人造油体的制作方法

人造油体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种人造油体，该人造油体包含油质蛋白（如上文定义的，该油质蛋白还涵盖钙油质蛋白、固醇油质蛋白以及聚油质蛋白），一种表面活性剂（例如磷脂），以及一种包含脂肪酸（例如具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸）的油。本发明还涉及制备所述人造油体的方法。这些AOB可以进一步包含其他分子，例如生物活性分子，被用于多种多样的产品，并且对于在不存在添加的抗氧化剂的情况下生产氧化稳定的水包油乳液特别有用。本发明进一步涵盖一种用于部分地纯化来自植物提取物的油质蛋白的方法。
【专利说明】人造油体
发明领域
[0001]本发明涉及包含脂肪酸的人造油体，以及制备所述人造油体的方法。这些人造油体可以用于多种多样的产品，并且具体地对于在不存在抗氧化剂的情况下生产氧化稳定的水包油乳液有用。
[0002]发明背景
[0003]脂肪具有高热量的内容物，并且对人类的膳食能量的摄入作出了主要贡献。脂肪的某些类型，例如饱和脂肪和反式脂肪已经牵涉到包括心血管疾病的疾病病症的范围内。然而，脂肪还在人类健康和营养中起着积极作用，并且国际膳食指南允许某一比例的膳食能量来自脂肪，只要该脂肪是‘有益脂肪’。‘有益脂肪’是单不饱和的和多不饱和的油，并且在食物产品中存在着对用更加健康的不饱和油替代饱和脂肪的日益增加的兴趣。此外，很多年来，多不饱和油的一个具体类，称为长链ω-3油，由于众多的健康益处，包括保护对抗已经归因于它们的心血管疾病，已经受到了相当大的关注。受到ω-3油日益增长的健康益处清单的鞭策，全世界的食品工业努力生产用ω-3油加强的食物产品。
[0004]ω-3油加强的食物以及含有高度不饱和油的类似健康食物扩张的主要障碍之一是这些油在储存期间对氧化变质的极度易感性。氧化产生多种产物，其中一些可能具有令人非常讨厌的气味特征，由此降低该产品的适口性和保质期。因此充分地保护这些油不被氧化很重要。虽然微型包封和抗氧化剂的添加已经成功地用作控制食物产品中高度不饱和油氧化的策略，但是这些技术具有与成本、天然性以及普遍适用性相关的若干缺陷。
[0005]植物和油料种子中的油以离散的沉积物，称作油体(OB)的形式发生，不考虑它们存在于其中的植物物种，它们在结构上类似。天然OB值得注意的特征是它们在细胞内以及在分离的制剂两者中的出色的物理稳定性。在这两种情况下，OB发生为个体实体，并且甚至是在长期储存后，当它们彼此加压时，不发生聚集或聚结；体内归因于干燥，并且体外在浮选离心之后(曾(Tzen)以及黄(Huang)，1992)。已经将OB的出色的物理稳定性归因于独特的、称作油质蛋白的两亲性蛋白，该蛋白发生于油体表面(黄，1994)。已经提示，油体的整个表面上被油质蛋白覆盖，使得浓缩的OB在成熟种子的细胞中从不聚结或聚集(曾以及黄，1992)。油质蛋白的含量范围是总油体的从1%_4% ;最大量发生于其中Os最小的种中，例如，油菜/卡诺拉(canola)(黄,1992 ;曾，1993)。
[0006]除良好的物理稳定性之外，油料种子植物中的OB具有抗氧化的天然防护。最近的研究已经示出，这种氧化稳定性延伸到水分散的油体分离物中。菲斯克(Fisk)及其同事(2008)示出，提取自向日葵种子且分散在连续水相中的完整的OB比制备自向日葵种子和乳化剂的等效物乳液 具有更高的抗氧化性。更近地是，已经针对包含高度不饱和十八碳四烯酸的蓝蓟属油体分离物获得了类似的结果(格雷(Gray)等人，2010)。还已经报道了完整的卡诺拉OB水性分散体优于使用吐温40作为乳化剂制备的等效物卡诺拉水包油乳液的氧化稳定性(Shen 和 Wi jesundera, 2009)。
[0007]已经进行了将OB从它们的组分中重新装配的有限的努力。墨菲(Murphy)和康明斯(Cummins)(1989)报告了提取自菜籽油或纯化的油酸甘油酯的TAG与菜籽油体膜材料的孵育导致类似于天然油体尺寸的油稳定小滴的出现。随后，通过将油酸甘油酯与三亚麻油酸甘油酯(1:2摩尔)的TAG混合物与二油酰磷酸卵磷酯和分离自小麦、水稻、油菜籽、大豆或希蒙得木的油质蛋白进行组合，曾以及黄(1992)成功地制备出了物理上稳定的人工(再造)油体(AOB)。然而，似乎尚未对此类人造OB的氧化稳定性进行研究。
[0008]存在着对不依赖于添加的抗氧化剂的使用的、保护脂肪酸不受氧化的手段的需求。
[0009]发明概沭
[0010]包含具有四个或更多个双键的、高水平多不饱和脂肪酸的油，如富含ω3脂肪酸的海产品的油，与植物(例如油料种子植物)中生产的油化学上不同。然而，本发明的诸位发明人出人意料地发现提取自植物饼粉(如商用卡诺拉饼粉)的油质蛋白可用于与高度多不饱和油(如富含ω 3脂肪酸的海产的和/或鱼油)构建人造油体。在此本发明的诸位发明人还出人意料地发现，油体的磷脂组分可以被多种多样的表面活性剂替代，而不会不利地影响氧化稳定性。
[0011]因此，在一个第一方面中，本发明提供了一种人造油体，该人造油体包括油质蛋白、表面活性剂、以及包含多不饱和脂肪酸的油，该脂肪酸具有三个或更多个双键，优选四个或更多个双键。
[0012]在一个实施例中,表面活性剂是磷脂。
[0013]在一个实施例中，该多不饱和脂肪酸的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少25%具有四个或更多个双键。
[0014]在另一个方面中 ，本发明提供了一种人造油体，该人造油体包括油质蛋白、表面活性剂、以及包含脂肪酸的油，其中表面活性剂的至少一些不是磷脂。
[0015]虽然该油质蛋白可以获得自任何来源，在一个优选的实施例中，该油质蛋白是一种油料种子植物的油质蛋白。
[0016]该油也可以获得自任何来源。在一个优选的实施例中，该油是海产品的油和/或鱼油。
[0017]在另一个实施例中，这些脂肪酸的至少50%、至少75%、或至少90%处于甘油酯的形式。
[0018]在一个实施例中，人造油体干重的至少80%、至少90%、或至少95%是油。
[0019]本发明的油体可以用作其他分子的载体，并且因此可以进一步包括，一种或多种其他分子。此类其他分子的实例包括但不局限于，益生菌、防腐剂、治疗剂、诊断剂、递送剂或食物着色剂。
[0020]通过操纵油与油质蛋白的相对浓度可以改变该油体的尺寸，其中油质蛋白的更低相对量促进更大的尺寸。在一个实施例中，该油体具有约0.1至约100 μ m之间、或至少约
0.5至约50 μ m之间、或至少约0.5至约10 μ m之间、或至少约0.5至约2 μ m之间的尺寸。[0021 ] 仍在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括本发明的一种或多种人造油体以及一种载体。在一个实施例中，载体是去离子水。
[0022]在一个实施例中，该组合物是一种水包油乳液。具体地，本发明的水包油乳液比在不存在油质蛋白的情况下使用一种乳化剂(例如如吐温40)生产的、包含脂肪酸的水包油乳液更加抗氧化。[0023]本发明的诸位发明人已经发现本发明的人造油体通常是抗氧化的。因此，在一个实施例中，该人造油体和/或组合物不包括合成的抗氧化剂。此外，在一个优选的实施例中，本发明的人造油体是氧化稳定的。
[0024]在一个实施例中，该人造油体由油质蛋白、表面活性剂、以及包含脂肪酸(例如多不饱和脂肪酸)的油组成，该脂肪酸具有四个或更多个双键。
[0025]除了在治疗剂的递送中有用之外，由于这些油体的脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸的熟知的益处，本发明的人造油体可以用于治疗或预防疾病。因此，在另一个方面中，本发明提供了治疗或预防将从脂肪酸获益的病症的方法，该方法包括向患有该病症的受试者给予本发明的一种或多种油体和/或本发明的组合物。
[0026]还提供了本发明的一种或多种油体和/或本发明的组合物用于制造治疗或预防将从脂肪酸获益的病症的药物的用途。
[0027]此外，提供了本发明的一种或多种油体和/或本发明的组合物作为用于治疗或预防将从脂肪酸获益的病症的药物的用途。
[0028]在上述方法和用途的一个实施例中，该病症可能从具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸中获益。
[0029]这些油体可以用于多种多样的产品中。因此，在另一个方面中，本发明提供了一种产品，该产品包括本发明的一种或多种人造油体，和/或一种组合物。此类产品的实例包括但不局限于，食物或饲料产品、饮品、个人护理产品、药物产品或工业产品。
[0030]在一个优选的实施例中，该产品是，或包括一种水包油乳液。
[0031]还提供了本发明的一种或多种人造油体，和/或本发明的一种组合物用于制备一种产品的用途。
[0032]在另一个方面中，本发明提供了一种制备饲料、食物或饮品的方法，该方法包括将本发明的一种或多种人造油体，和/或本发明的组合物与一种或多种可食用成分进行混
八
口 ο
[0033]在另一个方面中，本发明提供了一种生产人造油体的方法，该方法包括
[0034]i)获得油质蛋白、表面活性剂以及包含具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸的油，并且
[0035]ii)混合该油质蛋白、表面活性剂和油来生产这些人造油体。
[0036]在另一个方面中，本发明提供了一种生产人造油体的方法，该方法包括
[0037]i)获得油质蛋白、表面活性剂以及包含脂肪酸的油，其中该表面活性剂的至少一些不是磷脂，并且
[0038]ii)混合该油质蛋白、表面活性剂和油来生产这些人造油体。
[0039]在一个实施例中，在混合到该油质蛋白中之前，将该表面活性剂混合并溶解于该油中。
[0040]在另一个实施例中，该方法进一步包括，
[0041]iii)选择人造油体。
[0042]本发明的诸位发明人已经对获得用于在本发明人造油体中使用的油质蛋白的方法进行了鉴定。本发明的诸位发明人特别出人意料地发现，可以使用具有相对少量的油质蛋白(例如，总蛋白的约10%)的、包含高度异源的蛋白群体的蛋白提取物，其中该油、表面活性剂和油质蛋白的自然亲和力在形成这些人造油体时貌似是高效的。这是特别有利地，因为它避免了进行大量纯化程序的需要并且提供了油质蛋白的相对廉价的来源。因此，在另一个实施例中，步骤i)包括
[0043]a)获得包含油质蛋白的植物的提取物，并且
[0044]b)从该提取物中至少部分地纯化蛋白，其中该蛋白包括油质蛋白。
[0045]优选地，步骤b)包括
[0046]I)调节该提取物的pH到至少约11.5的pH，
[0047]2)分离I)以产生固相和液相并且选择液相，
[0048]3)降低该液相的pH以沉淀出这些蛋白，
[0049]4)分离3)以产生固相和液相并且选择固相，并且
[0050]5)将该固相分散在一种载体中。
[0051 ] 本发明还提供了通过本发明的方法生产的人造油体。
