公司)的酶切位点。具体操作如下以实施例I得到的Polio I 3ABCY基因(如序列表中序列2所示)为模板，用如下引物进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶BamH I和Xho I酶切位点的Polio I 3ABCY基因片段上游引物为5，_CGGGATCCACCATGGGTCCATTGCAATATAAA-3’ (下划线处为限制性内切酶BamHI酶切位点的序列，该序列的第 12-32 位为序列 2 的第 1-21 位)；下游引物为 5’ -CCGCTCGAGTTATTGAGATTGAGTAAAATA-3’(下划线处为限制性内切酶XhoI酶切位点的序列，其后的序列为序列2的第862-882位的反向互补序列)。2)使用限制性内切酶BamHI和Xho I酶切上述步骤3制备的pESC-URA质粒，回收骨架载体(大片段，由于小片段大小仅约为45bp，琼脂糖凝胶电泳时经常无法显示)与经同样酶切的Polio I 3ABCY基因片段按摩尔比I :5的比例混合，依次加入10XT4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶(T4DNA连接酶及10 X T4DNA连接酶缓冲液购自大连宝生物工程有限公司)，反应体积为20μ 1，16°C连接过夜，取IOy I连接反应产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到4ml含相应抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒(图I)。并用内切酶BamH I和Xho I对重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，得到大小约为6600bp和900bp的两个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有Polio I 3ABCY基因的重组质粒命名为pESC-3ABCY。5、酵母重组表达载体PESC-P1Y-3ABCY的构建
将实施例I制备的所述Polio I PlY基因克隆到上述步骤4制备的酵母重组表达载体PESC-3ABCY的多克隆位点I (即为pESC-URA质粒的多克隆位点1，MCSI/FLAG)的SpeI和Pac I之间，得到酵母重组表达载体PESC_P1Y_3ABCY。具体按照如下步骤进行I)将实施例I得到的Polio I PlY基因(如序列表中序列I所示)的5’端和3’端分别引入限制性内切酶Spe I和Pac I (限制性内切酶Spe I及Pac I购自纽英伦生物技术北京有限公司)的酶切位点。具体操作如下以实施例I得到的Polio I PlY基因(如序列表中序列I所示)为模板，用如下引物进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶Spe I和Pac I酶切位点的Polio I PlY基因片段上游引物为5’ -GGACTAGIACCATGGGTGCTCAAGTTTCTTC-3’(下划线处为限制性内切酶Spe I酶切位点的序列，该序列的第 12-31 位为序列 I 的第 1-20 位);下游引物为 5’ -CCTTAATTAAGGTTAATAAGTAGTCAAATCT-3’(下划线处为限制性内切酶Pac I酶切位点的序列，该序列的第13-31位为序列I的第 2628-2646位的反向互补序列)。2)使用限制性内切酶SpeI和Pac I酶切上述步骤4制备的酵母重组表达载体PESC-3ABCY，回收骨架载体(大片段)与经同样酶切的Polio I PlY基因片段按摩尔比I :5的比例混合(DNA Marker和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司)，依次加入10XT4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为20 μ 1，16°C连接过夜，取10 μ I连接反应产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到4ml含相应抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒(图3)。并用内切酶SpeI和Pac I对重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图4所示，得到大小约为7500bp和2600bp的两个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有Polio I PlY基因的重组质粒命名为PESC-P1Y-3ABCY。酵母重组表达载体PESC_P1Y_3ABCY中，启动所述Polio I PlY基因转录的启动子为酿酒酵母GALlO启动子，转录终止子为ADHl终止子；启动所述Polio I 3ABCY基因转录的启动子为酿酒酵母GALl启动子，转录终止子为CYCl终止子。实施例3、重组Polio I病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化I、酿酒酵母感受态细胞的制备在酿酒酵母平板中挑取单克隆菌落INVSc KSaccharomyces cerevisiae,产品目录号C81000，购自Invitrogen)接种于IOml YPD培养液(购自北京欣经科公司)中，30°C振摇培养16h，取合适体积的培养物加入IOml YB)培养液中混匀，使其0D600值为O. 4，30°C振摇培养6h后0D600值为O. 9,将培养物转入50ml无菌的离心管中，室温1500rpm离心5min,弃上清，用 IOml Sc EasyComp transformation kit (购自 Invitrogen)中的溶液 I (试剂盒自带)重悬沉淀，室温1500rpm离心5min,小心弃上清,用Iml溶液II (试剂盒自带)重悬沉淀，50 μ I/管分装灭菌的I. 5ml离心管中，置_70°C保存。