专利名称：鸡ibd病毒vp2和鸡il-2的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程亚单位疫苗技术领域，具体涉及IBD病毒VP2蛋白和鸡IL-2的融合蛋白及其应用，即鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和鸡IL-2的融合蛋白及应用。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊，从而导致免疫抑制，增加了机体对其它病原体的易感性，降低对其它疫苗的反应性，国外学者形象地称该病为鸡的“艾滋病”。虽然各国学者在IBD疫苗的研究上取得了巨大成就，但均未能从根本上扭转IBD流行日趋严重的现状。近十几年来，由于鸡传染性法氏囊病病毒IBDV超强毒株和变异株的出现、抗原变异和血清亚型的多样性，使目前的商品化疫苗不能提供足够的保护，其保护率仅达109Γ70%。超强毒株的毒力是标准病毒株的两倍以上，使鸡的发病率和死亡率明显上升，年龄较大的鸡甚至18周龄以上的后备母鸡也能致 病。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗已经面临着严峻的考验。因此，需要筛选出新的超强毒株的变异基因来制备新的疫苗。鸡白介素-2 (Interleukin-2，IL-2)是重要的免疫调控因子，能以非特异性的方式增强针对特异性抗原的免疫力。众多试验结果与临床应用表明IL-2作为疫苗佐剂在治疗多种感染性疾病时具有良好的佐剂效应。IL-2的免疫增强剂不同于以往的化学佐剂，它们能调节动物对疫苗的反应，包括免疫细胞向接种部位移动，抗原提呈，促进Th细胞的产生，B细胞的成熟和分化，激活包括NK细胞、嗜酸性细胞和肥大细胞在内的非特异性杀伤细胞。而将IBD的VP2蛋白与IL-2蛋白融合表达，能增强IBD的VP2免疫力，刺激细胞免疫，从而提高IBD VP2亚单位疫苗的使用效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种IBD病毒VP2蛋白和IL-2的融合蛋白及其应用，涉及一种IBDV VP2蛋白与鸡IL-2融合蛋白的制备及应用，即将临床分离的IBDV超强毒株的VP2蛋白与免疫增强作用的IL-2蛋白通过一个柔性linker连接起来，获得了一个融合蛋白，该蛋白经过纯化后制成疫苗可以是免疫鸡抵抗IBDV强毒及超强毒的攻击而不引起免疫抑制。本发明的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。用于编码上述融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。本发明的融合蛋白用于制备亚单位疫苗。上述的亚单位疫苗的制备方法如下取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加6份的司本-80高压灭菌作为油相备用；取灭菌的4份吐温-80，加入96份的融合蛋白，充分搅拌至吐温-80完全溶解作为水相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即可制备鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗。上述制备的亚单位疫苗用来防治鸡传染性法氏囊病。
本发明是将鸡IBDV超强毒的VP2蛋白与具有免疫增强作用的鸡IL_2蛋白融合表达，制备的疫苗经皮下注射后对鸡抵抗鸡传染性法氏囊病强毒攻击具有坚强的抵抗力。
具体实施例方式IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是最主要宿主保护性抗原，而鸡IL_2具有明显的免疫增强作用，本发明是用重叠延伸PCR方法将两种基因通过linker连接起来，克隆到pET-28a载体上，转化BL21(DE3)，经IPTG诱导后VP2-1L2融合蛋白获得了表达，将表达菌体高压匀浆破碎后离心取上清即为VP2-1L2蛋白溶液，加入矿物油佐剂制成油乳剂疫苗，可用于预防鸡传染性法氏囊病，效果优于VP2亚单位疫苗。下面结合具体的实施例对本发明的融合蛋白进行详细的描述。·一、VP2基因的筛选用Primer5. O软件设计了一对扩增鸡传染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保护性碱基及BamH I酶切位点，在下游引物的5'端加入保护性碱基和Xho I酶切位点，引物序列为Primer I 5/ -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 5/ -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 μ 用临床分离的疑似IBDV的病料感染的鸡胚接种尿囊膜悬液上清液，按RNAisoReagent说明书所述方法提取病毒RNA,按反转录试剂盒使用说明书进行反转录合成cDNA，进行PCR扩增，扩增体系为(50 μ ):10XPCR Buffer δμΙ, ΝΤΡ (IOmM each) μ ,上、下游引物(IOmM)各 μ ，cDNA 3 μ , 25mM MgC12 4 μ , Taq酶(5υ/μ1 ) μ1，(ΜΗ2034μ1 ;PCR 反应参数95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 个循环，72 °CIOmin。