D-二聚体质控品的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测药剂的制备方法，具体为D-二聚体质控品的制备方法，利用人血浆为原料，与酶复合溶液混合后，温育形成纤维蛋白凝块，用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，用缓冲溶液重悬纤维蛋白凝块，温育后，纤维蛋白凝块溶解，形成D-二聚体母液，用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，加入人正常混合血浆，制成不同浓度水平的D-二聚体质控品。该方法工艺简便快捷、成本低。采用人血浆为主要原料，直接制备纤维蛋白，纤维蛋白溶解过程尽可能接近人体内部自然的纤维蛋白溶解过程，从而获得性质结构和人体内部产物尽可能相似的产物，其性质与正常或疾病状态下，人体血液中的D-二聚体状态性质是一致的。
【专利说明】D-二聚体质控品的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测药剂的制备方法，具体为D-二聚体质控品的制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前临床常通过D-二聚体或FDP检测来发现血栓形成，从而帮助此类疾病的诊 断。D-二聚体/FDP检测具有检测费用较低、结果返回时间短、特异性高、阴性预测值高的优 点。
[0003] 在D-二聚体的检测中，由于检测标本的基质为人血浆，如果质控品的基质与人血 浆相同或相似，将会避免因为基质不同而对检测结果的干扰，从而更好的监测实验方法的 准确性和稳定性。通常用人血浆直接作为质控品用于常规疾病标志物的临床检测，但是由 于正常人血浆中D-二聚体含量极低，不能反映某些疾病D-二聚体的高值状态，所以需要制 备特定D-二聚体浓度的质控品。
[0004] 由希森美康株式会社申报的专利《D-二聚体测定用标准物质》申请号： 20061009520. 4,提供一种D-二聚体制备分离纯化方法，将纤维蛋白用分解纤维蛋白的酶 溶解，并将获得的溶液用凝胶过滤层析，纯化出含有D-二聚体的溶液。适用于制备D-二聚 体标准物质，由于标准物质的精密性和均匀性要求较高，使得制备技术复杂，需要复杂的纯 化步骤。该方法使用的原料为市售商品或利用基因工程技术制备，成本高，过程复杂、耗时。 以上这些因素使得该技术成本较高，不适合用于质控品的制备。
[0005] 由上海太阳生物技术有限公司提交的专利申请《D-二聚体质控品及其制备方法》 申请号：201310090638. 4,技术方案为将牛血浆复钙凝固后，加入可以降解纤维蛋白的酶使 纤维蛋白凝块溶解，用蛋白酶抑制剂终止反应，产生的D-二聚体母液，用冻干保护液稀释， 冷冻干燥，即得。该技术采用的主要原材料为牛血浆，虽然节约了成本，但是获得的D-二聚 体物质毕竟是非人类的，异源性的，其基质的不同也可能会干扰检测结果，在一定程度上不 能代表人体内部的真实状况，从而获得的检测结果也可能有一定的误差，影响临床结果的 判断。
【发明内容】
[0006] 针对上述技术问题，本发明提供一种简便、快捷的制备D-二聚体质控品的方法。 本发明方法制备的D-二聚体质控品为D-二聚体多个浓度，且其他血浆物质含量与正常血 浆相似或接近；该产品均一性和稳定性较好，满足临床对D-二聚体检测的质量控制要求， 可以更准确地监测临床样本检测结果的准确性。
[0007] 具体的技术方案为：
[0008] D-二聚体质控品的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、纤维蛋白溶解酶激酶加入到缓冲液中，使 其浓度依次分别为〇. 01?〇. 〇5mol/L、l?5U/ml、5?20mU/ml，得到的酶复合液在37°C温 育10?15分钟；
[0010] ⑵制备纤维蛋白凝块：将多人份混合血浆在37°c温育5?10分钟，与温育的酶 复合液混合，颠倒混匀，37°C温育，使其形成纤维蛋白凝块；
[0011] (3)制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内的 血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37°C温育0. 5?2小时，纤维蛋白凝块溶解，加 入丝氨酸蛋白酶抑制剂，以l〇〇〇〇g，4°C离心15分钟，收集上清，即得到D-二聚体母液；
[0012] (4)制备D-二聚体质控品：用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，添加到多人份混合 血浆中，并加入冻干保护剂，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，定值、分装、冷冻干 燥，即得D-二聚体质控品。
[0013] 其中，缓冲液为可选择pH5?10、优选pH6?9的缓冲液，缓冲液为磷酸缓冲液、氨 基酸缓冲液、咪唑缓冲液、GOOD缓冲液中的一种。
[0014] GOOD缓冲液为MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、TES、HEPES、Tris-HCl、TAPS缓冲液中 一种。
[0015] 优选的缓冲液为Tris-HCl，Tris0? 05 ?0? 15mol/L，氯化钠 0? 05 ?0? 45mmol/L， pH7. 2 ?7. 8〇
[0016] 冻干保护液：5?30g/L鹿糖、10?50g/L甘氨酸，1?10g/L叠氮化钠，5?25g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0. 01?1. 0g/L苯甲基磺酰氟。