2、酵母重组表达载体PESC-P1Y-3ABCY转化酵母感受态细胞将4μ I实施例2制备的酵母重组表达载体PESC-P1Y-3ABCY加入到上述步骤I制备的酵母INVSCl感受态细胞中，加入500 μ I Sc EasyComp transformation kit (购自Invitrogen)中的溶液III，在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀，得到DNA/酵母混合物。将DNA/酵母混合物置30°C水浴中孵育lh，每隔15min在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀。取100 μ I涂布URA选择平板(选择性培养液(Ura-) YNB 6. 7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，如制平板加入20g琼脂粉，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50°C，加入IOOml无菌的20% (w/v)葡萄糖)，置30°C孵箱中倒置培养2_4天。随机挑取5个单克隆菌落接种于IOml URA选择培养液中，30°C振摇培养16h，离心收集酵母细胞。将经过上述鉴定表明成功转入重组表达载体PESC-P1Y-3ABCY的酵母INVSCl细胞命名为INVSCl/PESC-P1Y-3ABCY。同时设置转入pESC-URA空载体的酵母INVSCl细胞的对照，将该酵母细胞命名为INVSCl/pESC-URA ;设置转入PESC-P1W_3ABCW载体的酵母INVSCl细胞的对照，将该酵母细胞命名为 INVSCl/pESC-PlW-3ABCW (pESC_PlW_3ABCW 载体与 pESC_PlY_3ABCY 载体相比，将其Polio I PlY基因替换为Polio I PlW基因，将Polio I 3ABCY基因替换为Polio I 3ABCW 基因)。3、重组Polio I病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化
I)重组Polio I病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达将经过上述步骤2获得的INVSCl/pESC-PlY-3ABCY (实验组)、INVSCl/pESC-Plff-3ABCff (野生型对照组)和 INVSCl/pESC-URA (空载体对照组)接种于50ml URA选择培养液(选择性培养液(Ura_) YNB 6. 7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50°C,加入IOOml无菌的20% (w/v)葡萄糖)中，30°C振摇培养16h,取合适体积的培养液接种于500ml URA选择培养液中，使0D600值为O. 4，30°C振摇培养4h，取合适体积的培养液接种3LURA诱导培养液(YNB 6. Ig,酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g,溶于800ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50°C,加入IOOml无菌的20% (w/V)半乳糖和IOOml无菌的20%(w/v)麦芽糖)，使0D600值为0. 4，30°C振摇培养48h，离心收集菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，APV高压均质仪以1500bar循环破碎3次，4°C 8000g离心15min，收集上清(破碎菌液上清)，置-70 V保存。将I倍体积的50%PEG溶液(50%PEG溶液50g PEG6000 (Ameresco公司)溶于100ml ddH20)缓慢加入到4倍体积的上述破碎菌液上清中，4°C搅拌过夜。第二日，4°C 8000rpm，30min离心，去除上清，收集沉淀。用无菌PBS重悬沉淀，浓缩至样品原体积的1/10，得到浓缩样品。2)重组Polio I病毒样颗粒的纯化在离心管中由下至上依次小心加入I. 4g/ml、I. 32g/ml和I. 2g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液(上述步骤I)中得到的浓缩样品)置CsCl不连续密度梯度(CsCl购自北京欣经科公司)，4°C用BeckmanSW32Ti转头IOOOOOg离心21h，PBS缓冲液重悬沉淀，4°C 13000g离心15min，收集上清液置_70°C保存，得到待测样品。对纯化后的待测样品通过紫外分光光度计进行蛋白产量测定，结果显示利用本发明所提供的密码子优化后的重组表达载体PESC-P1Y-3ABCY (实验组)，在酵母表达系统中，每升发酵液可以制备得到约Img的重组Polio I病毒样颗粒，远高于野生型对照组，而空载体对照组没有包装出重组Polio I病毒样颗粒，这一结果说明，密码子优化有效的提高了 Polio I病毒样颗粒在酵母表达系统中的产量。实施例4、重组Polio I病毒样颗粒的鉴定及电镜观察I、Western Blot鉴定重组Polio I衣壳蛋白的表达利用碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒(增强型)(P0010S)，按照说明书操作步骤，对实施例3得到的纯化后的待测样品(实验组待测样品)进行蛋白定量。根据定量结果，对两种待测样品各取适量的悬液进行10%SDS-PAGE电泳。用识别Polio I、II、III全蛋白的羊多克隆抗体为一抗(一抗购自ProSci公司，产品目录号为35-341),突光标记兔抗羊抗体为二抗(二抗购自KPL，产品目录号为072-07-13-06)进行Western Blot分析(蛋白Marker购自Fermentas公司)。同时设置脊髓灰质炎病毒I型sabinl株(poliovirussabinl strainXAKIO N0M0T0, TOSHIKO OMTA, HARUKATOYODA, et al. Compelte nucleotidesequence of the attenuated poliovirus Sabin I straingenome. Prac. Natl. Acad.Sci.