紫檀茋的抗焦虑效果的制作方法

紫檀茋的抗焦虑效果的制作方法
【专利摘要】紫檀茋(白藜芦醇的一种天然类似物)通过下调小鼠海马体中ERK的磷酰化水平而显示出抗焦虑样作用。使通过口服强饲法施用了紫檀茋(1-10mg/kg?BW)的小鼠接受了高架十字迷宫(EPM)测试。紫檀茋在1mg/kg和2mg/kg的剂量下显示出通过增加的百分比滞留时间和开放臂进入次数而证实的抗焦虑活性，这两者是焦虑的关键决定因素。这种抗焦虑活性与EPM中1mg/kg和2mg/kg下的安定相当。百分比封闭臂行进距离和滞留时间在1mg/kg和2mg/kg剂量下缩短。5mg/kg和10mg/kg剂量未显示出任何抗焦虑效果。自主活动在所有剂量下均不受影响。Western印迹分析证实了EPM观察结果。在单次经口施用后在血清和脑组织中检测到了紫檀茋，从而证实了该化合物跨过血脑屏障从而发挥其抗焦虑效果。白藜芦醇不具有任何抗焦虑效果。
【专利说明】紫擅芪的抗焦虑效果
[0001]发明背景【技术领域】
[0002]本发明涉及通过施用包含治疗有效量的存在于葡萄和某些越橘(Vaccinium)浆果中的紫檀芪(白藜芦醇的类似物)的药物组合物而治疗、缓解或预防焦虑的方法。
[0003]相关领域描述
[0004]焦虑障碍在社区环境中以及在初级和二级医疗护理中是常见的，并通常会转变成慢性临床病状(Nutt 等人 2002.1nt.J.Neuropsychopharmacol.5:315-325)。焦虑障碍是精神障碍最常见的类型，具有18.1%的发病率和28.8%的终生盛行率(Kessler等人2005.Arch.Gen.Psychiatry62:617-627;Ohayon, Μ.Μ.2006.J.Psychiatr.Res.40:475-476)。抗焦虑药物已由人类使用了数千年。这些药物中的苯二氮□类起效快、有效并且是最常见的处方类抗焦虑药(Bandelow 等人 2008.World J.Biol.Psychiatry9:248-312;Baldwin等人 2005.J.Psychopharmacol.19:567-596;Rudolph 和 Mohler.2006.Curr.0pin.Pharmacol.6:18-23)。然而，它们的长期使用与副作用存在关联，诸如镇静、产生耐药性、滥用倾向和戒断症状(Nutt等人，上文；Bandelow等人，上文；Baldwin等人，上文)。目前，将抗抑郁药的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂类用作大多数焦虑障碍的一线治疗。然而，这类药物也具有缺点。具体地讲，治疗性作用起效缓慢，因而需要若干周的治疗才能发挥抗焦虑效果(Nutt等人，上文；Bandelow等人，上文；Baldwin等人，上文)。因此，仍然需要具有快速的治疗性作用但没有不合宜效果的抗焦虑化合物。
[0005]大量的天然化合物不仅提供了有用的药理学工具(Furukawa等人1993.J.Biol.Chem.268:26026-26031)，还提供了药物开发的潜在治疗性先导化合物(Liu, J.1993.Trends Pharmacol.Sc1.14:182-188)。苗是一类具有α，β - 二苯乙烯核心结构的植物化学物质。芪已在大量不相关的植物属中得到了报道，包括葡萄、花生和越橘(Vaccinium)浆果(Chong等人2009.Plant Sc1.177:143-155)。白藜芦醇(一种得到广泛研究的芪)据报道在许多生物系统中发挥抗氧`化、抗炎、化学预防和抗老化效果(Aggarwal等人 2004.Anticancer Res.24:2783-2840;Baur 和 Sinclair.2006.Nat.Rev.DrugDisc0.5:493-506; Bishayee, A.2009.Cancer Prev.Res.2:409-418)。最近，存在于某些越橘浆果诸如蓝莓和鹿莓中的紫檀芪(白藜芦醇的一种天然类似物)(Rimando等人2004.J.Agric.Food Chem.52:4713-4719)因具有多种多样的效果(如白藜芦醇显示出的那些效果)已受到了广泛的关注。紫檀芪具有镇痛、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、降血脂和癌症化学预防特性(Amarnath Sateesh 和 Par1.2006.J.Pharm.Pharmacol.58:1483-1490;Remsberg等人 2008.Phytotherapy Res.22:169-179;Rimando 等人 2002.J.Agric.FoodChem.50:3453-3457; Rimando 等人 2005.J.Agric.Food Chem.53:3403-3407)。紫檀芪还对结肠癌发展(Paul等人2009.Cancer Prev.Res.2:650-657)、侵袭和转移(Pan等人2009.Carcinogenesis30:1234-1242)以及在逆转老龄大鼠认知缺陷(Jos印h等人2008.J.Agric.Food Chem.56:10544-10551)方面具有明显的效果。然而，紫檀芪的抗焦虑潜力尚未得到研究。