[0017] 纤维蛋白溶解酶激酶为链激酶、组织型纤溶酶原激活物、尿纤溶酶原激活物中的 任意一种。
[0018] 多人份混合血浆，是指由体格检查、血液生化检查、传染病检查均合格的健康人群 血浆混合而成。
[0019] 丝氨酸蛋白酶抑制剂可以为苯甲基磺酰氟化物、苯甲脒、抑肽酶中任意一种，优选 抑肽酶。抑肽酶浓度为1?l〇ug/ml。
[0020] 本发明提供的D-二聚体质控品的制备方法，利用人血浆为原料，与酶复合溶液混 合后，温育一段时间形成纤维蛋白凝块，用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块后，用缓冲溶液重悬纤 维蛋白凝块，温育一段时间后，纤维蛋白凝块溶解，形成D-二聚体母液。用缓冲液调整D-二 聚体母液浓度，加入多人份混合血浆与冻干保护剂，分装，冷冻干燥，制成不同浓度水平的 D-二聚体质控品。
[0021] 本发明提供的D-二聚体质控品的制备方法，简化了传统方法的制备工艺，解决了 多种酶需要分步骤添加的问题；同时解决了传统方法可选用酶较少、成本较高的问题，可以 采用多种激活纤维蛋白溶解酶的酶，工艺简便快捷、成本低。采用人血浆为主要原料，直接 制备纤维蛋白，从而获得D-二聚体溶液。纤维蛋白溶解过程尽可能接近人体内部自然的纤 维蛋白溶解过程，从而获得性质结构和人体内部产物尽可能相似的产物。由于是利用人源 化的材料制备质控品，其性质与正常或疾病状态下，人体血液中的D-二聚体状态性质是一 致的。制备得到D-二聚体母液后，用缓冲液液加以稀释，加入到多人份混合血浆中，并添加 冻干保护液，分装，冷冻干燥，从而制备得到D-二聚体质控品。该质控品除D-二聚体外，其 中的其他物质的浓度水平与正常血浆相似或接近。
【具体实施方式】
[0022] 结合实施例说明本发明的【具体实施方式】。
[0023] 实施例1
[0024] D-二聚体质控品的制备方法，包括以下步骤：
[0025] (1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、尿纤溶酶原激活物加入到缓冲液中，使其 浓度依次分别为〇. 〇3mol/L、5U/ml、20mU/ml，得到的酶复合液在37°C温育10?15分钟；
[0026] (2)制备纤维蛋白凝块：将多人份的混合血浆在37°C温育5?10分钟，与温育的 酶复合液混合，颠倒混匀，37°C温育，使其形成纤维蛋白凝块；
[0027] (3)制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内 的血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37°C温育1小时，纤维蛋白凝块溶解，加入 2ug/ml抑肽酶，以10000g，4°C离心15分钟，收集上清，即得到D-二聚体母液；
[0028] (4)制备D-二聚体质控品：用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，添加到多人份混合 血浆中，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，定值，分装、冷冻干燥，即得D-二聚体质 控品。
[0029] 其中，缓冲液为Tris-HCl，Tris0? 05mol/L，氯化钠 0? 07mmol/L，pH7. 2 ?7. 8。 [0030] 冻干保护液：20g/L蔗糖、lOg/L甘氨酸，5g/L叠氮化钠，5g/L4-羟乙基哌嗪乙磺 酸，1.0g/L苯甲基磺酰氟。
[0031] 实施例2
[0032] D-二聚体质控品的制备方法，包括以下步骤：
[0033] (1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、组织型纤溶酶原激活物加入到缓冲液中， 使其浓度依次分别为〇. 01mol/L、3U/ml、10mU/ml，得到的酶复合液在37°C温育10?15分 钟；
[0034] (2)制备纤维蛋白凝块：将多人份混合血浆在37°C温育5?10分钟，与温育的酶 复合液混合，颠倒混匀，37°C温育，使其形成纤维蛋白凝块；
[0035] (3)制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内的 血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37°C温育0. 5小时，纤维蛋白凝块溶解，加入 10ug/ml抑肽酶，以10000g，4°C离心15分钟，收集上清，即得到D-二聚体母液；
[0036] (4)制备D-二聚体质控品：用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，添加到多人份混合 血浆中，并加入冻干保护剂，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，定值、分装、冷冻干 燥，即得D-二聚体质控品。
[0037] 其中，缓冲液为Tris-HCl，TrisO. 15mol/L，氯化钠 0? 05mmol/L，pH7. 2 ?7. 8。
[0038] 冻干保护液：5g/L蔗糖、50g/L甘氨酸，lg/L叠氮化钠，10g/L4_羟乙基哌嗪乙磺 酸，0.5g/L苯甲基磺酰氟。
[0039] 实施例3
[0040]D-二聚体质控品的制备方法，包括以下步骤：
[0041] (1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、链激酶加入到缓冲液中，使其浓度依次分 别为0. 05mol/L、1U/ml、5mU/ml，得到的酶复合液在37°C温育10?15分钟；