得到一个1300bp左右的片段，切胶回收该片段，与pMD-18T载体连接。PCR回收片段 6μ1，Τ 载体 2μ1 (稀释 10 倍后)，T4 DNA 连接酶 μ1，Τ4 buffer 2. 5μ1，水13. 5μ1，总计25μ1。16°C过夜连接，取20 μ 连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，挑选10个白色菌落培养，提取质粒鉴定正确的选取3个测序，结果3个质粒的测序结果都一致，证明获得的核苷酸片段在扩增的过程中没有产生错误，其核苷酸序列为SEQ ID Ν0:4，翻译的氨基酸序列为 SEQ ID NO:3。将该核苷酸序列在NCBI上Blast比对，有十几个碱基发生了点突变，表明该毒株为一株新的流行毒株。这是由于VP2蛋白是主要宿主保护性抗原，经常发生突变而导致抗原性发生差异。二、VP2重组蛋白的表达将鉴定正确的上述一个质粒用BamH I和Xho I双酶切回收基因片段，与用这两个酶切的pET-28a载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒鉴定正确后转化感受体的BL21 (DE3)，挑取单菌落，转接5mlLB小管培养基，37°C振荡培养3 4小时至0D600为O. 6时，加入终浓度为O. 8mM的IPTG诱导4飞小时，SDS-PAGE电泳结果证实为分泌表达。将表达菌用10倍菌体湿重PBS重悬，高压匀浆破碎细菌，离心取上清，做琼脂免疫扩散试验，结果琼扩效价不低于1:64。三、VP2蛋白的纯化用镍柱纯化，200mM的咪唑洗脱，洗脱液用PBS透析过夜。所得透析液即为纯化的蛋白，可用于制苗。四、VP2亚单位疫苗的制备取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，混合后，加热溶化，116°C灭菌30分钟做为制苗用油相；加入灭菌的吐温-80 4份，然后加入上述制备的VP2重组蛋白发酵提取液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解，做为制苗用水相；取油相3份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最终浓度为O. 01 %。VP2亚单位疫苗的免疫效果将20只SPF鸡随机分为两组，每组10只，其中一组在21日龄时以O. 3ml/只的剂量皮下注射VP2亚单位疫苗，免疫21日后连同不免疫对照组每只经点眼途径接种100BID鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液，攻毒后每天观察鸡只的临床表现及死亡情况，记录 发病和死亡鸡数，剖检观察死亡鸡法氏囊等病变，72 96小时扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病理变化。结果不免疫对照组8只鸡发病，而免疫组鸡只无发病。上述结果证明本发明制备的VP2亚单位疫苗具有很好的免疫原性。五、VP2蛋白与鸡IL-2蛋白的融合采用重叠延伸PCR方法扩增融合基因。分别使用以下引物。其中P5引入Hind III的酶切位点。P I 5/ -GGATCCGCGTCGACATGACAA ACCTGCAAGATC - 3'P 3:5' - AACGCCGTAAATAAAACCATGCCAGAGCCGCCAGAGCC - 3'P 4:5' -AAGCTT ttatttttgcagatatctca- 31用Pl 和 P3 扩增 IBDV 的 VP2 基因，扩增体系为(50 μ ) 10XPCR Buffer 5μ1,dNTP (IOmM each) μ ，上、下游引物(IOmM)各 μ ，cDNA 3 μ , 25mM MgCl2 4 μ , Taq酶(5υ/μ1 ) μ ，ddH20 34μ1。PCR 反应条件95°C预变性 5min，94°C变性 lmin，52°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin,循环 5 次后，94°C变性 lmin, 56°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin, 30 个循环，72°C延伸lOmin。