[0006]许多天然化合物(包括芪)与不同信号传导通路中涉及到的蛋白激酶相互作用，诸如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环加氧酶-2(C0X-2)和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)(Paul等人2009，上文)。公认的是，胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2) (MAPK家族的成员)在许多细胞类型的转录调控中发挥着重要作用，包括神经元(Hetman和Gozdz.2004.Eur.J.Biochem.271:2050-2055)。越来越多的证据表明，ERK信号传导通路在多种刺激下得以活化(Davis, R.J.1993.J.Biol.Chem.268:14553-14556;Hetman 和 Gozdz,上文)，包括暴露于应激下(Gerrits等人2006.Neurosciencel42:1293-1302)。此外，据推测，海马体和外侧杏仁核中的ERK信号传导通路在焦虑中发挥着作用(Paul等人2007.Biol.Psychiatry61:1049-1061;Tronson 等人 2007.Neuropsychopharmacol.133:1570-1583)。这一见解通过磷酰化ERK水平在焦虑期间明显升高的发现结果进一步巩固。因此，ERK信号转导通路可能在焦虑中发挥着重要作用，并且其抑制可能产生抗焦虑效果(Ailing等人2008.J.Psychiatr.Res.43:55-63)。
[0007]因此，鉴于信号传导通路在焦虑中的作用以及对可用于治疗焦虑的药剂的需要，本工作的目标是确定紫檀芪作为抗焦虑抑制剂的效果。
发明概要
[0008]我们研究了紫檀芪作为焦虑抑制剂的性质并且确定了紫檀芪可用作抗焦虑剂。
[0009]根据该发现，本发明的目标是提供通过施用治疗有效剂量的紫檀芪、其药学上可接受的盐或异构体而治疗、缓解或预防对其有需要的受试者的焦虑的方法。
[0010]本发明的另一部分是试剂盒，其包含含有紫檀芪的药物组合物；和试剂盒使用说明。
[0011]本发明的其他目标和优点将通过接着的说明变得显而易见。
[0012]附图简述
[0013]图1显示了紫檀芪的化学结构。
[0014]图2A和2B显示了经口施用紫檀芪对高架十字迷宫(EPM)测试中的行为的影响。在为时5分钟的EPM上测试前60分钟，将雄性Swiss Webster小鼠通过口服强饲法注射了媒介物或紫檀芪(l-10mg/kg)。测量了行进距离百分比、所花时间百分比以及开放臂(图2A)和封闭臂(图2B)(分别为OA和EA)进入次数。每个竖条代表平均值土SEM。n=6_10只/剂量。与媒介物对照相比，*P〈0.05，**p〈0.01 (单因素方差分析，然后为Dunnett检验)。
[0015]图3示出了腹膜内(1.p)施用安定对高架十字迷宫测试中行为的影响。在为时5分钟的EPM上测试前30分钟，将雄性Swiss Webster小鼠通过腹膜内注射了媒介物或安定(0.5-2mg/kg)。测量了行进距离百分比、所花时间百分比以及开放臂(图3A)和封闭臂(图2B)(分别为OA和EA)进入次数。每个竖条代表平均值土SEM。n=6_10只/剂量。与媒介物对照相比，**p<0.01 (单因素方差分析,然后为Dunnett检验)。
[0016]图4示出了经口施用紫檀芪对小鼠自主活动的影响。在为时5分钟的高架十字迷宫上测试前60分钟，将雄性Swiss Webster小鼠通过口服强饲法注射了媒介物或紫檀芪(l-10mg/kg)。以每个室的总中断数评估了自发活动。每个竖条代表平均值土SEM。n=8-10只/剂量。[0017]图5A和5B示出了经口施用紫檀芪对海马体中ERKI/2磷酰化的影响。图5A显示了在EPM后立即处死的小鼠的磷酰化ERK1/2水平的代表性数据。图5B显示了在训练后立即处死的小鼠的ERK1/2磷酰化变化的光密度分析。值表示为至少三只动物的平均值土SEM。与媒介物对照相比，*P〈0.05, **p〈0.01 (单因素方差分析,然后为Dunnett检验)。
[0018]图6示出了经口施用紫檀芪对小鼠海马体中Akt磷酰化的影响。在高架十字迷宫测试后立即处死的小鼠的磷酰化ERK1/2水平的代表性数据。在通过磷酰化Akt特异性抗体(Ser473)探查后，将印迹用抗β _肌动蛋白抗体再次探查。
[0019]发明详述
[0020]与白藜芦醇相似，紫檀芪也产生多种药理学活性。我们现在的工作是对紫檀芪所报道的一系列健康有益特性的补充；在此，我们首次证实其抗焦虑效果。在本研究中，在经典的动物焦虑模型高架十字迷宫(EPM)(抗焦虑评估的行为模型)上研究了紫檀芪的抗焦虑效果。EPM测试被视为得到最广泛验证的用于检测分析新型抗焦虑剂的测试法之一(Pellow 等人 1985.J.Neurosc1.Methodsl4:149-167;Hogg, S.1996.Pharmacol.Biochem.Behav.54:21-30)。将安定(最常用的抗焦虑化合物之一)在本研究中用作阳性对照。鉴于啮齿类动物显示出的在驱使探索新环境与害怕开放高架位置之间的矛盾，EPM是大量研究人员采用的广泛使用的焦虑模型(Pellow等人，上文；Hogg，上文)。据提议，啮齿类动物的正常探索行为更倾向于高架十字迷宫模型中迷宫的封闭臂，并且对引起焦虑的开放臂的厌恶是 EPM 模型的基础(Pellow 等人，上文;Ohl1F.2003.Clin.Neruosc1.Res.3:233-238)。许多证据已确立，施用抗焦虑化合物降低对开放臂的天生厌恶并促进其探索(Pellow等人，上文；Hogg,上文)ο
