专利名称：一种水溶性富勒烯及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化工领域，特别是一种水溶性富勒烯及其应用。
背景技术：
作为碳元素的第三种同素异形体富勒烯家庭的发现，是上世纪自然科学发展史最重要的突破之一。Kroto等三人也因为他们在富勒烯研究中开创性的工作而荣获1996年诺贝尔化学奖。富勒烯以其独特的结构和性质倍受人们重视，近十年来，几乎全世界所有著名大学和研究所的科学家都进行了与富勒烯有关的研究。它已成为当今物理、化学、材料及生命科学研究者共同关心的课题。富勒烯分子的重要科学意义，被美国《Science》杂志评为1991年的“明星分子”。在纳米材料中，包括富勒烯、碳纳米管在内的碳纳米材料一直是近年来国际科学的前沿领域之一。富勒烯是由60个碳原子组成的球形分子，包含12个五元环和20个六元环，直径为O. 71nm。近年来，富勒烯在生物医药领域的研究相当引人瞩目，·研究发现富勒烯具有多种特殊的生物学效应(I)可抑制多种酶的活性，包括HIV蛋白酶以及逆转录酶；(2)对肿瘤细胞显示出细胞毒性；(3)具有神经保护剂的作用；(4)还具有在可见光照射下产生氧自由基、切割DNA的作用。富勒烯作为一种优良的光敏剂表现在其在可见光照射的情况下可以产生活性氧，活性氧包括单线态氧、超氧负离子等。富勒烯光照下产生活性氧为高度反应性的，并且可以表现出明显的细胞毒性，比如裂解细胞中的DNA，抑制细胞的有丝分裂以及生长，还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。由此推断，富勒烯可以用于肿瘤的治疗。为此利用富勒烯作为光敏剂开展光动力疗法，即使其在肿瘤组织中蓄积，利用光照产生活性氧来选择性的破坏肿瘤组织。透明质酸(HA)，又名玻尿酸，是一种酸性粘多糖，它是一种水溶性高分子聚合物，具有良好的生物可吸收性、生物兼容性、黏稠性及保水性。在细胞膜的表面有4类透明质酸的特定受体一⑶44(⑶分化群)、RHAMM(HA中介的游动性受体)、IVd4及LEC(肝内皮细胞受体)，其中CD44在肿瘤细胞中的含量较高，而且不同的肿瘤细胞所含有的CD44的结构也不同。受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究。有报道证明，CD44可以抑制细胞的凋亡，其与单克隆抗体类(mAbs)或HA结合,不仅能抑NT淋巴细胞的凋亡,还能提高B淋巴细胞的存活率。它具有很好的靶向作用，无毒，并且能够抑制癌细胞扩张。目前将富勒烯表面接枝一种具有靶向肿瘤细胞作用的高分子水溶性聚合物透明质酸，得到一种新的水溶性富勒烯，及其作为光敏剂和药物转运载体在肿瘤治疗中的应用尚未见报道，因此，本发明的研制成功具有统计学上的意义和实际的临床意义。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种水溶性富勒烯及其应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。
其解决的技术方案是一种富勒烯-透明质酸聚合物，即水溶性富勒烯，它是在原始的富勒烯经过纯化处理的基础上，与氨化试剂反应，将富勒烯表面连接上反应活性较强的氨基后，再与透明质酸反应，生成富勒烯-透明质酸聚合物，其中，透明质酸和富勒烯的质量含量比为O. 18-0. 25:1。水溶性富勒烯的制备方法，包括以下步骤
1)将氨化试剂20ml和氢氧化钠Ig混合，再加入水和无水乙醇的重量比为I:5的混合溶剂60ml，搅拌均匀后，逐滴加入含有富勒烯的有机溶液50ml，在30-50°C、200r/min下搅拌反应1-7天，除去上层的有机溶剂，蒸除水和无水乙醇的混合溶剂，再用无水乙醇或甲醇500ml抽滤洗涤15次，在20-60°C下，真空干燥24_72h，得氨基富勒烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1，3-丙二胺、1，6-己二胺中的一种；所述的含有富勒烯的有机溶液由富勒烯和有机溶剂组成，每Iml的有机溶液中含富勒烯Img ;所述的有机溶剂为甲苯、苯、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物；
2)称取上述得到的氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、l-乙基_(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐(EDC · HCl) 160mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 120mg在20ml甲酰胺或N，N- 二甲基甲酰胺中混合均匀，在40-60 V、200r/min下搅拌反应24h，再用无水乙醇或丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在20-60°C下，真空干燥24-72h，得富勒烯-透明质酸聚合物，即水溶性富勒烯。富勒烯-透明质酸聚合物作为光敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分
1)将制得的富勒烯-透明质酸聚合物溶于水中制成溶液，加入到癌细胞A中进行培养，给药后3h后用光源B光照，光照30-120min，继续培养24小时，测定癌细胞A的存活率；
2)将制得的富勒烯-透明质酸聚合物溶于水中制成溶液，静脉注射到荷瘤小鼠C体内，给药后3h后用光源D光照，光照时间为30-120min，测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。上述步骤I中的癌细胞A为器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。上述步骤I中的光源B为400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。上述步骤2中的荷瘤小鼠C为器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。上述步骤2中的光源D为400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为光敏剂来进行光动力治疗体内深度肿瘤时，这些光源不能够穿透照射时，可以通过适用与所述部位的方法来改善外部光源照射的穿透力进行肿瘤的治疗。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为光敏剂可以制成任意的药物制剂剂型，比如注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物可以加入各种制剂的添加剂，比如生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。富勒烯-透明质酸聚合物作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用，分为以下几个步骤
1)将制得的富勒烯-透明质酸聚合物和抗肿瘤药物A通过方式B进行结合；