[0052]在另一个方面中，本发明提供了一种部分纯化来自植物提取物的油质蛋白的方法，该方法包括
[0053]I)调节该提取物的pH到至少约11.5的pH，
[0054]2)分离I)以产生固相和液相并且选择液相，
[0055]3)降低该液相的pH以沉淀出这些蛋白，
[0056]4)分离3)以产生固相和液相并且选择固相，并且
[0057]5)将该固相分散在一种载体中。
[0058]在一个实施例中，步骤3)包括将该液相的pH降低为低于约7，至约pH4至约7，或约pH5.5至约7。
[0059]优选地，上述两个方面的方法不使用有机溶剂。
[0060]该提取物可以来自任何植物，如植物饼粉。然而，在一个优选的实施例中，该植物是油料种子植物。
[0061]本发明的诸位发明人还已经发现，从植物材料(例如，油料种子植物的种子)的油的提取物获得的饼粉可以用作油质蛋白的来源。作为所要求的发明的一个添加的益处，在该油质蛋白进行部分纯化之后，剩余的植物提取物可以用作动物饲料。因此，在一个优选的实施例中，该提取物是油提取之后产生的饼粉。
[0062]本发明还提供了通过本发明的方法生产的、至少部分纯化的油质蛋白。
[0063]除非确切地陈述是其他情况，在此的任何实施例都可以拿来加以必要修改适用于任何其他实施例。
[0064]本发明不局限于在此描述的特定实施例的范围内，这些实施例仅意在出于示例性的目的。如在此描述，功能等效物产品、组合物以及方法清楚地在本发明范围内。
[0065]贯穿本说明书，除非另外确切地陈述或上下文要求是其他情况，参考一个单一的步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组将被视为涵盖那些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组中的一个和多个(即一个或多个)。
[0066]在下文中通过以下非限制性实例和参考附图的方式描述本发明。
_7]附图简要说明
[0068]图1:用于从卡诺拉饼粉中提取油质蛋白的程序。[0069]图2:提取自卡诺拉饼粉的油质蛋白的电泳分析。
[0070]图3:提取介质的pH对来自卡诺拉饼粉的油质蛋白的恢复的影响。
[0071]图4:在不同pH值提取的油质蛋白的电泳分析。泳道2和3-ρΗΙΟ.5;泳道4和5-pHll.0 ;泳道 6 和 7-pHll.5 ;泳道 8 和 9_pH12.0。 [0072]图5:针对经受加速自氧化(60°C)的吐温40和油质蛋白乳液，D[3，2}和d (0.5)的颗粒尺寸(μπΟ的变化。平均数据来自重复测量。
[0073]图6:人造金枪鱼油体的表面蛋白的电泳分析。泳道:M-标记，未经加工的ΡΗ12-提取自卡诺拉饼粉的、ρΗ12可溶性粗蛋白，CPl -提取自制作自卡诺拉油的人造卡诺拉油体的蛋白以及重新溶解的ΡΗ6.5-沉淀的卡诺拉饼粉蛋白，CPl+PLs-提取自制作自卡诺拉油的人造卡诺拉油体的蛋白，重新溶解的PH6.5-沉淀的卡诺拉饼粉蛋白，以及磷脂。
[0074]图7:在分别用吐温40与油质蛋白提取物制备的金枪鱼油乳液的加速氧化过程中的反式，反式，2，4，庚二烯醛的发展。平均数据来自重复测量。7A-在60°C下的氧化；7B-在40°C下的氧化。
[0075]图8:在60°C下的储存过程中，在(分别)用吐温40与油质蛋白提取物制作的金枪鱼油乳液中的EPA和DHA的损耗。平均数据来自重复测量。8A-在60°C下的氧化；8B-在40°C下的氧化。
[0076]图9:提取自金枪鱼油人造油体乳液和等效的吐温40乳液的油在40°C下经受加速氧化的过氧化值(PV)。
[0077]图10:在分别通过油质蛋白、Isolexx、和酪蛋白钠稳定化的金枪鱼油乳液的加速储存(40°C，空气)过程中的反式，，反式，2，4，庚二烯醛的发展。
[0078]图11:在使用油质蛋白与分别作为次级表面活性剂的单酰甘油(MAG)、吐温40(吐温)、以及硬脂酰乳酸钠(SSL)组合制备的金枪鱼油乳液的加速储存(40°C，空气)过程中的反式，反式，2，4，庚二烯醛的发展。
[0079]序列表的关键
[0080]SEQ ID NOl:欧洲油菜(Brassica napus)油质蛋白(CAA57545.1)
[0081]SEQ ID N02:欧洲油菜油质蛋白 Sl-1 (ACG69504.1)
[0082]SEQ ID N03:欧洲油菜油质蛋白 S2-1 (ACG69503.1)
[0083]SEQ ID N04:欧洲油菜油质蛋白 S3-1 (ACG69513.1)
[0084]SEQ ID N05:欧洲油菜油质蛋白 S4-1 (ACG69507.1)
[0085]SEQ ID N06:欧洲油菜油质蛋白 S5-1 (ACG69511.1)
[0086]SEQ ID N07:花生(Arachis hypogaea)油质蛋白 I (AAZ20276.1)
[0087]SEQ ID N08:花生油质蛋白 2 (AAU21500.1)
[0088]SEQ ID N09:花生油质蛋白 3 (AAU21501.1)
[0089]SEQ ID NOlO:花生油质蛋白 5 (ABC96763.1)
[0090]SEQ ID NOll:蓖麻(Ricinus communis)油质蛋白 I (EEF40948.1)
[0091]SEQ ID N012:蓖麻油质蛋白 2 (EEF51616.1)
[0092]SEQ ID N013:大豆(Glycine max)油质蛋白异构体 a (P29530.2)
[0093]SEQ ID N014:大豆油质蛋白异构体b (P29531.1)
[0094]SEQ ID N015:亚麻(Linum usitatissimum)油质蛋白低分子量异构体(ABB01622.1)
[0095]SEQ ID N016:亚麻油质蛋白高分子量异构体(ABB01624.1)
[0096]SEQ ID N017:向日葵(Helianthus annuus)油质蛋白(CAA44224.1)
[0097]SEQ ID N018:玉蜀黍(Zea mays)油质蛋白(ΝΡ_001105338.I)
[0098]SEQ ID Ν019:欧洲油菜固醇油质蛋白(ΑΒΜ30178.1)
[0099]SEQ ID Ν020:欧洲油菜固醇油质蛋白 SL01-1 (ACG69522.1)
[0100]SEQ ID Ν021:欧洲油菜固醇油质蛋白 SL02-1 (ACG69525.1)
[0101]SEQ ID Ν022:芝麻(Sesamum indicum)固醇油质蛋白(AAL13315.1)
[0102]SEQ ID N023:玉蜀黍固醇油质蛋白(NP_001152614.1)
[0103]SEQ ID N024:欧洲油菜钙油质蛋白 CL0-1 (ACG69529.1)
[0104]SEQ ID N025:欧洲油菜钙油质蛋白 CL0-3 (ACG69527.1)
[0105]SEQ ID N026:芝麻钙油质蛋白(AAF13743.1)
[0106]SEQ ID N027:玉蜀黍钙油质蛋白(ΝΡ_001151906.I)
[0107]发明详细说明
[0108]通用技术和定义
[0109]除非确切地另外定义，在此使用的所有技术和科学术语应视为对于本领域(例如，脂质化学、分子遗传学、化学、以及生物化学)普通技术人员的共同理解具有相同的意思。
[0110]除非另外指明，在本发明中利用的重组蛋白、细胞培养、以及免疫技术都是本领域的普通技术人员所熟知的标准程序。此类技术描述并解释于以下来源的全部文献中，如帕柏(J.Perbal),《分子克隆使用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning),约翰威利父子出版社(John Wiley and Sons) (1984),萨姆布鲁克(J.Sambrook)等人，《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press) (1989),布朗(T.A.Brown)(编者)，《基础分子生物学:实用方法》(Essential Molecular Biology:A Practical Approach),第 I 卷和第2卷，IRL出版社(1991)，格洛夫(D.M.Glover)和哈姆斯(B.D.Hames)(编者)，〈〈DNA克隆:实用方法》(DNA Cloning:A Practical Approach), 1-4 卷，IRL 出版社(1995 和 1996),以及奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人(编者)，《分子生物学当前技术》(Current Protocolsin Molecular Biology),格林出版社联合威利出版社(Greene Pub.Associates andffiley-1nterscience) (1988,包括直至现在的所有更新)。
[0111]术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应当被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应当被视为对两种含义或任一种含义提供明确支持。
[0112]如在此使用的，除非相反地陈述，术语约是指定值的+/_20%、更优选+/-10%，甚至更优选+/-5%。
[0113]贯穿本说明书，“包含(或包括)(compri se ) ” 一词或其变化形式(例如“包含了(或包括了)(comprises)”或“包含着(或包括着)(comprising)”)应被理解为意指包括所陈述的要素、完整的事物或步骤、或者多个要素、多个完整的事物或多个步骤的群组，但不排除任何其他要素、完整的事物或步骤、或者多个要素、多个完整的事物或多个步骤的群组。
[0114]油和脂肪酸
[0115]如在此使用的，术语“脂肪酸”是指长度上具有至少8个碳原子的长脂肪族尾部的、饱和亦或不饱和的羧酸。典型地，脂肪酸在长度上具有至少12个碳的一个碳-碳键链。大部分天然发生的脂肪酸具有偶数个碳原子，因为它们的生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。这些脂肪酸可以处于游离状态(未酯化的)或处于酯化形式，例如TAG、DAG、MAG、酰基-CoA (硫代酯)结合、或其他共价结合形式的一部分。当共价结合处于酯化形式时，该脂肪酸在此称为“酰基”基团。饱和脂肪酸不包含任何双键或沿着该链的其他官能团。术语“饱和的”是指氢，其中在所有碳中(除羧酸[-C00H]基团之外)包含尽可能多的氢。换言之，omega ( ω )端包含3个氢(CH3-)并且该链中的每个碳包含2个氢(CH2-)。不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸具有类似的形式，除了沿着该链存在一个或多个亚烷基官能团之外，其中，每个亚烷基用双键的“-CH=CH_”部分取代该链的单键“-CH2-CH2-”部分(B卩，一个碳双键合到另一个碳上)。在该链中的、键合至该双键的另一侧的这两个邻近的碳原子能以顺式或反式构型存在。除了双键之外，脂肪酸的酰基链可以具有三键，酰基侧链，例如甲基或乙基，羟基或本领域中已知的其他改性。本发明的人造油体可以包括脂肪酸，例如但不局限于，硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、-亚麻酸、或其两个或更多个的组合。