[0021]在我们的研究中，我们还在向小鼠经口施用化合物后测定了紫檀芪的血浆和组织水平。紫檀芪的血浆水平随着剂量而升高，并且观察到了紫檀芪海马体水平的相应升高(参见实验5)。以研究对蛋白激酶调控的影响以及阐明潜在的紫檀芪作用机理为进一步的目标，测量了小鼠海马体中磷酰化ERK1/2的变化。
[0022]紫檀芪在lmg/kg和2mg/kg剂量下表现出抗焦虑作用:作为关键决定因素并视为与焦虑相关的百分比开放臂滞留时间(permanence Time in Open ^rms, ΡΤ0Α)和开放臂进入次数(Number of Entries in Open Arms, ΝΕ0Α)在限定的低剂量下增加(参见实施例2)。紫檀苗还能够在lmg/kg和2mg/kg两种剂量下增加百分比开放臂行进距离(XraveledDistance in Open Arms, TD0A) ?然而，较高的剂量(5mg/kg和lOmg/kg)未显示出任何抗焦虑效果；相反，较高的剂量具有增加对开放臂的厌恶的趋势，即较高的剂量为致焦虑的。紫檀芪的抗焦虑活性通过以下发现进一步证实:百分比封闭臂行进距离(IraveledDistance in the Enclosed Arms, TDEA)和百分比封闭臂滞留时间(Permanence Time inthe Enclosed Arms, PTEA)也在用lmg/kg和2mg/kg紫檀苗处理时缩短。另外,紫檀苗的抗焦虑活性与安定非常相似。2mg/kg的紫檀芪显示出与2mg/kg安定至少在EPM中相当的效果。使用安定作为阳性对照因而进一步证实了紫檀芪在EPM行为典范中的抗焦虑潜力。封闭臂进入次数(Number of Entries in the Enclosed Arms, NEEA)(由于其独立于 NEOA和PTOA而变化，是自主活动的完美度量)在用于本实验的剂量范围内无变化。值得一提的是，紫檀芪的母体分子白藜芦醇在3mg/kg和20mg/kg的剂量下测试时不具有任何抗焦虑效果(Patisaul 等人 2009.Hormones and Behavior55:319-328)。[0023]对动物的自主活动进行了评估以证实在较低的剂量(lmg/kg和2mg/kg)下紫檀芪的抗焦虑活性不是化合物对动物活动度抑制作用的继发结果。在较高剂量(5mg/kg和10mg/kg)下不存在抗焦虑效果不是因为运动损伤。因此，未记录到刺激或抑制作用，从而表明所观察到的抗焦虑效果为假阳性的可能性极低。
[0024]除了 EPM和自主活动测试外，我们还通过研究在焦虑中发挥作用的蛋白表达关注于能够解释所观察到的紫檀芪抗焦虑样作用的分子底物。在Western印迹研究中所得的结果显示出在用在EPM中证实了抗焦虑效果的那些低剂量(lmg/kg和2mg/kg)紫檀苗处理的动物的海马体中磷酰化ERKl水平的显著降低。也观察到了相同剂量下海马体中ERK2的磷酰化状态的轻度降低。重要的是，较高的剂量(5mg/kg和10mg/kg)不能导致ERK1/2磷酰化状态的任何变化与在相同剂量下在EPM中观察到的化合物无抗焦虑效果一致。此外，Akt家族中的三种基因(Aktl、Akt2和Akt3)编码为丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族(EC2.7.11.1)成员的酶，并且我们的分析表明在动物的海马体中磷酰化Akt水平无变化。因此，我们的结果表明，紫檀芪的抗焦虑作用与其降低小鼠海马体中ERK活性的能力之间存在关联。其他研究已表明，紫檀芪阻断RAW264.7细胞中ERK1/2的活化(Pan等人2008.J.Agric.Food Chem.56:7502-7509)。我们的研究首次在活体内证实了特定低剂量的紫檀芪下调ERK1/2的活化。
[0025]最近的报道指出，在不同脑区域(包括海马体和前额皮质(PFC))中pERK的水平在焦虑期间显著升高，并且其受到抑制能够产生抗焦虑样作用(Ailing等人，上文；Martinez 等人 2009.Pharmacol.Biochem.Behav.92:291-296)。这一事实与绿茶多酚类化合物表没食子儿茶素-3-没食子酸酯在小鼠中急性施用后观察到的抗焦虑样活性一致(Vignes等人2006.Brain Res.1110:102-115)，并且该化合物还具有降低ERKI/2磷酰化状态的能力(Chung 等人，2001.FASEB J.15:2022-2024; Sah 等人 2004.J.Biol.Chem.279:12755-12762)。此外，据报道，pERKl/2的持续性核聚集被称为具有危害性后果的事件(Colucc1-D，Amato等人2002.Bioessays25:1085-1095)。在慢性应激后增强的PERK1/2信号转导通过在边缘结构施用环状17 β -雌二醇而阻止，这可避免复发性应激的危害性后果(Gerrits等人，上文)。更鼓舞人心地，使用MEK抑制剂抑制ERK通路还显示出对多种器官损害的治疗性效果(Otani等人2007.J.Clin.Neurosc1.14:42-48)。
