专利名称：糖化白蛋白质控品的制备方法
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，具体讲是一种糖化白蛋白质控品的制备方法。
背景技术：
糖尿病是危及人类健康的重大疾病之一，其发病晚期带来的并发症(如肾病、神经系统疾病和心血管疾病等)具有致死性，已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病，被医学界称为"沉默的杀手"，严重威胁着人类健康；传统糖化白蛋白质控品都是用血清制成，可能带来HIV或者HPV等污染，另外，由于血清中葡萄糖与白蛋白的并存，在放置的过程中会不断的生成糖化白蛋白，从而也造成样本不稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点:提供一种无污染、稳定性好的糖化白蛋白质控品的制备方法。本发明的技术解决方案如下:
一种糖化白蛋白质控品的制备方法，它包括以下制备步骤:
1)先在反应液中加入白蛋白，使每分升反应液中白蛋白含量为1-10克，在15-45°c下糖基化反应ι- ο天后，离心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反应液成分为:
缓冲液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化钠:9g/L葡萄糖:50_200m M金属螯合剂:0.1-1OmM防腐剂质量百分含量:0.1-5%
其中上述溶剂为水；
2)将步骤I)中制备的上清液装入透析袋，置于4°C透析液中透析至完全除去葡萄糖，离心取上清液，其中所述透析液成分为:
缓冲液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化钠:9g/L金属螯合剂:0.1-1OmM防腐剂质量百分含量:0.1-5%
其中上述溶剂为水；
3)将步骤2)中制备的上清液用白蛋白稀释液稀释至所需质控品浓度，加入赋形剂，然后进行低温预冻、冷冻干燥，制成冻干粉，最后将冻干粉复溶、分装即可使用；其中所述白蛋白稀释液中的白蛋白浓度等于步骤I)中糖基化反应前溶液中白蛋白浓度，且成分区别在于白蛋白稀释液中不含葡萄糖。所述白蛋白为重组人白蛋白。所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、Good’ s缓冲液中的一种。所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一种。所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮钠、山梨酸钾、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、proclin300 中的一种。所述赋形剂由冻干保护剂，填充剂，酸碱调整剂组成，其中各组分以它们加入溶液后的含量计为:冻干保护剂质量百分含量0.5-10%,填充剂质量百分含量0.5-15%,酸碱调整剂摩尔浓度0.05-20mM。所述冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜(DMS0)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种；所述填充剂为甘露醇、山梨醇、PEG4000、明胶中的一种；所述酸碱调整剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸钠中的一种。所述低温预冻为在-50°c至-90°c的条件下，预冻3小时以上将溶液冷冻成型。所述冷冻干燥的条件为第一次干燥阶段的升温速度采用3-10°C每小时，持续20-35小时，第二次干燥阶段的升温速度采用20-25°C每小时，持续5_10h。本发明的有益效果是:按本发明制备的糖化白蛋白质控品，具有无污染、稳定性好、成本低、安全、利于大批量生产的优点。
具体实施例方式下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。实施例一
糖化白蛋白质控品(250 μ mol/L)的制备:
1)称取重组人白蛋白lg，溶于20mL反应液中，37°C反应7天后，18000rpmX30min离心去除沉淀，其中反应液成分如下:
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液:50mM，pH 8.0 葡萄糖:100mM 氯化钠:9g/L EDTA:2mM
叠氮钠的质量百分含量:1%
其中上述溶剂为水；
2)将步骤I)中制备的上清液装入透析袋，置于4°C透析液中透析，其中所述透析液成分为:
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液:50mM，pH 8.0 氯化钠:9g/L EDTA:2mM
叠氮钠的质量百分含量:1%
其中上述溶剂为水；
透析时间为48h，中间更换透析液4次，采用葡萄糖试剂测定葡萄糖含量，检测不到葡萄糖含量时，透析结束，离心取上清液，用HPLC测定糖化白蛋白的含量，浓度为8000 μ mol/L, 50g/L白蛋白溶液稀释32倍得到250 μ mol/L的质控品，并用HPLC准确定值。3)往步骤2)中稀释好的质控品中加入海藻糖:1%，甘露醇:3%、聚维酮1%、甘氨酸:
0.5mM,于_65°C低温预冻5h，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥，第一次冷冻干燥采用升温速度5°C /h，持续28h，第二次冷冻干燥采用25°C /h，持续IOh后制得冻干粉。4)将步骤3)中所制冻干粉用水复溶后分装，置于2°C环境中冷藏，每月测定一次糖化白蛋白含量，每次重复3次，取平均值，数据如下:
权利要求
1.一种糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于:它包括以下制备步骤: 1)先在反应液中加入白蛋白，使每分升反应液中白蛋白含量为1-10克，在15-45°c下糖基化反应ι- ο天后，离心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反应液成分为:缓冲液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化钠:9g/L葡萄糖:50_200mM金属螯合剂:0.1-1OmM防腐剂质量百分含量:0.1-5% 其中上述溶剂为水； 2)将步骤I)中制备的上清液装入透析袋，置于4°C透析液中透析至完全除去葡萄糖，离心取上清液，其中所述透析液成分为:缓冲液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化钠:9g/L金属螯合剂:0.1-1OmM防腐剂质量百分含量:0.1-5% 其中上述溶剂为水； 3)将步骤2)中制备的上清液用白蛋白稀释液稀释至所需质控品浓度，加入赋形剂，然后进行低温预冻、冷冻干燥，制成冻干粉，最后将冻干粉复溶、分装即可使用。
2.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于:所述白蛋白为重组人白蛋白。
3.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于:所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、Good’ s缓冲液中的一种。
4.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于:所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一种。
5.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于:所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮钠、山梨酸钾、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、proclin300中的一种。
6.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于:所述赋形剂由冻干保护剂，填充剂，酸碱调整剂组成，其中各组分以它们加入溶液后的含量计为:冻干保护剂质量百分含量0.5-10%,填充剂质量百分含量0.5-15%，酸碱调整剂摩尔浓度0.05_20mM。
7.根据权利要求6所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于:所述冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜(DMS0)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种；所述填充剂为甘露醇、山 梨醇、PEG4000、明胶中的一种；所述酸碱调整剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸钠中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种糖化白蛋白质控品的制备方法，它包括以下制备步骤1)将白蛋白糖基化；2)透析除去白蛋白溶液中葡萄糖防止白蛋白进一步糖基化；3)稀释至所需质控品浓度，冷冻干燥，最后将冻干粉复溶、分装。按本发明制作出来的糖化白蛋白质控品具有具有无污染、稳定性好、成本低、安全、利于大批量生产的优点。
文档编号A61P3/10GK103076213SQ20121057292
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者邹炳德, 邹继华, 贾江花, 谢蒙 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司