[0116]如在此使用的，术语“多不饱和脂肪酸”或“PUFA”是指在其碳链中包含至少18个碳原子以及至少三个、更优选地至少四个亚烷基(碳-碳双键)的脂肪酸。本发明一方面涉及包含具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)的人造油体。此类PUFA的实例包括但不局限于，十八碳四烯酸(SDA、18:4A6、9、12、15、ω 3)，花生四烯酸(ARA、20:4 Λ 5、8、
11、14;(0 6)，二十碳四烯酸化丁八、20:4八8、11、14、17、ω 3)，二十碳五烯酸(ΕΡΑ、20:5 Λ 5、
8、11、14、17 ;ω3)，二十二碳五烯酸(DPA、22:5 Λ 7、10、13、16、19、ω3)，二十二碳六烯酸(DHA、22:6 Λ 4、7、10、13、16、19、ω 3)，及其两个或更多个的混合物。这些人造油体可以进一步包括其他脂肪酸，例如上文描述的那些，具有，例如，两个或更少的双键、三键、侧链，例如甲基、羟基、和/或环氧化 物基团。
[0117]脂肪酸可以处于游离状态(未酯化的)或处于酯化形式，如甘油三酸酯、二酰基甘油酯、单酰甘油、酰基-CoA结合或其他结合形式的一部分，或其两个或更多个的混合物。该脂肪酸可以被酯化为一种磷脂，例如卵磷脂、脑磷脂、丝氨酸磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或双磷脂酰甘油形式。
[0118]如在此使用的，术语“甘油酯”包括选自下组的脂质，该组由以下各项组成:甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷酸甘油酯及其组合。更优选地，该甘油酯选自甘油三酯和甘油二酯组成的组。最优选地，该甘油酯是甘油三酯油。
[0119]“三酰甘油”或(TAG)是其中甘油被三个脂肪酸酯化了的甘油酯。在TAG合成的肯尼迪途径中，前体sn-甘油-3-磷酸盐在sn-Ι位置处在由甘油_3_磷酸酰基转移酶催化的反应中通过脂肪酸辅酶A酯被酯化以形成溶血磷脂酸(LPA)，并且其进一步在sn-2位置处通过酰基甘油磷酸酰基转移酶酰化以形成磷脂酸。磷酸基通过酶磷脂磷酸水解酶去除并且生成的1，2- 二酰基-sn-甘油被酰化以形成三酰基-sn-甘油。
[0120]在一个实施例中，该油的甘油酯(优选地，TAG)内容物基本上包括这些脂肪酸的全部(例如，至少75%、或至少90%、或至少95%)。
[0121]包含多种脂肪酸的油可以获得自多种多样的来源，包括微生物(包括酵母)、甲壳动物、鱼、动物以及植物。该有机体可以是或不是遗传改性的。
[0122]在一个实施例中，在这些人造油体中存在种子油。如在此使用，术语“种子油”是指获得自包含至少60% (w/w)脂质的植物的种子/谷物的，或如果种子油仍然存在于该种子/谷物中，从种子/谷物可获得的组合物。也就是说，种子油包括存在于该种子/谷物或其部分中的种子油，连同已经从该种子/谷物中提取出的种子油。该种子油优选地是提取的种子油。种子油在室温下典型地是液体。优选地，种子油中的总脂肪酸(TFA)内容物主要包括(>50%)长度上至少16个碳的脂肪酸。更优选地，种子油中的总脂肪酸的至少50%是C18脂肪酸，例如，油酸。这些脂肪酸典型地处于酯化的形式，例如像，TAG、DAG、酰基-CoA或磷脂。这些脂肪酸可以是游离脂肪酸和/或处于酯化的形式。在一个实施例中，在这些人造油体中的种子油是“基本上纯净的”或“纯净的”油，这些油已经与该种子或粗提取物中相关的一种或多种其他脂质(除磷脂之外)、核酸、多肽(除油质蛋白之外)、或其他污染分子分离。优选地，该基本上纯净的种子油至少60%不含、更优选地至少75%不含、并且更优选地至少90%不含与该种子或提取物中相关的其他组分。种子油可以进一步包括非脂肪酸分子，例如但不局限于，固醇类和酚类。在一个实施例中，种子油是卡诺拉油(欧洲油菜、芜青类物种(Brassica rapa ssp.)),芥菜油(芥菜(Brassica juncea)),其他芥属植物油(Brassica oil)(例如，完菁甘蓝(Brassica napobrassica)、芥属亚麻芥属(Brassicacamelina)),向日葵油(向日葵),亚麻籽油(亚麻),大豆油(大豆),红花油(红花(Carthamustinctorius)),玉米油(玉蜀黍)，烟草油(普通烟草(Nicotiana tabacum)),花生油(Arachis hypogaea),棕榈油(棕榈(Elaeis guineensis)),棉籽油(陆地棉(Gossypiumhirsutum)),椰子油(椰子(Cocos nucifera)),鳄梨油(油梨(Persea americana)),撤榄油(橄榄(Olea europaea)),腰果油(腰果(Anacardium occidentale)),澳洲坚果油(Macadamia intergrifolia),扁桃仁油(扁桃(Prunus amygdalus)),燕麦种子油(燕麦(Avena sativa)),米糠油(稻(Oryza sativa)或非洲栽培稻(Oryza glaberrima)),或拟南芥属种子油(拟南芥(Arabidopsis thaliana))。可以通过本领域中已知的任何方法从种子/谷物中提取种子油。这典型地涉及通常与这些种子的第一次破碎相关联的、用非极性溶剂(例如二乙醚、石油醚、氯仿/甲醇或丁醇混合物)进行的提取。与谷物中淀粉相关联的脂质可以用水饱和的丁醇进行提取。该种子油可以通过本领域中已知的方法“脱胶”，以去除多糖类或以其他方式进行处理，以去除污染或改进纯度、稳定性、或颜色。可以将该种子油中的TAG以及其他酯类水解以释放游离脂肪酸，或如本领域中已知的进行化学或酶处理将该种子油氢化。
[0123]如在此使用，“海产品的油”是获得自生活在盐水中的有机体，特别是海洋微藻、鱼或甲壳动物的油。因此，用于在本发明中使用的油可以是海洋油或衍生自咸水鱼的鱼油。
[0124]包含具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸的油可以从任何来源获得，例如提取自海洋微生物、甲壳动物、鱼或转基因有机体(例如转基因植物或酵母)的油，这些转基因有机体包含外源多核苷酸，这些外源多核苷酸能够使得这些有机体合成具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸。PUFA可以从其中获得的海洋微生物的实例包括但不局限于，前沟藻属(Amphidinium)、双眉藻属(Amphora)、星杆藻属(Asterionella)、盒形藻属(Biddulphia)、角藻属(Ceratium)、角毛藻属(Chaetoceros)、小球藻属(Chlorella)、蓝隐藻属(Chroomonas)、旋沟藻属(Cochlodinium)、Crisphaera、隐甲藻属(Crypthecodinium)、隐藻属(Cryptomonas)、小环藻属(Cyclotella)、筒柱藻属(Cylindrotheca)、Duniella、圆石藻属(Emiliania)、脆杆藻属(Fragilaria)、光甲藻属(Glenodinium)、膝沟藻属(Gonyaulax)、Gyrodinium、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)、异毛藻属(Heteromastix)、等边金藻属(Isochrysis)、娄氏藻属(Lauderia)、单鞭金藻属(Monochrysis)、蒜头藻属(Monodus)、Moritella、被孢霉属(Mortierella)、微绿球藻属(Nannochloris)、Nannochloropis、舟形藻属(Navicula)、菱形藻属(Nitzschia)、齿状藻属(Odontella)、滑盘藻属(Olisthodiscus)、巴夫藻属(Pavlova)、多甲藻属(Peridinium)、褐指藻属(Phaeodactylum)、紫球藻属(Porphyridium)、原甲藻属(Prorocentrum)、假柄钟藻属(Pseudopedinella)、Rhodella、Rhododomas> 裂殖壶菌(Schizochytrium)、Skelentonema、福节藻属(Stauroneis)、四爿藻属(Tetraselmis)、海链藻属(Thalassiosira)、Thrautochytrium、或Ulkenia的物种。对本发明有用的鱼油的实例包括但不局限于，金枪鱼油(tuna oil)、鲣鱼油(bonito oil)、海S卢鱼油(seabass oil)、大比目鱼油(halibut oil)、旗鱼油(spearfish oil)、梭鱼油(barracudaoil)、鍾鱼油(cod oil)、步鱼油(menhaden oil)、沙丁鱼油(sardine oil)、沙脑沙丁鱼油(pilchard oil)、餅鱼油(anchovy oil)、 毛鱗鱼油(capelin oil)、大西洋鍾鱼油(Atlantic cod oil)、大西洋鲱鱼油(Atlantic herring oil)、大西洋鲭鱼油(Atlanticmackerel oil)、大西洋步鱼油(Atlantic menhaden oil)、鲑鱼油(salmonids oil)、藍鱼油(shark oil )、鱿鱼油(squid oil )、章鱼油(octopus oil )、憐奸油(krill oil)、海豹油(seal oil)、鲸油(whale oil)等等,包括它们的混合物和组合。生产具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸的转基因有机体的实例描述于，例如，W02005/103253、W02007/106905, W02010/023202, W02010/057246 和 W02012/000026 中。
[0125]如上文指出，在本领域中常规实践的技术可以用于提取并加工由细胞、植物、种子等生产的油。例如，油提取可以包括脱胶(或酸处理)、中和(或碱处理)、水洗、脱色、过滤、除臭、精制(polishing)和/或冷却(或冬化)。优选地纯化包括酸处理和/或碱处理(脱胶和中和)。可替代地，纯化方法可以包括脱色和/或除臭。然而，优选地，纯化通常将包括脱色和/或除臭，并且此外可任选地包括酸和碱处理。
[0126]油质蛋白