[0026]脑含有可潜在改变MAP激酶磷酰化的多种受体(如NMDA、GABA)和离子通道。证实通过NMDA受体活化MAP激酶的研究已有充分的记载(Xia等人1996.J.Neurosc1.16:5425-5436; Orban 等人 1999.Trends Neurosc1.22:38-44)。另外，多项研究涉及作为GABA受体功能负调节子的ERK/MAPK通路(Bel1-Horner等人2006.J.Neurobiol.66:1467-1474)。ERK1/2磷酰化的降低由NMDA受体阻断还是由GABA受体活化介导是我们正在进行的研究的课题。
[0027]鉴于在较高剂量下紫檀芪不明显改变自主活动或导致明显的减少，有人可能会争论为什么该化合物在较高的剂量下不能在EPM测试中表现出任何抗焦虑样作用。在啮齿类动物探索新环境(EPM在这里即为新环境)时，工作记忆缓冲区的容量可开始至少部分地发挥作用，即便EPM不纯粹是行为典范。空间学习对于动物认识EPM中的开放臂和封闭臂位置也具有重要意义，并且获取空间信息取决于海马体功能(Olton和Papas.1979.Neuropsychologial7:669-682)。因此,可能的是,初始EPM经验可能与时间相关地改变小鼠在相同迷宫场景中接下来的行为。此外，高剂量紫檀芪(10mg/kg)能够改善认知表现，尤其是大鼠中的空间记忆(Jos印h等人，上文)。实际上，我们在研究中发现，在10mg/kg的剂量下，紫檀芪的水平为1.1217ng/海马体(表2)，这与上文Jos印h等人报道的相似。因此，可合理推测，同时作用于记忆通路的高剂量(5和10mg/kg)下的紫檀芪可能提高了小鼠工作记忆缓冲区的容量，从而在它们最初暴露于EPM中的开放臂后限制它们对引起应激的、厌恶性开放臂的探索行为。这一见解通过以下发现进一步加强:高剂量下的紫檀芪与低剂量相比增加了海马体中磷酰化ERK的水平，从而表明提高的pERK水平可在增大工作记忆缓冲区中发挥了作用。
[0028]我们的结果首次证实了作为蓝莓组分的紫檀芪在小鼠高架十字迷宫测试中显示出抗焦虑样作用。另外，较高剂量的紫檀芪在EPM和自主活动监测室中未显示出任何镇静趋势，从而表明化合物的良性副作用特征。化合物的抗焦虑活性伴有动物海马体中ERK1/2磷酰化的下调。然而，还需要将来的研究以更好地理解紫檀芪下调ERK磷酰化的机理。
[0029]本发明的化合物因此具有治疗、缓解或预防对其有需要的受试者的焦虑的用途。在一个特殊实施方案中，本发明的化合物被视为可用于治疗、预防或缓解焦虑障碍，诸如具有或不具有广场恐怖症的惊恐障碍、不具有惊恐障碍史的广场恐怖症、动物及其他恐惧症(包括社交恐惧症)、强迫性精神障碍和广泛性或药物诱发型焦虑障碍；应激障碍，包括创伤后和急性应激障碍；睡眠障碍；记忆障碍；神经症;惊厥性疾患，例如癫痫、痉挛、抽搐或儿童高热惊厥；偏头痛；情绪障碍；抑郁或双极障碍，例如抑郁、首发或复发性大抑郁障碍、轻郁症、双极障碍、双极I及双极II型躁郁症、和循环性情绪障碍、精神病性障碍，包括精神分裂症；由脑缺血引起的神经变性；注意力缺陷多动障碍；疼痛和伤害感受，例如神经性疼痛；呕吐，包括急性、延迟性和预期性呕吐，尤其是因化疗或辐射引起的呕吐；晕动病、术后恶心及呕吐；进食障碍，包括神经性厌食症和暴食症；经前期综合征；神经痛，例如三叉神经痛；肌肉痉挛或强直状态，例如在截瘫患者中；药物滥用或依赖的影响，包括戒酒；认知障碍，诸如阿尔茨海默病；脑缺血、中风、头部外伤；耳鸣；以及生理节律障碍，例如在遭受时差或倒班影响的受试者中。
[0030]根据本发明的含有紫檀`芪或药学上可接受的紫檀芪盐的组合物可通过用于共混及混合化合物的常规程序而制备。优选地，组合物还包含赋形剂，最优选药学赋形剂。包含赋形剂并结合了紫檀芪的组合物可通过本领域已知的程序制备。例如，可将紫檀芪配制成片剂、胶囊剂、散剂、混悬剂、经口施用溶液剂和肠胃外施用溶液剂(包括静脉内、真皮内、肌内和皮下施用)，以及配制成涂敷到贴片上以与常见的常规载体、粘结剂、稀释剂和赋形剂一起透皮应用的溶液。
[0031]虽然可将用于治疗的本发明的化合物以原始化合物的形式施用，但是优选的是，将活性成分(优选地以生理上可接受的盐的形式)与一种或多种佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂、稀释剂和/或其他通常的药学助剂一起引入药物组合物中。
[0032]在一个优选的实施方案中，本发明提供药物组合物，该药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体以及任选地本领域已知的并用于本领域的其他治疗性和/或预防性成分一起的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或衍生物。从与配方的其他成分相容并且对其受体无害的意义上讲，载体必须是“可接受的”。
