富勒烯单加成线肽及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种富勒烯单加成线肽及其制备方法和其在清除自由基方面的应用，N-取代富勒烯单加成吡咯烷与只有一个活性羧基的酸性氨基酸在DCC、HOBT、DMAP的存在下，用液相合成法进行缩合反应，反应结束后，硅胶柱层析分离纯化，产物经脱保得到仅含氨基保护基富勒烯单加成氨基酸，仅含氨基保护基富勒烯单加成氨基酸的活性羧基与树脂-多肽上的活性氨基用固相合成法进行缩合反应，产物经脱保，裂解得到富勒烯单加成多肽，大大提高肽的稳定性及富勒烯的水溶性，还可以用来连接不同的多肽（如抗体或表面受体），随着功能肽的变换而获得不同的生物学活性，具有良好的抗癌活性和清除自由基的能力。
【专利说明】富勒烯单加成线肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种富勒烯单加成线肽及其制备方法，该化合物 大大的提高了富勒烯在极性溶液中的溶解度，提高了生物学利用度及其对细胞的靶向性问 题。
【背景技术】
[0002] 富勒烯C6tl因具有特殊的物理、化学性质显示了较独特的生物学活性，可归纳为光 敏性作用与非光敏性作用。前者与富勒烯球笼受光诱导在氧存在时产生单线态氧等自由基 有关，包括光激发的DNA断裂、细胞膜损伤和细胞毒性等。不断增加的研究资料显示富勒烯 衍生物在生物医药领域具有相当广泛的应用前景，如作为光动力学治疗中的光敏剂、抗衰 老药物、反义核酸药物和药物载体，其光敏作用的研究与应用逐渐成为富勒烯研究的前沿 和热门方向。越来越多的研究表明富勒烯量子产额高，比目前临床应用的光敏剂效果好得 多，且对正常皮肤、小鼠体重及血液中一些酶含量基本上没有影响，为富勒烯作为肿瘤动力 学治疗中的光敏剂提供了理论依据；但也有不同的研究结论，还需要进一步深入系统地研 究来证实。
[0003] 不同的多肽具有不同的生物功能和用途，常用的功能肽有R⑶肽、PHLATLF肽 和TISWPPR肽等，短肽PHLATLF对卵巢癌A2780细胞具有生长抑制作用，TISWPPR这个七 肽（TR-7)对大肠癌有特异性亲和作用，主要是对肿瘤干细胞的特异性标记分子CD133有 特异性的高亲和作用，对肿瘤细胞的增殖能力及粘附能力没有显著影响，对肿瘤细胞的 迁移运动能力有显著的抑制作用。其中RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (Arg-Gl y-Asp)3个氨基酸的小分子多肽，可以与在某些肿瘤细胞高表达的整合素α ν β 3分 子发生特异性结合，α ν β 3在正常组织系统极少表达甚至不表达，也使其成为肿瘤靶向治疗 理想的靶点。配体RGD与ανβ 3受体结合的特异性强，亲和力高，是有效的药物载体。
[0004] 基于以上系列研究基础，我们拟设计合成一种新型的富勒烯衍生物的纳米光敏 齐U。为富勒烯修饰的RGD肽：FP (RGD)，这样一方面可以增加肽的稳定性及富勒烯的水溶 性，充分发挥RGD肽的生物活性，从而获得肿瘤靶向的光敏剂；另一方面，建立的实验方法 还可以用来连接不同的多肽(如抗体或表面受体)，随着功能肽的变换而获得不同的生物学 活性。富勒烯光动力学研究有不少报道，但合成的化合物结构复杂，很少有在生物学方面进 一步系统的研究，对于这种富勒烯衍生物的纳米颗粒的光敏性等抗肿瘤活性研究更是未见 报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是体供一种富勒烯单加成线肽的制备方法，大大提高了富勒烯在极 性溶液中的溶解度，且具有良好的抗癌活性和清除自由基的能力。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种富勒烯单加成线肽，结构式如 下：
【权利要求】
1. 一种富勒烯单加成线肽，其特征在于结构式如下：
其中L为RGD肽、TISWPPR肽和PHLATLF肽。
2. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) N-取代富勒烯单加成吡咯烷与只有一个活性羧基的酸性氨基酸在DCC、HOBT、DMAP 的存在下，在氮气保护下，用液相合成法进行缩合反应，室温避光搅拌反应24~72小时，反 应结束后，硅胶柱层析分离纯化得到氨基和羧基均被保护的富勒烯单加成氨基酸； (2) 将氨基和羧基均被保护的富勒烯单加成氨基酸加入TFA/DCM的混合溶液中，室温 搅拌反应〇. 5~12h，经脱保脱除羧基保护基得到仅含氨基保护基的富勒烯单加成氨基酸； (3) 将仅含氨基保护基富勒烯单加成氨基酸溶于DMF/DCM混合溶剂中，然后加入树 脂-线肽、HBTU、HOBT和DIEA，在室温下用固相合成法进行缩合反应，产物经脱保、裂解得到 富勒烯单加成线肽； 以上各个步骤均在无水无氧的条件下进行； 所述步骤（1)中的只有一个活性羧基的酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸； 所述步骤（3)中的树脂-线肽为树脂-RGD肽、树脂-TISWPPR肽或树脂-PHLATLF肽。
3. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（1)中 N-取代富勒烯单加成吡咯烷、只有一个活性羧基的酸性氨基酸、DCC、HOBT和DMAP的物质的 量之比为 〇? 05-0. 2:2:2:2:0. 2。
4. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（2)中 TFA/DCM的混合溶液中TFA和DCM的体积比为0. 2-9:1。
5. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3)中 仅含氨基保护基的富勒烯单加成氨基酸、树脂-线肽、HBTU、HOBT和DIEA的物质的量之比 为 2:1-6:2:2:4。
6. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3)中 DMF/DCM混合溶剂中DMF和DCM的体积比为1:1。
7. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3)在 室温下用固相合成法进行缩合反应是在140r/min的条件下振荡8-24h。
8. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3)中 脱保所用试剂为哌啶/DMF的混合溶液，其中哌啶和DMF的体积比为1:4,在室温、140r/min 的条件下振荡15~30min。
9. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3)中 裂解所用试剂为TFA/TIS/H20的混合溶液，其中TFA、TIS和H20的体积比为95:2:3,在室 温、140r/min的条件下振荡2-4h。
10. 根据权利要求1所述的富勒烯单加成线肽得到的纳米体系及其在清除自由基方面 的应用。
【文档编号】C07K7/06GK104478994SQ201410839223
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】张静, 张晓磊, 何婷 申请人:郑州大学