[0127]油质蛋白是存在于种子贮藏组织内的油体膜中的疏水蛋白(参见，例如，黄，1996 ；林(Lin)等人，2005 ;卡普阿诺(Capuano)等人，2007 ;吕(Lui )等人，2009 ；岛田(Shimada)以及哈如阿-西村由纪江(Hara-Nishimura)，2010)。它们具有低MW (15-26，000),并且在油料种子植物中丰富。在每一物种的种子中，通常存在两种或更多种不同MW的油质蛋白。每个油质蛋白分子包含一个相对亲水的N-端结构域(例如，约48个氨基酸残基)、一个中心完全疏水的结构域(例如，具有约70-80个氨基酸残基)以及在C-端处或靠近C-端的一个两亲-螺旋结构域(例如，约具有约33个氨基酸残基)，特别地，该完全疏水的结构域富含脂肪族氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸。通常地，这些疏水残基的中心延伸被插入到脂质核中并且该两亲N-端和/或两亲C-端位于这些油体的表面上，其中带正电荷的残基包埋在表面活性剂单层中并且带负电荷的残基暴露于外部。
[0128]如在此使用，术语“油质蛋白”涵盖结合钙的钙油质蛋白，以及结合固醇的固醇油质蛋白，连同聚油质蛋白(斯科特(Scott)等人，2010)。然而，如果不是全部，通常大部分的本发明的人造油体的油质蛋白将是钙油质蛋白和/或固醇油质蛋白。此外，如在此使用，术语“油质蛋白”是指同源种群的相同油质蛋白蛋白，亦或更加典型地，异源种群的不同油质蛋白蛋白。
[0129]已知来自大量不同植物物种的油质蛋白蛋白序列以及用于对其进行编码的核苷酸序列的基本数量。实例包括但不局限于，来自以下的油质蛋白:拟南芥属、卡诺拉、玉米、稻、花生、蓖麻、大豆、亚麻、葡萄、卷心菜、棉花、向日葵、高粱以及大麦。在序列表中提供了这些油质蛋白的一些的实例。因此，在一个实施例中，该油质蛋白包括选自以下的一个序列:
[0130]a)如在SEQ ID NOl至27的任一个中提供的一个氨基酸序列，
[0131]b)与SEQ ID NOl至27的任意一个或多个具有至少50%同一性，更优选地至少60%、更优选地至少70%、更优选地至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%同一性的一个氨基酸序列，以及 [0132]c)a)或b)的一个生物活性片段。
[0133]在另一个实施例中，该油质蛋白包括选自以下的一个序列:
[0134]a)如在SEQ ID NOl至18的任一个中提供的一个氨基酸序列，
[0135]b)与SEQ ID NOl至18的任意一个或多个具有至少50%同一性，更优选地至少60%、更优选地至少70%、更优选地至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%同一性的一个氨基酸序列，以及
[0136]c)a)或b)的一个生物活性片段。
[0137]通过GAP (尼德曼(Needleman)以及翁施(Wunsch)，1970)分析(GCG程序)确定蛋白的同一性％，其中缺口产生罚分=5，并且缺口延伸罚分=0.3。查询序列在长度上具有至少50个氨基酸，并且GAP分析在至少50个氨基酸区域上比对这两个序列。更优选地，该查询序列在长度上具有至少100个氨基酸，并且GAP分析在至少100个氨基酸区域上比对这两个序列。甚至更优选地，该查询序列在长度上具有至少250个氨基酸，并且GAP分析在至少250个氨基酸区域上比对这两个序列。甚至更优选地，该GAP分析在其全长上比对这两个序列。
[0138]如在此使用，“生物活性的”片段是可以用于制备本发明人造油体的油质蛋白的一部分。生物活性片段可以是任意尺寸，只要它们维持所定义的活性。
[0139]在一个优选的实施例中，该油质蛋白获得自一种油料种子植物，例如但不局限于卡诺拉(芥属物种(Brassica spp.))、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)、油棕(Elaeis guineeis)、棉籽(棉属物种(Gossypium spp.))、花生(Arachis hypogaea)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Ricinus communis)、红花(Carthamus tinctorius)、芥子(芥属物种以及白芥子(Sinapis alba))、芫荽(Coriandrum sativum)、笑瓜(Cucurbitamaxima)、亚麻杆 / 亚麻(Linum usitatissimum)、巴西坚果(Bertholletia excelsa)、希蒙得木(霍霍巴(Simmondsia chinensis))或玉蜀黍(Zea mays)。
[0140]该油质蛋白可以获得自天然、合成或重组体来源。有利地，该油质蛋白可以获得自天然来源，例如植物提取物，特别是油提取之后的油料种子植物的饼粉。图1示出为一个用于从植物饼粉(例如卡诺拉饼粉)中提取油质蛋白的程序的实例。约50%的卡诺拉饼粉蛋白已经被报道为在PH6.0-7.0沉淀出(马纳姆皮瑞(Manamperi)等人，2010)。卡诺拉饼粉典型地包含高达40%的、主要来自于种子细胞蛋白的蛋白。机械压榨的商用的油提取方法之后是溶剂提取，破坏了卡诺拉油体结构，由此将油质蛋白释放到相对更加丰富的细胞蛋白的混合物中。由于卡诺拉油质蛋白的等电点是6.5，因此在pH6.0-7.0范围内的沉淀出的蛋白包含除细胞蛋白外的油质蛋白。
[0141]该油质蛋白还可以获得自重组体来源，具有导致增强的油质蛋白生产水平的、编码油质蛋白的一个或多个外源基因的植物，亦或包含一个或多个外源基因但不天然生产油质蛋白的重组有机体，例如重组酵母。生产油质蛋白和/或具有增强的油质蛋白水平的重组有机体的生产很好地在本领域普通技术人员的能力之内(参见，例如，洛克斯(Roux)等人，2004 ;阿贝尼斯(Abenes)等人，1997 ;巴哈塔拉(Bhatla)等人，2010)。 [0142]可以通过将适当的核苷酸变化导入到编码油质蛋白的核酸中，或者通过体外合成所希望的蛋白来制备天然发生的油质蛋白的氨基酸序列突变体。此类突变体包括，例如，残基在该氨基酸序列之内的缺失、插入或置换。可以做出缺失、插入和置换的组合以达到最终构建体，条件是该最终蛋白产物具有所希望的特征。天然发生的油质蛋白的功能突变体的产生和鉴别也很好地在本领域普通技术人员的能力之内。
[0143]还包括在本发明范围内的是在合成过程中或合成后区别修饰的蛋白，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶剪切、连接到抗体分子或其他细胞配体上、等。
[0144]可以使用领域内已知的技术或使用本发明的方法来制备油质蛋白。在一个实施例中，通过以下方法制备呈粗提取物的油质蛋白
[0145]I)调节该提取物的pH到至少约11.5的pH,
[0146]2)分离I)以产生固相和液相并且选择液相，
[0147]3)降低该液相的pH以沉淀出这些蛋白，
[0148]4)分离3)以产生固相和液相并且选择固相，并且
[0149]5)将该固相分散在一种载体中。
[0150]在一个替代的实施例中，使用过滤法至少部分地纯化来自植物材料的油质蛋白。
[0151]表面活性剂
[0152]本发明的人造油体包括一种或多种表面活性剂。
[0153]该表面活性剂可以是非离子的或阴离子表面活性剂或其两者或更多者的组合。更具体地，该表面活性剂可以是阴离子的、阳离子的、兼性离子的或其两者或更多者的一个组合。例如该表面活性剂可以选自但不局限于下组，该组由以下各项组成:磷脂、甘油单酯、全氟辛酸酯(PF0A或PF0)、全氟辛烷磺酸酯(PF0S)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵、以及其他烷基硫酸盐、月桂基醚硫酸钠、也称作十二烷基醚硫酸钠(SLES)、烷基苯磺酸盐、肥皂、或脂肪酸盐、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB )、十六烷基三甲基溴化铵、以及其他烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基嘧啶(CPC)、聚乙氧基化牛油胺(Ρ0ΕΑ)、氯化苄烷铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、十二烷基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、Coco ampho glycinate、烷基聚(氧化乙烯)、烷基酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)与聚(氧化丙烯)的共聚物(商业上称作泊洛沙姆或Poloxamines)、烷基多聚葡糖苷，包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷、脂肪醇、鲸蜡醇CA)、聚(乙烯醇)(PVA)、油醇、椰子油酰胺MEA、椰子油酰胺DEA、聚山梨醇酯如吐温20、吐温40、吐温80、以及十二烷基二甲基氧化胺。[0154]在一个实施例中，该表面活性剂是一种磷脂。然而，当该脂肪酸不是具有至少四个双键的多不饱和脂肪酸时，一个优选的实施例是，该人造油体不包含磷脂或与至少一种其他表面活性剂一起存在的磷脂(例如，在该人造油体中，该至少一种其他表面活性剂包括总表面活性剂的至少5%、或至少25%、或至少50%、或至少75%、或至少90%)。
[0155]磷脂是一类脂质并且是所有细胞膜的主要组分，因为它们可以形成脂双层。大多数磷脂含有一个甘油二酯、一个磷酸基以及一个简单的有机分子，例如胆碱。这个规则的一个例外是鞘磷脂，其衍生自鞘氨醇而不是甘油。
[0156]对本发明有用的磷脂的实例包括但不局限于，磷脂酰乙醇胺、磷酸卵磷酯、卵磷月旨、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇以及它们的两个或更多个的混合物。
[0157]用于本发明油体生产的磷脂可以来自不同的来源，例如，来自种子，并且更加典型地，来自油料种子植物。这些包括卵磷脂以及溶血卵磷脂。例如，该卵磷脂可以获得自大豆(大豆卵磷脂)或向日葵(向日葵卵磷脂)。额外地，可以使用具有改性的脂肪酸组合物的磷脂。此类磷脂可以是,例如,酶改性的大豆磷脂。例如,可以从大豆磷脂(SLP ;True Lecithin公司，日本三重县)，通过用磷脂酶A2 (Novo Industry公司，丹麦，Bagsvaerd)进行处理制备酶改性的大豆磷脂。额外地，可以从已经被遗传改性以生产具有改性的脂肪酸组合物的磷脂的植物或植物种子中获得具有改性的脂肪酸组合物的磷脂。具有改性的脂肪酸组合物的磷脂的一个实例是具有改 性的脂肪酸组合物的卵磷脂。本领域中熟知的其他方法也可用于改性磷脂的脂肪酸组合物。
[0158]围绕该油体的脂质核的表面活性剂层通常是一个单层。
[0159]可以使用允许这些人造油体形成的表面活性剂的任何浓度。
[0160]人诰油体