[0033]本发明的药物组合物可以是适于经口、直肠、支气管、鼻腔、肺、局部(包括颊面和舌下)、经皮、阴道或肠胃外(包括皮肤、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、大脑内、眼内注射或输注)施用的那些，或以适于通过吸入或吹入而施用(包括粉末和液体气溶胶施用或通过持续释放体系施用)的剂型的那些。持续释放体系的合适实例包括含有本发明化合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质可以为成型制品的形式，例如膜或微囊。
[0034]因此，与常规佐剂、载体或稀释剂一起的本发明化合物可置于药物组合物的剂型和其单位剂型中。此类剂型包括固体剂型，具体地讲，片剂、充填胶囊剂、散剂和颗粒剂；以及液体剂型，具体地讲，均供经口使用的水性或非水性溶液剂、混悬剂、乳剂、酏剂和充填液体的胶囊剂，供直肠给药的栓剂，以及供肠胃外使用的无菌注射用溶液剂。此类药物组合物及其单位剂型可包含常规比例的常规成分，具有或不具有另外的活性化合物或组成部分，并且此类单位剂型可包含与要采用的预期每日剂量范围相应的任何适当有效量的活性成分。
[0035]本发明的化合物可以多种经口和肠胃外剂型施用。对本领域的技术人员将显而易见的是，以下剂型可包含作为活性组分的本发明化合物或本发明化合物的药学上可接受的盐。
[0036]对于由本发明的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和分散性颗粒剂。固体载体可以是一种或多种也可用作稀释剂、矫味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘结剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的物质。
[0037]在散剂中，载体是细分的固体，其与细分的活性组分一起处于混合物中。在片剂中，将活性成分与合适比例 的具有必要粘结能力的载体混合，然后以所需的形状和大小压片。
[0038]散剂和片剂优选地包含5%或10%至约70%的活性化合物。合适的载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制剂”旨在包括活性化合物与包封材料(作为提供胶囊的载体)的配方，在胶囊中含或不含载体的活性组分被载体围绕，载体因而与活性组分相联系。相似地，也包括扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适合经口施用的固体剂型。
[0039]液体制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂，例如水或水-丙二醇溶液剂。例如，肠胃外注射用液体制剂可在水性丙二醇溶液中配制成溶液剂。根据本发明的化合物可因此配制成供肠胃外施用(例如通过注射，例如推注或连续输注)并可以单位剂型与外加的防腐剂一起存在于安瓿、预充注射器、小容量注射液中或存在于多剂量容器中。组合物可呈诸如油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂的剂型，并可包含诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂的配方剂。作为另外一种选择，活性成分可以为通过无菌固体的无菌分装或通过溶液的冻干而得到的粉末形式，以在使用前通过合适的媒介物例如无菌、无热原水复溶。
[0040]适于经口使用的水溶液可通过将活性成分溶于水并根据需要添加合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂而制备。适于经口使用的水性混悬剂可通过将细分的活性组分与粘稠材料诸如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或其他熟知的助悬剂一起分散在水中而制备。
[0041]对于向表皮局部施用，可将本发明的化合物配制成膏剂、霜剂或洗液，或配制成透皮贴片。膏剂和霜剂可例如通过添加合适的增稠剂和/或胶凝剂由水性或油性基料配制而成。洗液可通过水性或油性基料配制而成并且通常还将包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或着色剂。
[0042]适于在口腔局部施用的组合物包括在矫味基料(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中包含活性剂的锭剂；在惰性基料(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含活性成分的锭剂(pastilles);以及在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水。
[0043]溶液剂或混悬剂可通过常规装置(例如通过点滴器、吸管或喷雾器)直接应用于鼻腔。组合物可以单剂量或多剂量形式提供。在旨在用于呼吸道施用的组合物(包括鼻内给药组合物)中，化合物将通常具有较小的粒度，例如约5微米或更小。这样的粒度可通过本领域已知的方式例如通过微粉化而获得。