[0042] (2)制备纤维蛋白凝块：将正常人的混合血浆在37°C温育5?10分钟，与温育的 酶复合液混合，颠倒混匀，37°C温育，使其形成纤维蛋白凝块；
[0043] (3)制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内 的血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37°C温育2小时，纤维蛋白凝块溶解，加入 lOug/ml抑肽酶，以10000g，4°C离心15分钟，收集上清，即得到D-二聚体母液；
[0044] (4)制备D-二聚体质控品：用缓冲液液调整D-二聚体母液浓度，添加到多人份混 合血浆中，并加入冻干保护剂，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，定值、分装、冷冻 干燥，即得D-二聚体质控品。
[0045]其中，缓冲液为Tris-HCl，Tris0? 10mol/L，氯化钠0?lmmol/L，pH7.2 ?7.8。
[0046] 冻干保护液：30g/L蔗糖、30g/L甘氨酸，lOg/L叠氮化钠，13g/L4-羟乙基哌嗪乙磺 酸，0.lg/L苯甲基磺酰氟。
[0047] 对本实施例1到3制得的D-二聚体质控品进行性能测试。
[0048] (1)D-二聚体质控品均一性测定
[0049] 在实施例制备的D-二聚体质控品中分别随机抽取10支，进行准确的复溶重建。
[0050] 使用希森美康CA-1500全自动血凝仪及德国Siemens公司D-二聚体检测试剂对 本方法制备的D-二聚体质控品含量进行检测，计算测试结果的平均值（XI)依次为0.54、 2. 35 ;标准差（S1)依次为0. 02394、0. 03406,结果表1所示：
[0051] 表1D-二聚体含量测定结果（ug/ml)
[0052]
【权利要求】
1. D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、纤维蛋白溶解酶激酶加入到缓冲液中，使其浓 度依次分别为0. 01?0. 05mol/L、l?5U/ml、5?20mU/ml，得到的酶复合液在37°C温育 10?15分钟； (2) 制备纤维蛋白凝块：将多人份混合血浆在37°C温育5?10分钟，与温育的酶复合 液混合，颠倒混匀，37°C温育，使其形成纤维蛋白凝块； (3) 制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内的血浆， 然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37°C温育0. 5?2小时，纤维蛋白凝块溶解，加入丝 氨酸蛋白酶抑制剂，以l〇〇〇〇g，4°C离心15分钟，收集上清，即得到D-二聚体母液； (4) 制备D-二聚体质控品：用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，添加到多人份混合血浆 中，并加入冻干保护剂，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，定值、分装、冷冻干燥，即 得D-二聚体质控品。
2. 根据权利要求1所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为 pH5?10缓冲液，缓冲液为磷酸缓冲液、氨基酸缓冲液、咪唑缓冲液、GOOD缓冲液中的一种。
3. 根据权利要求2所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述的GOOD缓冲 液为 MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、TES、HEPES、Tris-HCl、TAPS 缓冲液中的一种。
4. 根据权利要求3所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为 Tris-HCl 缓冲液，Tris 0? 05 ?0? 15mol/L，氯化钠 0? 05 ?0? 45mmol/L，pH7. 2 ?7. 8〇
5. 根据权利要求1到4任一项所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述 的冻干保护液由以下原料组成，5?30g/L鹿糖、10?50g/L甘氨酸，1?10g/L叠氮化钠， 5?25g/L4_轻乙基哌嘆乙磺酸，0. 01?1. 0g/L苯甲基磺酰氟。
6. 根据权利要求1到4任一项所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述 的纤维蛋白溶解酶激酶为链激酶、组织型纤溶酶原激活物、尿纤溶酶原激活物中的一种。
7. 根据权利要求1到4任一项所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述 的丝氨酸蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟化物、苯甲脒、抑肽酶中的一种。
8. 根据权利要求7所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述的抑肽酶浓 度为1?10ug/ml。
【文档编号】G01N33/53GK104459103SQ201410770542
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】苏娜, 林方昭, 谢兆林, 喻洪跃, 高翠华 申请人:中国医学科学院输血研究所, 成都协和生物技术有限责任公司