[0161]如在此使用的，术语“人造油体”是指典型地在约0.1至约100 μ m尺寸之间的一种结构，该结构包括由一个表面活性剂层围绕的一种油，其中油质蛋白包埋在该表面活性剂层中。它们被称作人造的是因为没有证据表明本发明的这些油体是自然界中存在的。虽然如此，本发明的“人造油体”还可以称作“油体”。
[0162]典型地，本发明的人造油体包括约90%至约98.5%的甘油酯，约0.2%至约5%的表面活性剂以及约0.5%至约5%的蛋白。例如，本发明的一种典型的人造油体包括约97.5/1.0/1.5的比率的油/表面活性剂/油质蛋白。如在此示出，降低油质蛋白的浓度导致该油体尺寸增加。
[0163]在一个实施例中，这些脂肪酸的至少10%、更优选地至少20%、更优选地至少30%是具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸。例如，由Numega公司生产的H1-DHA金枪鱼油具有约37%的PUFA，而由马泰克(Martek)公司生产的海藻油DHASCO具有约61%的PUFA。
[0164]在另一个实施例中，这些脂肪酸的至少10%、更优选地至少20%是DHA。例如，由Numega公司生产的H1-DNA金枪鱼油具有约26%的DHA，而由马泰克公司生产的海藻油DHASCO 具有约 40% 的 DHA。
[0165]使用自动搅拌器在SOOrpm操作30分钟，通过将油、表面活性剂以及油质蛋白与水(例如)混合制备一种预乳液可以获得这些油体。有利地，这些油质蛋白可以被提供为使用本发明方法获得的提取自植物的一种蛋白。在一个实施例中，在本发明的这些方法中使用之前，将该油质蛋白储存为，例如像，通过冷冻干燥生产的一种粉末。[0166]本发明的人造油体是氧化稳定的。例如，当这些油体在40°C储存15天时，在这些人造油体中的这些脂肪酸，例如EPA和DHA的总浓度减少小于40%、更优选地小于30%、更优选地小于20%、并且甚至更优选地小于15%。在另一个实例中，在40°C储存15天之后，这些油体包含小于6、更优选地小于5、并且甚至更优选地小于4 μ g/ml的反式，反式-2，4-庚二烯醒。仍在另一个实例中，在40°C 5天之后,产生了小于90meq/kg油、更优选地小于50meq/kg油、更优选地小于25meq/kg油的氢过氧化物。
[0167]包含人造油体的产品及其用途
[0168]这些油体可以在多种多样的产品中使用。此类产品的实例包括但不局限于，食物或饲料产品、饮品、个人护理产品、药物产品或工业产品。这些产品的生产方法是本领域中所熟知的。
[0169]在一个优选的实施例中，本主题发明针对可以被动物和/或人类摄取的产品。由于这些组合物可以被摄取，它们必须具有食物级质量。然而，具体的产品以及这些油体应用的具体形式并非至关重要的并且可以是如所希望的。食物、饲料或饮品的实例包括但不局限于，非乳制的替代物、非乳制的乳酪、非乳制的酸牛乳、人造黄油、蛋黄酱、油醋汁(vinaigrette)、糖霜(icing)、乳膏、汤、冰淇淋(例如，作为一种稳定剂)、色拉调味汁、芥子、糖果、白色调味酱、口香糖、布丁、烘焙产品、调味品、榨汁(例如，作为一种天然的浑浊剂)、婴儿配方奶粉(baby formula)、香料载体(flavour carrier)、纹理剂、鱼食、宠物食品以及牲畜饲料。
[0170]个人护理产品的实例包括但不局限于，肥皂、美容产品、护肤膏、面霜、牙膏、唇膏、香水、化妆品、粉底、腮红、睫毛膏、眼影、防晒露以及护发产品。
[0171]药物产品的实例包括但不局限于，治疗剂、诊断剂和递送剂。
[0172]该治疗剂或诊断剂可以是希望递送到宿主的分子。在一个实施例中，该活性成分可以是具有治疗或诊断价值的蛋白或肽。此类肽包括抗原(用于疫苗制剂)、抗体或抗体相关分子、细胞因子、凝血因子以及生长激素。
[0173]工业产品的实例包括但不局限于，油漆、涂料、润滑剂、膜、凝胶、钻井液、黏纸胶料、胶乳、建筑物或马路建筑材料、墨水、染料、蜡、抛光剂和农用化学品制剂。
[0174]由于本发明油体中的这些脂肪酸的熟知的益处，本发明的人造油体可以被用于治疗或预防疾病。因此，在另一个方面中，本发明提供了治疗或预防将从脂肪酸获益的病症，特别是从具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸获益的方法，该方法包括向患有该病症的受试者给予本发明的一种或多种油体和/或本发明的组合物。此类病症的实例包括但不局限于，心律失常、血管成形术、炎症、哮喘、银屑病、骨质疏松症、肾结石、AIDS、多发性硬化症、类风湿关节炎、克罗恩氏病、精神分裂症、癌症、胎儿酒精综合症、注意力不足过动症、囊性纤维病、苯酮尿症、单相抑郁、攻击性敌对倾向(aggressive hostility)、肾上腺脑白质营养不良、冠心病、高血压(hypertension)、糖尿病、肥胖症、阿尔茨海默氏症、慢性阻塞性肺病、溃瘍性结肠炎、血管成形术后狭窄、湿疫、高血压(high blood pressure)、血小板聚集、胃肠出血、子宫内膜组织异位、经前期综合征、肌痛性脑脊髓炎、病毒感染后的慢性疲劳或眼病。
[0175]在一个实施例中，这些油体或组合物通过口服给予提供。典型地，这些油体以每次给予事件足以递送至少IOmg脂肪酸(如co-3PUFA)的量进行给予。更优选地，每次给予事件递送至少30mg,甚至更优选地至少50mg并且最优选地在IOOmg的脂肪酸(如co-3PUFA)。
[0176]将理解，本发明可以适用于治疗动物，例如哺乳动物。最优选地，本发明用于治疗人类。
[0177]在一个优选的实施例中，该产品是，或包含，一种水包油乳液。本发明的此类乳液是物理和氧化稳定的，并且静置时不发生聚结。
[0178]可以使用本领域中已知的技术将这些油体配制成一种乳液。优选地，向该油体制剂中添加至少一种额外的成分。该额外的成分可以作为溶液、悬浮液、凝胶或固体进行添加，并且该额外的成分的数量将取决于制剂。该额外的成分可以根据制剂变得与这些油体相关联，依然悬浮于溶液中，或形成一种这些油体在其中分散的悬浮液。该成分还可以渗透围绕该油体的表面活性剂层。可以渗透该油体的成分包括油、蜡以及染料尼罗红。在一个优选的实施例中，该额外的成分是一种液相。在另一个优选的实施例中，该液相是水。
[0179]可以直接地亦或通过与另一种成分相关的湿度添加水。水的最终的量不是关键性的，只要这些成分混合时形成一种稳定的乳液。通常，这些组合物将包含至少1%的水以及高达99%的水。通常将需要进行混合以提供一种适当的乳液并且可能需要加热或施加压力。 [0180]在另一个优选的实施例中，该额外的成分是一种油或蜡。油或蜡可以在这些油体中分隔并且以此方式脂质可溶性成分，例如脂质可溶性维生素可以被递送到该油体。在油或蜡包含添加的成分的情 况下，这些油体可以依然悬浮于亲脂相中或可以形成复乳液。
[0181]该最终的组合物可以处于固体或处于液体形式或具有任何其他希望的黏度。可以使用典型地以按重量计小于2%的浓度存在的胶凝剂，例如纤维素及衍生物、聚羧乙烯及衍生物、角豆胶、角叉菜胶及衍生物、苍耳烷胶质、长链链烷醇酰胺、以及膨润土及衍生物将该乳液增稠。
[0182]该乳液可以进一步包括表面活性剂，从而润湿、起泡、渗透、乳化、稳定和或分散所选择的材料。例如，如需要，阴离子表面活性剂，例如椰子甘油单酯磺酸钠，阳离子表面活性剂，例如氯化月桂基三甲基铵、氯化十六烷基吡啶和三甲基溴化铵，非离子型表面活性剂，包括普朗尼克和烷基酚的聚氧化乙烯缩合物，以及兼性离子表面活性剂，例如脂肪族季铵的衍生物、phosmomium和锍化合物,这些可以全部被添加。
[0183]如希望，能够结合金属离子的螫合剂，例如酒石酸、EDTA、柠檬酸、碱金属柠檬酸盐、焦磷酸盐或阴离子型聚合物聚羧酸酯也可以包含在该乳液制剂中。
[0184]通常，将对这些乳液制剂进行处理，使得由细菌、真菌、支原体、病毒等等或不希望的化学反应(例如氧化反应)造成的污染得以预防。在一个优选的实施例中，这可以通过防腐剂，例如，焦亚硫酸钠或其他化学添加物的添加或通过辐射，例如，通过电离辐射，例如钴-60或铯-137辐射或通过紫外线辐射来完成。
[0185]此外，可以添加活化剂。例如，可以使用本发明的乳液制剂将美容组合物配制为稳定的悬浮液，并且在护肤膏中可以包含维生素以及增湿剂。其中活性成分可以包含在本主题发明乳液中的一个特别有利的方式是如W096/21029中详述的、通过油质蛋白基因融合的构建。通过将该编码油质蛋白的基因遗传上连接到编码感兴趣肽或蛋白的基因上来创建这些融合蛋白。例如，在一种油料种子植物中，融合基因的表达导致然后用于生产本发明人造油体的融合蛋白的合成。原则上，使用这个技术可以生产任何希望的蛋白或肽，包括极性鱼抗冻多肽，或可以生产一种为油质蛋白融合物的治疗蛋白。
[0186]还可以配制具有成膜性能的乳液。当应用于一个表面且干燥时，这样一种乳液形成一层包衣。其中应用一种包衣的油体膜的乳液的一个实例是在鱼食中，其中可以对该鱼食应用多种油体(例如，生产自微藻油)以增强膳食值。在希望的是活性成分控释的情况下(例如在药物或挥发物，例如芳香剂的递送中)，成膜乳液是本发明的实施例中是特别有用的。除其他因素之外，在干燥过程中发生的、来自乳液膜的活化剂的释放时间取决于该膜的厚度。当使用一个更厚的包衣时，更长的干燥时间将导致该活化剂的更慢释放。在多种考虑的制剂中，仅当该膜干燥时发生试剂的释放。
[0187]其他因素，例如该乳液的构成以及该活性成分的类型和浓度也决定着释放特征。例如，共溶剂，例如乙醇可以包含在该制剂中并影响释放时间。在食品应用中也希望活性成分的释放，其中在消耗过程中，释放乳液中包裹的(entrapped)香料。取决于该乳液的精确配制，香料的释放可以引起突然强烈的感觉或香味与香精的更加精细的共混物。 [0188]该乳液制剂还可以用于喷雾和气溶胶中。在这些喷雾中还可以包括挥发物，如醇和芳香剂。还可以将这种类型的乳液喷雾在干燥的食物制品(例如马铃薯片以及汤粉)的表面上。这种乳液可以包含香料并添加防腐值(preservative value)或帮助维持该食物的适当湿度水平。
[0189]在酸性乳液制剂中可以利用本乳液制剂的稳定性。例如，该乳液制剂可以用于蛋黄酱类食物产品的制备中，如果需要的话，该产品除油体制品之外包含植物油、芥子、醋以及蛋黄。可灌注的乳液，如色拉调味汁可以通过增加醋的相对量和/或通过添加水来制备。
[0190]在可以加热而无明显有害作用的情况下，应用的一个实例是在开胃酱，例如白色调味醫的制备中或在甜醫，例如巧克力醫中。在这些应用中，油体制品被用作油?Η替代品。为了制备白色调味酱，向1份加热的油体制品中添加1份(w/w)面粉并且进行搅拌直到形成一种浓稠的悬浮液。在适度加热下逐步地添加奶，直到获得一种具有希望黏度的调味汁。
[0191]该乳液制剂还可以用作黄油替代品。在这个应用中，向该油体制品中添加少量例如，小于10%的水，直到获得希望的黏度。如果希望的话，可以添加天然的黄油香料以及增稠剂。该黄油替代品可以被用于甜玉米、面包上，蛋糕粉或面包制作中。可以添加典型地约2.5% (wt/vol)水平的盐，盐有助于香味并且充当防腐剂。如希望，可以添加着色剂，例如，胭脂树种子的提取物或胡萝卜素，以加深颜色。这个应用的优点是基于油体的黄油不包含氢化脂肪酸，氢化脂肪酸在人造黄油以及类似物的制剂中使用以达到希望稠度，但是也与心血管疾病相关。