[0044]药物制剂优选地为单位剂量形式。在这种形式中，将制剂分成含有适量活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以是包装好的制剂，而包装则含有制剂的离散量，诸如包装好的片剂、胶囊剂以及小瓶或安瓿中的粉末。另外，单位剂量形式可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以为包装形式的合适数量的任何这些制剂。
[0045]供经口施用的片剂、胶囊剂和锭剂以及供静脉内施用和连续输注的液体是优选的组合物。应用到鼻腔或呼吸道的溶液剂或混悬剂是优选的组合物。供表皮局部施用的透皮贴片是优选的。
[0046]有关配方和施用的进一步详细信息可见于最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing C0.，Easton, PA)。
[0047]在本发明的另一方面，提供治疗、预防或缓解对其有需要的受试者的焦虑的方法，并且该方法包括向对其有需要的这样的受试者(包括人)施用有效量的本发明的紫檀芪。
[0048]治疗有效剂量是指改善症状或病状的活性成分的量。疗效和毒性(例如ED5tl和LD50)可通过在细胞培养或实验动物中`的标准药理学程序加以测定。治疗性与毒性效应之间的剂量比率是治疗指数，并可以通过比率LD5(i/ED5(i表示。表现出具有大治疗指数的药物组合物是优选的。
[0049]根据本发明使用的化合物的剂量取决于化合物和进行治疗的病状。接受患者的年龄、瘦体重、总体重、体表面积和临床病状；以及施行治疗的临床医生或从业者的经验和判断都属于影响所选剂量的因素。其他因素包括施用途径、患者病史、病程严重性和特定化合物的效能。剂量应当足以改善所治疗疾病的症状或体征，而不会对患者产生不可接受的毒性。剂量可通过将剂量针对本发明的特定情况加以调整以产生所需治疗性效果而变化。
[0050]药物剂量从动物研究适当地转化到人类研究(人体等效剂量，HED)通过使用体表面积(BSA)归一化方法获得。动物和人类的剂量相互关系(基于每平方米体表面的毫克数)由 Reagan-Shaw 等人(2007.FASEB J.22:659-661)进行了描述。通过对 BSA(mg/m2)的归
一化从动物剂量到人类剂量的剂量转化公式为:
[0051]
HED (mg/kg) ^ ___量_9_》χ


人失氏.H
[0052]其中将K111因子(体重(kg)除以BSA(m2))用于将用在动物研究中的mg/kg剂量转化成mg/m2。小鼠的Km因子为3,而人类的Km因子为37。表格(表1，Reagan-Shaw等人，上文)列出了基于得自FDA指南的数据而为若干动物物种计算出的Km因子。
[0053]紫檀芪以足以治疗、缓解或预防对其有需要的受试者的焦虑的量存在于组合物中。在一个最优选的实施方案中，紫檀芪以足以单独地治疗、缓解或预防焦虑的量存在于组合物中。活性成分可在一天分一个或多个剂量施用。令人满意的结果在某些情况下可在低至0.0405mg/kg的口服人体等效剂量(HED)的剂量下或对于60kg的人类患者约3mg/天的口服剂量下至对于60kg的人类患者约15mg/天的口服剂量下获得。鉴于紫檀芪具有约2小时的半衰期，对于所述人类患者而言，合适的范围可以为约IOmg/天口服至约IOOmg/天口服。
[0054] 本发明设想，合适的剂量范围对于人类患者而言为每天lO-lOOmg，照常取决于精确的施用模式、施用的剂型、施用的适应症、涉及的受试者和涉及的受试者的体重及体表面积，另外还有所负责的医生或兽医的偏好和经验。当联合用于治疗疾病的本领域已知的化合物施用时，可以降低给药方案。
实施例
[0055]现在已对本发明进行了大体描述，而通过参考某些具体实施例将能更好地理解本发明，这些实施例包括在本文中只是为了进一步阐述本发明而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将由权利要求书加以限定。
[0056]实施例1
[0057]紫檀芪
[0058]如前人所述合成了紫檀芪(Jos印h等人，上文)。简而言之，紫檀芪通过3，5-二甲氧基苯甲醛和4-羟基苯乙酸在乙酸酐和三乙胺中的缩合而合成。将反应混合物在氮气氛围下加热(150°C)并连续搅拌。20h后，停止反应，冷却到室温，将浓盐酸(5mL)加入。沉淀形成，将沉淀溶于50mL氯仿，然后用10%氢氧化钠水溶液萃取。将水性萃取物用浓盐酸酸化到PH1，搅拌至少6h，得到中间产物α-[(3，5_ 二甲氧基苯基)亚甲基]_4_羟基-(α Ζ)苯乙酸的沉淀。将该中间产物与1.(^铜在101^喹啉中加热(2001:，611，氮气下)。将反应混合物冷却到室温并过滤。向滤液中加入5Ν盐酸(25mL)，搅拌lh，然后用氯仿萃取。将含有不纯紫檀苗的氯仿萃取物通过快速层析在Horizon HPFC系统(Biotage, Inc.，Charlottesville,VA)上纯化，其中使用硅胶柱和乙酸乙酯:己烷溶剂体系(从15:85至100%乙酸乙酯的线性梯度)。将含有纯紫檀芪的馏分合并，真空浓缩。将紫檀芪在己烷中重结晶，通过其光谱数据(UV、质谱和核磁共振光谱)确认了其结构(图1)。