2)将装载药物的富勒烯-透明质酸聚合物进行抗肿瘤细胞C和体内的抗肿瘤D的评 价。上述步骤I中的抗肿瘤药物A为难溶性抗肿瘤药物、水溶性药物和核酸药物，比如多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、顺钼、卡钼、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种。上述步骤I中的方式B为超声、搅拌、探超和旋转蒸发中的一种或几种。上述步骤2中的肿瘤细胞C为器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。上述步骤2中的肿瘤D为器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为药物转运载体可以更多的分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以长期的高浓度的保留在肿瘤组织中，这样当采用适当的手段使用光源进行照射时能够在肿瘤组织中产生更多的活性氧，并且可以使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。但也会分布在正常的组织器官中，为了避免产生的活性氧对正常组织产生损伤，可以通过一些手段来加以改善，比如可以在富勒烯-透明质酸聚合物上装载一些具有靶向性质的靶头，也可以使用抗体等手段介导，可以使用临床手段比如说内窥镜的方式来直接输送载药系统到达靶组织，聚焦光照面积等方式。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为药物转运载体可以制成任意的药物制剂剂型，比如注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物可以加入各种制剂的添加剂，比如生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下
注射等。本发明物理以及化学稳定性良好，制备条件容易满足，原料来源丰富，成本低，副作用小，是肿瘤治疗药物载体上的创新。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。实施例I
1)将乙二胺20ml和氢氧化钠Ig加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml,搅拌均勻后，逐滴加入lmg/ml的富勒烯的甲苯溶液50ml,在30°C、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的甲苯，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用无水乙醇500ml抽滤洗涤15次，在40°C下，真空干燥48h，得氨基富勒烯；
2)称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐160mg、N-轻基琥拍酰亚胺120mg在20ml甲酰胺中混合均勻，在40°C、200r/ min下搅拌反应24h,再用无水乙醇500ml抽滤洗漆20次,除去未反应的I-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40°C下，真空干燥48h，得水溶性富勒烯35mg。实施例2
1)将1，3_丙二胺20ml和氢氧化钠Ig加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml,搅拌均勻后,逐滴加入lmg/ml的富勒烯的苯溶液50ml,在30°C、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的苯，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500ml抽滤洗涤15次，在20°C下，真空干燥72h，得氨基富勒烯；
2)称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、l-乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐160mg、N-羟基琥珀酰亚胺120mg在20mlN，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，在40°C、200r/min下搅拌反应24h，再用丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40°C下，真空干燥48h，得水溶性富勒烯32mg。实施例3
I)将1,6-己二胺20ml和氢氧化钠Ig加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml中，搅拌均匀后，逐滴加入lmg/ml的富勒烯的四氢呋喃溶液50ml，在30°C、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的四氢呋喃，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500ml抽滤洗涤15次，在60°C下，真空干燥24h，得氨基富勒烯；
2)称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、l-乙基_(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐160mg、N-轻基琥拍酰亚胺120mg在20mlN, N- 二甲基甲酰胺中混合均匀，在40°C、200r/min下搅拌反应24h，再用丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40°C下，真空干燥48h,得水溶性富勒烯30mg。相关试验资料如下
一、使用光照射本发明水溶性富勒烯对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定通过光照射水溶性富勒烯在体外抗肿瘤活性将PC3前列腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将PC3细胞培养在含胎牛血清(FBS) 10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37°C、5% CO2,每2 3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μ 1，铺板使待测细胞调密度至6 X IO3个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度(12. 5、25、50、100μ g/ml)的水溶性富勒烯透明质酸，设置复孔为4 6个。光照组放置在400W可见光中60min，保持光照过程中温度在37°C，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μ 1,4 °C放置I h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。结果表明，当用光照射60min,水溶性富勒烯透明质酸的加入直接影响了 PC3细胞的增殖。二、光照射时，水溶性富勒烯的体内抗肿瘤活性测定
取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml,小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2 X IO6个/ml的细胞悬液,皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后,取其中24只肿瘤体积彡100 mm3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下(I)对照组(NS组)生理盐水；(2)生理盐水激光组；(3)水溶性富勒烯透明质酸组；(4)水溶性富勒烯透明质酸激光组。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为532nm绿相光源，功率为300mW，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为lOmin。每2天给药一次，每次注射生理盐水或者2mg/ml的水溶性富勒烯透明质酸100 μ 1，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2 d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短