[0192]可以将起酥油制备为从泡沫至可灌注的起酥油的不同硬度。在这个应用中，将空气灌输到该乳液制剂中并且该乳液制剂可以被视为分散在连续相，空气中。在希望乳油化和蓬松的情况下，可以将起酥油用于调拌料。这些调拌料包括糖霜、合成奶油、冰淇淋以及蛋糕糊。
[0193]可以从人造的或天然的香料以及营养素制备仿真果汁(imitation fruitjuice)。此类仿真果汁不具有正确的外观并且由于透明性看起来是稀薄的或经稀释的。通过添加少量的，例如，0.1%至1%(ν/ν)的该油体制品或其乳液，可以出现浑浊从而赋予该果汁浓厚的外观。因此本油体制品可以用作浑浊剂。在包含果汁的另一个应用中，该油体制品或其乳液可以被添加到具有可沉固体的果汁如，番茄汁中。[0194]添加少量的，例如，0.1%至1% (v/v)的该油体制品可以降低果汁中这些固体的沉降速率并且帮助维持浓厚的外观。
[0195]还想到了本发明油体制品的局部应用。在这个实施例中，该乳液被配制成一种皮肤学上可接受的乳液，该乳液可以用于，例如，湿润面部和/或身体皮肤，包括指甲和嘴唇或可以具有抗皮肤老化、抗痤疮、抗色素形成、抗脱发或促进脱毛或有助于伤口愈合和/或皮肤组织重建的特性。按重量计，优选该油体制品占据该最终组合物的1%_99%。 [0196]本发明的美容组合物可以包含额外的碳氢化合物，例如植物的、动物的、矿物的或合成的油或蜡或其混合物。它们包括石蜡、凡士林、全氢化角鲨烯、arara油、扁桃仁油、calphyllum油、鳄梨油、芝麻油、蓖麻油、希蒙得木油、橄榄油、或谷物胚芽油。
[0197]可以包含酯，例如羊毛脂酸(lanolic acid)、油酸、月桂酸(lauric acid)、硬脂酸、肉豆蘧酸的酯。还可能包含醇，例如，油酰醇、亚油基(Iinoleyl)醇或亚油烯基(Iinolenyl)醇、异硬脂基醇或辛基十二烷醇、乙醇或多元醇。
[0198]可以包含的另外碳氢化合物是辛酸酯、癸酸酯、蓖麻油酸酯、辛酸甘油酯/甘油三酸酯或ClO至C22脂肪酸甘油三酯。这些试剂的添加可以导致复乳液的形成。
[0199]在25 °C下为固体的氢化油，例如氢化蓖麻油、棕榈油或椰子油，或氢化脂；单-、二 _、三-或蔗糖甘油酯；羊毛脂；以及在25°C下为固体的脂肪酸也可以包含在本发明的美容品制剂中。在可以包含的这些蜡中，是动物蜡,例如蜂蜡；植物蜡,例如巴西棕榈蜡、小烛树腊、ouricurry蜡、日本蜡或来自软木纤维或甘蔗的蜡；矿蜡，例如石蜡、褐煤蜡、微晶蜡或地腊以及合成腊。
[0200]可以包含色素并且可以是白色或彩色的、无机或有机的和/或珠光的。这些色素包括二氧化钛、氧化锌、二氧化错、黑色、黄色、红色和棕色的氧化铁、二氧化铺、三氧化二铬、铁蓝(ferric blue)、炭黑、钡、锶、钙以及铝色淀以及用氧化钛或氧化铋包衣的云母。
[0201]在美容品和/或皮肤学组合物中可以包含在护肤膏中常用的活性成分，例如维生素，例如，维生素A或C以及α-羟基酸，例如柠檬酸、乙醇酸、乳酸以及酒石酸。例如，US5, 602，183传授维生素C或抗坏血酸促进结缔组织的生长，特别是在皮肤中加强皮肤对抗外部攻击了，例如烟雾以及UV辐射。可以包含在护肤膏和美容品中的湿润剂是例如矿物油和脲。还可以添加的是抗氧化剂，例如天然发生的生育酚类以及多酚类，或丁羟甲苯以及羟基苯甲醚。可以采用防晒剂，例如甲氧基肉桂酸辛酯(Parsol MCX)、3-二苯甲酮(Uvinul M40)以及丁基甲氧基二苯甲酰基甲烧(Parsoll789)来制备防晒霜(sun tanninglotion)。可以用于配制美容组合物的药物活性成分包括例如抗生素、杀真菌剂、以及消炎剂。
[0202]最终的美容产品可以处于一个游离的、倾倒的或粉饼(粉底、腮红或眼影)、一种相对多脂的产品，例如唇膏、睫毛膏或一种用于身体或面部的油或洗剂的形式。
[0203]该油体制品还可以用作牙膏中的口可接受的载体，其可进一步包括二氧化硅、表面活性剂、螫合剂、氟化物、增稠剂、增甜剂、调味剂，例如像薄荷油、酶以及杀生物剂。
[0204]可以配制的工业产品的一个实例是油漆，其中主要的树脂，例如基于硅酮类型的化合物、丙烯酸化合物、聚酯、氟、环氧树脂、聚氨酯的那些可以部分地或完全地由本发明的油体制品代替。如需要，可以将另外添加剂，例如色素、染料、玻璃鳞片、以及铝鳞片、色素分散剂、增稠剂、均化剂、硬化催化剂、硬化剂例如dioisocyanates、硬化催化剂、凝胶抑制剂、紫外线吸收剂、自由基淬灭剂等配制在油漆组合物中。
[0205]该油体制品还可以用来配制润滑剂。例如，该油体制品可以用于部分地或完全地替代润滑油，例如动物油、植物油、石油润滑油、合成润滑油或润滑脂如锂基润滑脂、脲基润滑脂和钙基润滑脂。在润滑剂制剂中采用的其他组合物包括抗氧化剂、洗涤分散剂、油性剂(oilness agent)、摩擦改良剂、黏性指数改进剂、降凝剂、固体润滑剂材料、防锈剂以及消泡剂。
[0206]使用本发明的油体制品还可以制备多种蜡。这些包括冲洗蜡(rinse-wax)类型，例如在汽车和其他防护层上提供稳定的疏水膜-修整(finish)的那些。在蜡的制备中使用的其他组合物包括如需要，可以按兼容量添加的表面活性剂、矿物油(例如混合的石蜡族的以及芳香族的/naphtenic油)、香水、杀生物剂、着色剂。 [0207]SM
[0208]实例1-材料和方法
[0209]材料
[0210]卡诺拉(欧洲油菜)种子、油、以及饼粉是由嘉吉澳大利亚公司赠与的。该饼粉是通过机械压榨的常用工业方法之后进行溶剂提取，进行卡诺拉油提取之后的残余物。一旦到达，筛选这些种子以去除草杆及其他非种子材料并且在4°C储存直到需要时。这些种子包含38.0%的油(由嘉吉公司(Cargill，Ltd)提供的信息)以及如通过LECO? FP-2000分析确定的，25.2%的蛋白。将卡诺拉油进行精炼、脱色、和除臭分级，并且添加TBHQ (200ppm)抗氧化剂。从LYSI HF (冰岛，雷基亚比克)获得冬化处理的金枪鱼油(HT303-4)。
[0211]卡诺拉油体的提取
[0212]根据曾(1993)描述的方法(除省略最终的己烷洗涤步骤之外)，从卡诺拉种子提取天然油体。简言之，将这些种子浸泡在磷酸钠缓冲液(PH7.5)中过夜并且使用厨房搅拌机(Sunbeam Multiblender, 650W),与研磨介质(每50mll0g干种子)均质化，持续40秒。研磨介质包含0.6M的蔗糖以及IOmM的磷酸钠缓冲液(pH7.5)。将匀浆通过三层粗棉布进行过滤。将滤液放置在离心管中，等量的浮选介质(包含0.4M而非0.6M蔗糖的研磨介质)在顶部成层，并且将这些管在吊桶式转头(Beckman J6-HC)中于10°C下在5，OOOg进行离心60mino
[0213]将在顶部收集的这些油体重悬于两倍于它们体积的清洁洗涤溶液中，该溶液包含
0.1%吐温-20、0.2M蔗糖、以及5mM磷酸钠缓冲液pH7.5。将重悬液置于离心管的底部并且1:1比率的IOmM磷酸钠缓冲液PH7.5在顶部成层，并且将这些管离心。收集顶部的这些油体并且重悬于两倍于它们体积的离子洗脱缓冲液中(此外包含2M NaCl的研磨介质)。将悬浮液置于离心管的底部，流动介质(包含2M NaCl以及0.25M而非0.6M蔗糖的研磨介质)在顶部成层(比率1:1)，并且将这些管离心。收集顶部的这些油体并且重悬于它们体积的9M脲中。将重悬液在室温下用力摇晃IOmin,然后置于离心管的底部，IOmM磷酸钠缓冲液pH7.5在顶部成层(比率1:1);并且将这些管离心。收集顶部的这些油体并且重悬于它们体积的研磨介质中。将重悬液置于离心管的底部，浮选介质在顶部成层(比率1:1)，并且将这些管离心。收集顶部的这些油体并且用研磨介质进行重悬以给出约100mg/ml的浓度。
[0214]从卡诺拉油体中分离油质蛋白
[0215]从干燥至14% (w/w)湿含量的、纯化的卡诺拉OB中提取油质蛋白。将该油体制品重分散于去离子水与乙醇(60%乙醇)的溶液里并且搅拌lh，并且使用旋转蒸发器(Bi)CHIRotavapor R-124)去除乙醇。然后将该乳液在吊桶式转头中于20°C (Beckman J6-HC)下在5，OOOg离心30min。去除包含水以及痕量乙醇的顶层并且将这些蛋白按100g/L的浓度重分散于去离子水中。将这个水性蛋白分散体在_18°C储存，直到需要时。
[0216]蛋白表征
[0217]通过电泳根据它们的分子量对分离自卡诺拉油体(COB)的这些蛋白进行表征。根据供应商的推荐，使用NuPAGE?凝胶4%-12%BT 1.0凝胶(NuPAGE?英杰公司(invitrogen))进行这些电泳。简言之,将蛋白样品的浓度调节至lmg/ml并且将25 μ I置于埃彭道夫管(eppendorf tube)中。然后，分别添加10 μ I的NllPAGE? LDS样品缓冲液(4X)以及5μ I的NuPAGE?还原剂(10χ)，并且在加热至70°C持续10分钟之前，将这些管在室温下于14，OOOrpm离心3秒(微量离心机(Eppendorf Centrifuge)5415C)。除了未对它们的浓度进行调节之外，以同样的方式制备标记(Markl2?无污染标准品)。最终，将10 μ I量的标记和样品两者添加到已经放置在电泳槽(Novex Min1-Cell，英杰公司)中的凝
胶中，该电泳槽包含NuPAGE?电泳缓冲液以及抗氧化剂。将该槽连接到设置为200伏特以及 400 毫安的发电机(B10RAD Power Pac300)上 35min。
[0218]一旦完成电泳，将凝胶在去离子水中洗涤3次并且在缓慢搅拌，42rpm(RATEK平台混合器模式(Platform Mixer model)0M6)下，置于具有 SimplyBlue? SafeStain (英杰公司)的塑料容器2h。之后，将该凝胶再用去离子水洗涤两次并且置于去离子水中2小时以去除非蛋白结合染色，并且用G:B0X (SYNGENE)以及GeneSnap7.07软件(SYNGENE)拍照。
[0219]从卡诺拉饼粉中提取油质蛋白
[0220]根据戈登思维里(Ghodsvali)等人(2005)的程序的一个改良，从卡诺拉饼粉中提取油质蛋白。简言之，将卡诺拉饼粉(1.0kg)浸泡在去离子水(10.0L)中并且用水性氢氧化钠(5%, w/w)将pH调节至12.0,并且使用Ultraturax混合器混合10分钟。静置10分钟后，将这些内容物再混合10分钟。将所得的浆料在吊桶式转头中于20°C (Beckman J6-HC)下在4，OOOg离心30min。当蛋白沉淀发生时,将包含粗蛋白的上清液的pH调节至pH6.5 (油质蛋白的等电点)。当恢复上清液和沉淀时，在4，OOOg下离心之前,搅拌再持续30min。使用Ultraturax将沉淀用pH6.5的水洗漆并且在4，OOOg下再次离心30min。经洗漆的沉淀恢复为糊状并且以湿形式在_18°C下储存直到需要时。