[0059]将紫檀苗以lmg/kg与10mg/kg体重之间的剂量溶于氢化蓖麻油(cremophor)、乙醇和盐水(1:1:18)混合物中。在行为测试前lh，将10mL/kg的体积经口施用。
[0060]实施例2
[0061 ] 紫檀芪在鼠高架十字迷宫行为研究中的作用
[0062]将测试时体重为24_30g的八周龄雄性Swiss Webster小鼠(Harlan, IN, USA)用于所有研究。将动物五只一组关在笼中，随意提供食物和水，维持在12:12h的光暗循环下。随机选择所有小鼠用于每个处理组。关养、处理和实验程序得到了 University ofMississippi 的 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)的批准，并遵守National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals 的规范。
[0063]对于高架十字迷宫(EPM)研究而言，EPM设备由两个开放臂(30X5cm)和两个封闭壁(30X5cm,壁高15cm)组成,这些臂从共同的中央平台(5X5cm)延伸。该构造形成了十字符号的形状，类似的臂彼此相对布置。设备高于地面50cm。
[0064]将动物(n=6-10只/组)在紫檀芪或安定处理前在EPM室中驯化30分钟。虽然紫檀芪经口给予，但安定却经腹膜内(1.p.)施用。在分别通过口服强饲法和1.p.完成紫檀芪或安定施用后，分别让小鼠呆在相同的室中60分钟和30分钟，然后进行EPM试验。之后，将小鼠单独地置于设备的中心，面向开放臂，让其自由探索5分钟。测量了开放臂行进距离(TDOA)、封闭臂行进距离(TDEA)、开放臂滞留时间(PTOA)、封闭臂滞留时间(PTEA)、开放臂进入次数(NEOA)和封闭臂进入次数(NEEA);即使用计算机辅助视频跟踪系统(San DiegoInstruments, CA, USA)对行进距离的百分比、和花在开放臂及封闭臂上的时间、以及开放臂及封闭臂进入次数进行了定量。在每次试验后，将迷宫用玻璃清洁剂擦干净并干燥。当小鼠的所有四只爪子均在臂中时，记录为一次臂进入。花在开放臂中的时间的百分比和开放臂进入次数被视为焦虑的关键决定因素和纯粹度量(Hogg，上文)。
[0065]在这里，我们首次证实了紫檀芪在EPM中(图1)剂量依赖性地显示出具有抗焦虑样作用。抗焦虑作用在lmg/kg的化合物剂量下是明显的，在2mg/kg下达到最大值，然后在5mg/kg和10mg/kg剂量下减弱。当与对照(Omg/kg)相比时,紫檀苗显著增大了与抗焦虑样效果相关的所有参数:％开放臂行进距离(TDOA) [F(4, 43)=3.056，p < 0.05]、％开放臂滞留时间(PTOA) [F(4, 43)=2.657，p < 0.05]和开放臂进入次数(NEOA) [F(4, 43)=4.257，p<0.01](图2A)。另外，紫檀芪显示出与焦虑相关的封闭臂中参数的降低趋势，诸如％封闭臂行进距离(TDEA)、％封闭臂滞留时间(PTEA)以及封闭臂进入次数(NEEA)(图2B)。因此，通过2mg/kg的剂量获得了最大抗焦虑活性。10mg/kg的最高剂量无效。
[0066]通常，当动物向某一臂跨过某一阈值时，计为臂进入和退出(Hogg，上文)。在我们的实验中，当小鼠的所有四只爪`子都在臂中时，记录为臂进入。因此，可能的是，小鼠处于既不是迷宫的开放部分也不是封闭部分的中央方形区。在我们的记录中，我们将中央区视为与开放臂和封闭臂均分离，从而产生更精确并表示真实抗焦虑效果的结果。
[0067]实施例3
[0068]紫檀芪在鼠自发活动行为研究中的影响
[0069]为了测量自发活动,将成年Swiss Webster小鼠(n=8_10只/组)通过口服强饲法施用了紫檀芪。然后将每只小鼠置于自主活动室内，在树脂玻璃(Plexiglas)外壳中驯化30分钟。30分钟的驯化期后，使用自动化活动监测系统(San Diego Instruments, CA, USA)测量了 30分钟的自主活动。将总活动表示为每个室16个电池光子束的总中断数。
[0070]为了阐明对自发活动的影响，我们在以lmg/kg与10mg/kg之间剂量的紫檀芪处理后测量了动物的自主活动(图3)。单因素方差分析表明药物处理对自主活动物明显的影响。事后比较表明自发活动不受最大抗焦虑剂量的紫檀芪的影响。最高的剂量对动物的自主活动无任何影响。
[0071]实施例4
[0072]Western印迹分析:血液和组织
[0073]在EPM试验后，在肝素化采血瓶中通过下颌下静脉穿刺从每只小鼠采集了血样。然后将小鼠处死，迅速摘除脑。将它们的前额皮质(PFC)和海马体在冰上解剖出来,然后立即置于液氮中，在-80 V下储存，直至进一步加工。将血样在4°C下以2000rpm离心20分钟，以得到作为上清液的血浆。将血浆样品在_80°C下储存，直至使用。