径(B)，按公式肿瘤体积
权利要求
1.一种水溶性富勒烯，其特征在于，该水溶性富勒烯是在富勒烯分子上通过化学键连接透明质酸制成，透明质酸和富勒烯的质量比为O. 18-0. 25:1，所述的富勒烯为C6tl富勒烯。
2.权利要求I所述的水溶性的富勒烯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将氨化试剂20ml和氢氧化钠Ig混合，再加入水和无水乙醇的重量比为1:5的混合溶剂60ml，搅拌均匀后，逐滴加入含有富勒烯的有机溶液50ml，在30-50°C、200r/min下搅拌反应1-7天，除去上层的有机溶剂，蒸除水和无水乙醇的混合溶剂，再用无水乙醇或甲醇500ml抽滤洗涤15次，在20-60°C下，真空干燥24_72h，得氨基富勒烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1，3-丙二胺、1，6-己二胺中的一种；所述的含有富勒烯的有机溶液由富勒烯和有机溶剂组成，每Iml的有机溶液中含富勒烯Img ;所述的有机溶剂为甲苯、苯、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物； 2)称取上述得到的氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、l-乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐160mg、N-羟基琥珀酰亚胺120mg在20ml甲酰胺或N，N-二甲基甲酰胺中混合均勻，在40-60°C、200r/min下搅拌反应24h,再用无水乙醇或丙酮500ml抽滤洗漆20次，除去未反应的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在20-60°C下，真空干燥24-72h，得富勒烯-透明质酸聚合物，即水溶性富勒烯。
3.根据权利要求2所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于，I)将乙二胺20ml和氢氧化钠Ig加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml，搅拌均匀后，逐滴加入Img/ml的富勒烯的甲苯溶液50ml,在30°C、200r/min下搅拌反应7天,除去上层的甲苯,蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用无水乙醇500ml抽滤洗涤15次，在40°C下，真空干燥48h，得氨基富勒烯； 2)称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐160mg、N-轻基琥拍酰亚胺120mg在20ml甲酰胺中混合均勻，在40°C、200r/min下搅拌反应24h,再用无水乙醇500ml抽滤洗漆20次,除去未反应的I-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40°C下，真空干燥48h，得水溶性富勒烯35mg。
4.根据权利要求2所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于，I)将1，3-丙二胺20ml和氢氧化钠Ig加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml，搅拌均匀后，逐滴加入lmg/ml的富勒烯的苯溶液50ml,在30°C、200r/min下搅拌反应7天,除去上层的苯,蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500ml抽滤洗涤15次，在20°C下，真空干燥72h，得氨基富勒烯； 2)称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、l-乙基_(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐160mg、N-羟基琥珀酰亚胺120mg在20mlN，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，在40°C、200r/min下搅拌反应24h，再用丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40°C下，真空干燥48h，得水溶性富勒烯32mg。
5.根据权利要求2所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于，I)将1，6-己二胺20ml和氢氧化钠Ig加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml中，搅拌均匀后，逐滴加入lmg/ml的富勒烯的四氢呋喃溶液50ml,在30°C、200r/min下搅拌反应7天,除去上层的四氢呋喃，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500ml抽滤洗涤15次，在60°C下，真空干燥24h，得氨基富勒烯； 2)称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、l-乙基_(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐160mg、N-羟基琥珀酰亚胺120mg在20mlN，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，在40°C、200r/min下搅拌反应24h，再用丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40°C下，真空干燥48h,得水溶性富勒烯30mg。
6.根据权利要求I或2-5任何一项所述的水溶性富勒烯，其特征在于，所述的水溶液富勒烯的粒径为30-300nm。
7.根据权利要求I或2-5任何一项所述的水溶性富勒烯在抗肿瘤光动力治疗的光敏剂中的应用。
8.权利要求I或2-5任何一项所述的水溶性富勒烯在作为抗肿瘤药物载体中的应用。
全文摘要
本发明涉及水溶性富勒烯及其应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题，其解决的技术方案是，在原始的富勒烯经过纯化处理的基础上，与氨化试剂反应，将富勒烯表面连接上反应活性较强的氨基后，再与透明质酸反应，生成富勒烯-透明质酸聚合物，其中，透明质酸和富勒烯的质量含量比为0.18-0.25:1，本发明物理以及化学稳定性良好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低，副作用小，是肿瘤治疗药物载体上的创新。
文档编号A61P35/00GK102898542SQ20121040670
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者张红岭, 史进进, 张振中, 刘艳, 叶凡, 高君, 刘瑞瑗, 马柔柔, 余晓媛, 张静, 王蕾, 侯琳 申请人:郑州大学