[0221]人造油体的构建
[0222]在初始实验中，在磷脂存在或不存在两种情况下，使用从卡诺拉饼粉各自获得的油质蛋白提取物制备分别包含卡诺拉油与金枪鱼油的人造油体分散体。首先，使用在800rpm运行30分钟的自动搅拌器(来自海道尔夫公司(Heidolph)的RZR2051控制器)，通过将油以及包含这些蛋白的水混合来制备预-乳液。当包含磷脂时，在乳化之前，将它们溶解于油中。所用的这些成分的重量比类似于它们在天然卡诺拉OB中的比率。因此，该预-乳液包含1.5%蛋白、1%磷脂(如果需要的话)以及10%油，从而达到0.5与2 μ m之间的颗粒尺寸并且油滴很好地被蛋白和磷脂包被。将该预-乳液在500巴下均质化(RATEKPilot Lab均质器)三次。
[0223]在随后的实验中，使用表面活性剂和从卡诺拉饼粉各自获得的油质蛋白提取物制备分别包含卡诺拉油与金枪鱼油的人造油体分散体。当包含磷脂或其他表面活性剂时，在乳化之前，将它们与油混合。首先，通过滴加40%的水性氢氧化钠同时经受Ultraturax混合将该油质蛋白提取物的pH调节至约8.0。在使用Silverson混合器在最小化氧化的氮气层下混合2min之前，将油(10g)、油质蛋白提取物(1.5g)、表面活性剂(多种)以及去离子水(87.5g)置于玻璃烧杯中并且在水浴(60°C)中加热。将该混合物在氮气下在1000巴处均质化(EmulsiFlex C5)两次。所用的这些成分的重量比类似于它们在天然卡诺拉OB中的比率。因此，这些预-乳液包含1.5%的蛋白、1%的表面活性剂(如果需要的话)以及10%的油。
[0224]在如下乳液制备之前，将提取自卡诺拉饼粉的油质蛋白“激发”。允许储存的提取物融化并使用Ultraturax混合器40% (w/ff)混合，同时滴加氢氧化钠直到pH达到8.0。
[0225]使用吐温40乳化剂制备对照乳液
[0226]emulsions were prepared with canola and tuna oils 使用吐温 40 (6%, w/w)作为乳化剂，用卡诺拉以及金枪鱼油制备10% (w/w)o/w乳液。如上所述进行乳化。
[0227]人诰油体的物理表征
[0228]分别在4°C、环境温度(约20°C)、45°C以及60°C下，经12天，对AOB的物理稳定性进行了研究。使用与Hydro2000g模块结合的Malvern小容量送样单位(Malvern SmallVolume Sample Presentation Unit),用 MASTERSIZER2000 (马尔文公司(Malvern))测量这些乳液的颗粒尺寸。(颗粒R1: 1，456/吸收:0,001/分散体R1: 1，330水)。用与ColorView IIIu摄像机连接的光学显微镜Olympus BH-2获得光学显微照片并且使用AnalySISgetIT5.0软件对这些照片进行处理。通过用十二烷基硫酸钠(SDS)进行处理来检查这些颗粒的聚集。这是在室温下使用磁力搅拌器将三体积的乳液与一体积的10% (w/w) SDS溶液混合lOmin，随后重新分析来进行的。
[0229]制备自油体的水包油乳液的氧化稳定性
[0230]在加速氧化条件下的储存过程中，从EPA/DHA的损耗连同产生的反式，反式-2，4-庚二烯醛的量来评估AOB分散体的氧化稳定性。出于随后的目的，将这些乳液的样品(2g)放置在顶空小瓶(IOml)中并用硅酮-内衬的铝帽进行密封，且在黑暗烘箱内于40°C或60°C下加热15天。每天取出样品并且立即通过如下的固相微萃取以及气相层析-质谱法对2，4-庚二烯醛进行分析。
[0231]使用DVB/CAR/PDMS纤维(50/30 μ m，Supelco公司，澳大利亚，悉尼)，通过顶空固相微萃取(SPME )确定在AOB乳液的加速氧化过程中产生的氧化的挥发性化合物。将该纤维插入到样品顶空中并且将该小瓶在60°C孵育15min，并且然后取出并转移到GC注射器(在无分流模式中运行)并且保持7min以解吸附所萃取的挥发性化合物到GC柱中。使用CombiPAL自动注射器(CTC Analytics公司，瑞士,Zwingen)进行整个系列的事件。使用装有VOC熔融石英毛细管柱(60mm, 0.32mm 1.d.,0.18mm膜厚度,安捷伦公司(Agilent),澳大利亚，维多利亚，墨尔本)的安捷伦型号6890GC和型号5973MSD (加利福尼亚州，帕洛阿尔托)进行GC-MS。将GC烘箱程序设计为从40°C以22°C.min-1的速度增加到220°C，并且在每个温度另保持14分钟。以2.0mL min-1的恒流速度将氦用作载气。注射试样2min后，将该注射器初始在无分流模式下并且然后转换到分流模式(I: 20)下运行。注射器和MS检测器两者的温度都保持在230°C。在扫描模式(29-350amu)下运行MS。使用Chemstation软件进行数据分析并且通过标准品连同参照光谱文库(Wiley275)对化合物进行识别。通过使用校准曲线量化这些乳液中的挥发性化合物，这些曲线是从它们相对应的添加有不同水平的挥发性化合物2，4-庚二烯醛(反式，反式)标准品的新鲜乳液建立的。
[0232]使用毛细管气相色谱法，通过脂肪酸分析来确定储存过程中的ALA (卡诺拉)EPA和DHA (金枪鱼)的损耗。出于这个目的，使用异丙醇/己烷从储存的乳液中提取脂质并且预先通过氢氧化钾催化的酯交换反应转化为甲酯。在BPX-70毛细管柱上分析这些酯并且通过火焰离子化检测进行检测。
[0233]实例2-从卡诺拉饼粉中提取油质蛋白
[0234]图2示出针对该蛋白的电泳结果,该蛋白通过碱性提取(pH12)、随后在pH6.5沉淀并且进行水洗涤从卡诺拉饼粉中分离出。油质蛋白的分子量已经被报道为在18-20kDa的范围内，并且上述分离物包含在这个分子范围内的蛋白的显著量，证实了油质蛋白的存在。在范围3.0-12.0中的不同pH值处的蛋白沉淀，以及随后的电泳示出，在pH6.5获得了最大油质蛋白恢复。其他工作者的先前研究已经集中于从预-提取的油体(在它们已经通过乙醇或氯仿与甲醇的混合物的处理而脱稳定化之后)中分离油质蛋白。据我们所知，以前尚未作出通过水性提取从油料种子或饼粉中分离油质蛋白的努力。这可能是因为油质蛋白被认为是无论何种PH均是水不溶性的(贝松(Bei sson )等人，2001)。表面上的水不溶性可能是由于油质蛋白在干燥时附聚的趋势；并且一旦发生这种情况，则很难将油质蛋白溶解或分散于水中。
[0235]初始实验之后，进行从卡诺拉饼粉提取油质蛋白的优化。在PH12.0处获得的最高油质蛋白产量，随着pH的降低获得的恢复显著下降(图3)。如通过SDS-PAGE所示，pHl2.0还提供了最纯净的油质蛋白提取物(图4)。更低的pH值倾向于提取增加的量的约12和5kDa的两种更低分子量组分。
[0236]实例3-人造油体的颗粒尺寸
[0237]为了消除颗粒尺寸对氧化速率的任何影响，将两种乳液(吐温40和油质蛋白)的颗粒尺寸尽可能远地相配(图5)。针对加速氧化研究还重要的是，在储存过程中确保未发生分离并且颗粒尺寸保持相对恒定。用油质蛋白制作的AOB连同用吐温40乳液制作的AOB的粒径在60°C下经12天的储存过程中保持未变。在升高的温度下的储存过程中，粒径的均一性使得加速氧化研究能够基于顶空分析法。
[0238]清楚地，pH12-可溶性提取物主要由细胞蛋白组成。沉淀的部分还将包含相对大量的非油质蛋白蛋白。然而，有趣地是，当使用pH12-可溶性提取物亦或pH6.5-沉淀的、在pH12重溶解的蛋白，制备AOB时，似乎存在油质蛋白的天然选择以形成油体表面(图6)。这将具有以下优点，在制备AOB之前不需要进一步纯化所沉淀的蛋白以增强油质蛋白含量。
[0239]实例4-氧化稳定性
[0240]将在PL不存在或存在两种情况下，用重溶解的pH6.5沉淀的蛋白制备的卡诺拉和金枪鱼油AOB的水性分散体的氧化稳定性与用相对应的油和吐温40乳化剂制备的等效乳液进行比较。出于这个目的，将这些乳液储存在升高的温度(60°C )下，并且通过三种不同的方法测量氧化水平，即，初级氧化产物(氢过氧化物)、次级氧化产物(反式，反式_2，4-庚二烯醛)、以及不饱和脂肪酸(对于卡诺拉是亚麻酸并且对于金枪鱼油是DHA)的损耗。在测试的整个储存期间，AOB乳液的氢过氧化物水平显著低于相对应的吐温40乳液的氢过氧化物水平，示出AOB乳液的更大氧化稳定性(数据未示出)。
[0241]在用油质蛋白提取物制作的金枪鱼油乳液中的2，4-庚二烯醛的浓度显著低于用吐温40制作的浓度，示出油质蛋白乳液的更大氧化稳定性(图7)。这示出卡诺拉油质蛋白的抗氧化效应不局限于卡诺拉油而是延伸到了鱼油，例如金枪鱼油。支持此结论的额外的证据由脂肪酸数据提供。用提取自卡诺拉饼粉的油质蛋白制作的金枪鱼油乳液的EPA和DHA含量损耗比吐温40乳液的损耗更慢(图8)，在60°C下5天之后，与针对吐温40乳液低于70%相比，剩余大于90%的DHA。
[0242]图9示出在油质蛋白-和吐温40稳定化的乳液的加速氧化(40°C，暴露于空气中)过程中，氢过氧化物(如由PV表示的)的发展速率。当经受加速氧化时，吐温40-稳定化的乳液的PV急剧上升，不具有明显的诱导期，10天后达到120meq/kg油的一个值；超过这个点，PV逐渐下降，这可以被解释为归因于氢过氧化物的形成速率下降低于它们的降解为次级氧化产物(例如醛和酮)的速率。油质蛋白-稳定化的乳液的PV值甚至在30天加速后仍不接近吐温40-稳定化的乳液的最大PV (120meq/kg)，并且在这个点处终止该实验。结果证明油质蛋白-稳定化的乳液的优越的氧化稳定性高于吐温40-稳定化的乳液。
[0243]从金枪鱼油以及油质蛋白生产的人造油体(AOB)很容易地分散在水中以形成金枪鱼水包油乳液。不考虑次级表面活性剂的使用(磷脂、甘油单酯或硬脂酰乳酸钠，SSL)，当在4°C储存I周时,这些乳液不分离。相比之下，生产自金枪鱼油和Isolexx (卡诺拉蛋白分离物)的乳液在具有或 不具有磷脂的情况下是不稳定的并且在制备的几小时内分离。在40°C，酪蛋白钠乳液是最稳定的，在I周之后未示出分离。在40°C下I周之后，包含磷脂或SSL的油质蛋白-稳定的乳液实际上未分离。
[0244]实例5-相对于其他蛋白成分，油质蛋白的乳化作用和抗氧化效力
[0245]将广泛用作乳化剂的酪蛋白钠与卡诺拉中生产的且晋升为食品级乳化剂的卡诺拉蛋白分离物“Isolexx”进行比较。针对物理稳定性和氧化稳定性，对以下制剂进行了试验。
[0246]1.金枪鱼油+油质蛋白+磷脂
[0247]2.金枪鱼油+Isolexx (基于卡诺拉的蛋白乳化剂，由BioExx,加拿大销售)
[0248]3.金枪鱼油+Isolexx+憐脂
[0249]4.金枪鱼油+酪蛋白钠