，1982(79) :5793-5797.)为阳性对照。结果如图5所示，实验组待测样品和阳性对照样品均检测到大小约为27KD (VP3)的Polio I特异性条带，且实验组(密码子优化后)所检测到的Polio I的VP3特异性条带与阳性对照条带一致。2、重组Polio I病毒样颗粒的电镜观察将实施例3得到的纯化后的三个待测样品(实验组待测样品或空载体对照组待测 样品)调整蛋白浓度一致，各取10 μ I悬液滴加在覆盖镀碳支持膜上静止lmin，吸干镀碳支持膜(购自中镜科仪，编号BZ110223)表面残余液体，用2%磷钨酸(购自中镜科仪，编号GZ02536)染色lmin，吸干镀碳支持膜表面残液，室温放置干燥后用透射电子显微镜观察其形态结构。结果显示，实验组待测样品(图6)在电镜下可见直径约30nm左右的病毒样颗粒的存在，而空载体对照待测样品则没有在电镜下观察到病毒样颗粒的存在。本实施例的结果表明，携带有密码子优化后的Polio I Pl基因和Polio I3ABC基因的重组表达载体在酵母系统中，成功的包装出Polio I的病毒样颗粒。
权利要求
1.脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤 1)将脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因和3ABC基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体； 2)用步骤I)得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述Pl基因和所述3ABC基因的重组酵母细胞； 3)裂解步骤2)得到的重组酵母细胞，分离得到重组的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3ABC基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型脊髓灰质炎病毒I型Pl蛋白和野生型脊髓灰质炎病毒I型3ABC蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型脊髓灰质炎病毒I型Pl基因和野生型脊髓灰质炎病毒I型3ABC基因的密码子替换为酵母细胞偏好的密码子。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列为序列表中序列I所示；所述3ABC基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述目的酵母细胞为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3ABC基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述Pl基因的启动子方向和驱动所述3ABC基因的启动子方向相反。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述重组表达载体为将所述Pl基因和所述3ABC基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处各由一个启动子驱动转录得到的重组质粒。
7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒。
8.密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列为序列表中序列I所示；和/或 密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的3ABC基因，其特征在于所述3ABC基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示。
9.含有权利要求8所述Pl基因和/或3ABC基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
10.权利要求8所述Pl基因和/或3ABC基因在制备下述a)或b)产品中的应用 a)脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒； b)以脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。
全文摘要
本发明公开了重组脊髓灰质炎病毒Ⅰ型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的方法包括如下步骤1)将脊髓灰质炎病毒Ⅰ型的P1基因和3ABC基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2)用所述重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3ABC基因的重组酵母细胞；3)裂解所述重组酵母细胞，分离得到重组的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型病毒样颗粒。实验证明，利用本发明所提供方法，在酵母表达系统中制备了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型的病毒样颗粒，同时较野生型P1基因和3ABC基因相比，本发明对P1基因和3ABC基因的密码子优化大大提高了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型的病毒样颗粒在酵母表达系统中的产量，可将其进一步用于生产婴幼儿手足口病候选预防性疫苗和药物组合物。
文档编号A61P31/14GK102876707SQ201210390829
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者盛望, 王晓雯, 陈立, 赵淼, 曾毅, 李泽琳, 刘伟 申请人:北京工业大学