胶回收试剂盒回收大约1400bp的PCR片段。人工合成鸡IL-2基因成熟肽的片段，其氨基酸序列为SEQ ID N0:5;将该片段与IBDV的VP2回收片段做为模板，以Pl和P4为引物，扩增融合基因，反应条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸IOmin0得到片段大约1700bp。核苷酸测序结果为SEQ ID NO: 2，翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO:1 ;都与最初设计的一致。六、融合蛋白的诱导表达1、将上述制备的融合基因与pET_28a载体分别经BamH I和Hind III双酶切回收后进行连接连接，将重组载体用氯化钙法转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，克隆后筛选出的阳性克隆测序确定插入的片段正确。将阳性克隆用IPTG诱导表达，将表达产物后电泳可见65kd左右的蛋白，表达量大约为10%，琼脂扩散试验及western-blot方法鉴定表明，表达的蛋白为VP2-1L2融合蛋白，超声破碎细菌后分别取上清和沉淀SDS-PAGE电泳，表明蛋白为可溶性表达。2、重组蛋白的纯化用镍柱纯化，200mM的咪唑洗脱，洗脱液用PBS透析过夜。所得透析液即为纯化的蛋白，可用于制苗。七、VP2亚单位疫苗与VP2-1L2亚单位疫苗制备取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，混合后，加热溶化，116°C灭菌30分钟做为制苗用油相；取灭菌的吐温-80 4份，然后分别加入上述制备的VP2重组蛋白、VP2-1L2融合蛋白发酵提取液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解做为制苗用水相；取油相3份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以IOOOOr/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最终浓度为O. 01 %。制备的疫苗分别为VP2亚单位疫苗与VP2-1L2亚单位疫苗。八、VP2亚单位疫苗与VP2-1L2 二联亚单位疫苗的免疫效果将制备的两种基因工程亚单位疫苗分别免疫21日龄SPF鸡，每种疫 苗免疫30只，免疫后7日分别测定采集抗凝血测定淋巴细胞转化率，免疫21日后采血分离血清测定法氏囊琼扩效价，并连同不免疫对照10只用强毒BC6-85点眼攻毒，结果表明7日淋巴细胞转化率VP2-1L2免疫组明显高于VP2免疫组与对照组；21日攻毒后VP2亚单位疫苗9/10保护，融合蛋白免疫组10/10保护，对照组8/10发病；VP2亚单位疫苗免疫组血清的琼脂扩散抗体效价的几何平均数为1:19. 7，而VP2-1L2免疫组的明显抗体效价的几何平均数为1:34. 3，明显高于VP2亚单位疫苗免疫组。上述结果表明本发明所制备的融合蛋白作为疫苗具有很好的效果，而且，由于本发明的VP2为新的等位基因，可以有效的弥补已有VP2疫苗的缺陷。
权利要求
1.一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和鸡白介素_2的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2.一种核苷酸，所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQID N0:2。
4.权利要求1所述的融合蛋白在制备亚单位疫苗中的应用。
5.一种亚单位疫苗，其制备方法如下取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加6份的司本-80高压灭菌作为油相备用；取灭菌的4 份吐温-80，加入96份的权利要求1所述的融合蛋白，充分搅拌至吐温-80完全溶解作为水相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即制成亚单位疫苗。
6.权利要求5所述的亚单位疫苗用来防治鸡传染性法氏囊病。
全文摘要
本发明的目的是提供一种IBD病毒VP2蛋白和IL-2的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO1。本发明是将鸡IBDV超强毒的VP2蛋白与具有免疫增强作用的鸡IL-2蛋白融合表达，制备的疫苗经皮下注射后对鸡抵抗鸡传染性法氏囊病强毒攻击具有坚强的抵抗力。
文档编号A61P31/14GK102993310SQ20121050666
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者王雷, 凌红丽, 王宏华, 王睿智 申请人:青岛康地恩药业股份有限公司, 青岛宝依特生物制药有限公司