[0250]使用加速氧化条件(在40°C下，暴露于空气中储存)对使用反式，反式，2，4-庚二烯醛作为金枪鱼油ω-3脂肪酸的氧化降解标记的氧化稳定性进行比较。图10示出反式，反式，2，4-庚二烯醛在乳液储存过程中的发展。除了油质蛋白(加有磷脂)乳液之外，所有的乳液在18天之内达到最大氧化。在9-10天之内，酪蛋白钠以及Isolexx乳液达到3.0ppm的庚二烯醛浓度，而直到24天之后油质蛋白乳液仍未达到相同的氧化水平，证明与酪蛋白钠以及Isolexx相比,油质蛋白具有优越的抗氧化特性。
[0251]实例6-次级表面活性剂对人造油体稳定性的作用
[0252]基于前述工作，除了油质蛋白外需要磷脂的存在以产生在储存期间不发生聚结的乳液。通过制备其中磷脂被如下吐温40、甘油单酯以及SSL替代的乳液，本发明的诸位发明人研究了磷脂对人造乳液稳定性的重要性。在相同水平下使用磷脂、吐温40、MAG以及SSL (按油的重量计，l%w/w)。[0253]a.金枪鱼油+油质蛋白以及磷脂
[0254]b.金枪鱼油+油质蛋白以及吐温40
[0255]c.金枪鱼油+油质蛋白以及甘油单酯
[0256]d.金枪鱼油+油质蛋白以及硬脂酰乳酸钠(SSL)
[0257]使用加速氧化条件(在40°C下，暴露于空气中储存)对使用反式，反式，2，4-庚二烯醛作为金枪鱼油ω-3脂肪酸的氧化降解标记的氧化稳定性进行比较。图11示出反式，反式，2，4-庚二烯醛在乳液储存过程中的发展。不同乳液之间的庚二烯醛的发展速率不存在显著差异，示出用吐温40、甘油单酯或SSL替代磷脂不会不利地影响基于油质蛋白的人造油体的氧化稳定性。
[0258]本领域的普通技术人员将理解，在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对这些具体实施方案中所示的
【发明内容】
作出众多的变化和/或改性。因此，将这些现有实施方案在所有方面都被视为是说明性的而不是限制性的。
[0259]本申请要求于2011年2月7日提交的AU2011900383的优先权，将其全部内容通过引用结合在此。
[0260]将所有在此披露和/或提及的出版物通过引用以其全文结合在此。
[0261]已包括在本说明书中的对于多个文献、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅出于为本发明提供一个背景的目的。它不应被视为承认任何或所有这些内容构成现有技术基础的一部分或是与本发明有关的领域中的常见一般知识，因为它在本申请的各项权利要求的 优先权日:之前就存在。
[0262]参考文献
[0263]Abenes et al (1997)Plant Cell Reportsl7:1-17.[0264]Beisson et al (2001)Plant Physiol.Biochem.39:623-630.[0265]Bhatla et al (2010)Biotechnol.Adv.28:293-300.[0266]Capuano et al (2007)Biotechnol.Adv.25:203-206.[0267]Fisk et al (2008) Eur0.J.Lipid Sc1.and Tech.110:962-68.[0268]Ghodsvali et al.(2005) Food Res.1nt.38:223-231.[0269]Gray et al (2010)Eur.J.Lipid Sc1.Technol.112:741-749.[0270]Huang(1992)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43:177 - 200.[0271 ] Huang(1994)Curr.0p.Struct.Biol.4:493-498.[0272]Huang(1996)Plant Physiol.110:1055-1061.[0273]Lin et al (2005)Plant Physiol.Biochem.43:770-776.[0274]Liu et al (2009) J.Agric.Food Chem.57:2308-2313.[0275]Manamperi et al (2010) J.Am.0il Chem.Soc.87:909-915.[0276]Murphy and Cummins(1989)Phytochemistry28:2063 - 2069.[0277]Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443-453.[0278]Roux et al (2004) J.Agric.Food Chem.52:5245-5249.[0279]Scott et al.(2010) Plant Biotechnol.J.8:912-927.[0280]Shen and Wijesundera (2009) Oxidative Stability of Canola OilBodies,American Oil Chemists’ Society Annual Meeting, May2009.0rlando, USA.Shimada and Hara-Nishimura(2010)Biol.Pharm.Bull.33:360-363.[0281]Tzen and Huang(1992) J.Cell Biol.117:327-335.[0282] Tzen et al (1993) Plant Physiol.101:267-276.
【权利要求】
1.一种人造油体，该人造油体包含油质蛋白、表面活性剂、和油，该油包含具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸。
2.如权利要求1所述的油体，其中该表面活性剂是磷脂。
3.如权利要求1或权利要求2所述的油体，其中至少5%的该多不饱和脂肪酸具有四个或更多个双键。
4.一种人造油体，该人造油体包含油质蛋白、表面活性剂和包含脂肪酸的油，其中该表面活性剂的至少一些不是磷脂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的油体，其中该油质蛋白是一种油料种子油质蛋白。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的油体，其中该油是海产品的油和/或鱼油。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的油体，其中这些脂肪酸的至少50%处于甘油酯的形式。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的油体，其中人造油体干重的至少80%是油。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的油体，进一步包含一种或多种其他分子。
10.如权利要求9所述的油体，它其中该其他分子是一种生物活性分子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的油体，它具有约0.1至约100 μ m之间的尺·寸。
12.—种组合物，包括根据权利要求1至11中任一项所述的一种或多种人造油体，以及一种载体。
13.一种治疗或预防将从脂肪酸获益的病症的方法，该方法包括向患有该病症的受试者给予根据权利要求1至11中任一项所述的一种或多种人造油体和/或权利要求12所述的组合物。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的一种或多种人造油体和/或权利要求12所述的组合物用于制造治疗或预防将从脂肪酸获益的病症的药物的用途。
15.根据权利要求1至11中任一项所述的一种或多种人造油体和/或权利要求12所述的组合物作为用于治疗或预防将从脂肪酸获益的病症的药物的用途。
16.如权利要求13所述的方法，或权利要求14或权利要求15所述的用途，其中这些脂肪酸是具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸。
17.—种产品，包括根据权利要求1至11中任一项所述的一种或多种人造油体和/或权利要求12所述的组合物。
18.如权利要求17所述的产品，该产品是一种食物或饲料产品、饮品、个人护理产品、药物产品或工业产品。
19.如权利要求17或权利要求18所述的产品，该产品是，或包含，一种水包油乳液。
20.根据权利要求1至11中任一项所述的一种或多种人造油体，和/或权利要求12所述的组合物用于制备一种产品的用途。
21.一种制备饲料、食物或饮品的方法，该方法包括将根据权利要求1至11中任一项所述的一种或多种人造油体，和/或权利要求12所述的组合物与一种或多种可食用成分进行混合。
22.—种生产人造油体的方法，该方法包括i)获得油质蛋白、表面活性剂以及包含具有四个或更多个双键的多不饱和脂肪酸的油，并且 ?)混合该油质蛋白、表面活性剂和油来生产这些人造油体。
23.一种生产人造油体的方法，该方法包括 i)获得油质蛋白、表面活性剂以及包含脂肪酸的油，其中该表面活性剂的至少一些不是磷脂，并且 ?)混合该油质蛋白、表面活性剂和油来生产这些人造油体。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，进一步包括， iii)选择人造油体。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中步骤i)包括 a)获得包含油质蛋白的植物的提取物，并且 b)从该提取物中至少部分地纯化蛋白，其中该蛋白包含油质蛋白。
26.如权利要求25所述的方法，其中步骤b)包括 1)调节该提取物的pH到至少约11.5的pH， 2)分离I)以产生固相和液相并且选择该液相， 3)降低该液相的pH以沉淀出这些蛋白， 4)分离3)以产生固相和液相并且选择该固相，并且 5)将该固相分散在一种载体中。
27.—种部分地纯化来自植物提取物的油质蛋白的方法，该方法包括 1)调节该提取物的pH到至少约11.5的pH， 2)分离I)以产生固相和液相并且选择该液相， 3)降低该液相的pH以沉淀出这些蛋白， 4)分离3)以产生固相和液相并且选择该固相，并且 5)将该固相分散在一种载体中。
28.如权利要求26或权利要求27所述的方法，其中步骤3)包括将该液相的pH降低至低于约7。
29.根据权利要求22至28中任一项所述的方法，该方法不使用有机溶剂。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中该植物是一种油料种子植物。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中该提取物是油提取之后产生的饼粉。
【文档编号】A61K8/06GK103547252SQ201280012108
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年2月7日 优先权日:2011年2月7日
【发明者】拉詹德拉纳萨·查克拉帕尼·维杰逊黛拉, 志平·沈, 托马斯·博伊特奥, 新青·徐, 列夫·伦丁 申请人:联邦科学与工业研究组织