[0074]如前人所述加以轻微改动进行了小鼠脑海马体的Western印迹分析(AlRahim等人2009.Biochemistry48:7713-7721)。简而言之，将冷冻的海马体在冰冷的匀化缓冲液[每 mL 缓冲液:50mM Tris-HCl (pH7.5) U50mM NaCl、5mM EDTA、1%NP_40、0.5mM DTT 以及IOyL Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific, IL, USA)]中匀化。将匀浆在4°C下以12，OOOg离心10分钟。收集上清液，补充了样品缓冲液，然后在95°C煮沸5分钟。制得的样品因而可直接用于Western印迹实验。使等量的蛋白(30 μ g)接受了 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%凝胶)，将吸附膜在含有5%脱脂乳的TBST缓冲液中在室温下封闭
I小时。然后将膜用抗憐酸化 ERK(Thr202/Tyr204, Cell Signaling Technologies, USA)抗体进行了孵育。将另一凝胶用相同的样品运行，然后将膜用抗β_肌动蛋白抗体(Cell signaling Technologies, USA)孵育。通过使用抗憐酸化 Akt (Ser473, Cellsignaling Technologies, USA)抗体然后通过抗 β -肌动蛋白抗体(Cell signalingTechnologies, USA)再次探查而检查了海马体中磷酸化Akt的表达水平。结合的抗体通过辣根过氧化物酶连接的抗兔抗体(Cell Signaling Technologies, USA)检测，并使用VersaDoc成像系统(Bio-Rad, USA)显色。相关的免疫反应性条带使用Quantity Onel-D分析软件(Bio-Rad，USA)进行了定量。为了评价ERK活化，将磷酸化ERK水平归一化到了β-肌动蛋白的水平。
[0075]考虑到pERK的水平在焦虑期间明显升高，并且ERK信号转导通路的抑制可能在产生抗焦虑作用中发挥着作用(Ailing等人，2008)，我们接下来测定了得自海马体的匀浆中的ERK1/2的磷酰化状态。 Western印迹分析揭露出在用lmg/kg和2mg/kg紫檀苗处理的小鼠的海马体匀浆中 ERK1[F(4, 15)=12.49，p < 0.001]和 ERK2[F(4, 15)=3.024，p < 0.05]磷酰化均降低(图4A和4B)。未在EPM中显示出任何抗焦虑样效果的剂量5mg/kg和IOmg/kg未显示出对ERK磷酰化的明显影响。还值得注意的是，ERKl磷酰化的降低比ERK2明显得多。在用紫檀芪处理的小鼠的前额皮质中，ERK的磷酰化无明显变化(数据未示出)。
[0076]为了确定这些效应是否是通过紫檀芪的中枢性作用对其他激酶磷酰化状态不加区别地降低的结果，我们测量了海马体中的磷酰化Akt水平。与明显的ERK磷酰化降低相对，据发现，Akt的磷酰化状态在用lmg/kg至10mg/kg范围内的化合物处理的小鼠的海马体中几乎无变化(图5)。
[0077]实施例5
[0078]通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析血浆和海马体以及PFC中的紫檀芪
[0079]将血浆保持在_80°C下，在提取前在冰上解冻。根据已公布的程序(Remsberg等人，上文)，将血浆用葡糖苷酸酶处理，以水解任何葡糖醛酸化的紫檀芪。简而言之，将50 μ L血浆(得自每只动物)转移到Eppendorf管中，然后将60 μ L β -葡糖苷酸酶溶液(5000U/mL磷酸钾缓冲液，75mM, pH6.8，37°C )加入。将混合物涡旋，然后在以750rpm振荡下在37°C孵育20小时。之后，将冰冷的HPLC级乙腈加入，涡旋，在5000rpm、4°C下离心5分钟。收集上清液，在氮气流下干燥。将干燥后的上清液用于GC-MS分析。
[0080]将海马体组织保持_80°C下，直至提取时。将得自2-3只动物的海马体(左和右)在Eppendorf管中合并，作为一个样品加工。向管中加入200 μ L磷酸盐缓冲液(0.2ΜNaH2P04:0.2Μ Na2HPO4)，将组织手动匀化2分钟。向100 μ I等分试样中加入50 μ L3 -葡糖苷酸酶(5000U/mL磷酸钾缓冲液)。将混合物涡旋，在振荡(750rpm)下孵育(37°C，20小时)。然后将样品离心(15分钟，7000g，4°C)。收集上清液，并通过乙酸乙酯(200 μ L，两次)进行分配。将乙酸乙酯层合并，在氮气流下干燥，然后用于GC-MS分析。以与海马体相同的方式进行了前额皮质(PFC)的提取；将得自三只动物的PFC组织合并，作为一个样品处理。
[0081]将氮气干燥的样品(血浆和脑组织提取物)用30yLl:l的Ν，0_双[三甲基甲娃烷基]三氟乙酰胺和二甲基甲酰胺(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)混合物处理，在70°C加热40分钟。使用配备了 J&W DB-5毛细管(0.25mm内径、0.25μπι膜厚和 30m 长；Agilent Technologies, Foster City, CA)的 JEOL GCMate II 仪器(JE0L USAInc.，Peabody, MA)分析了衍生化样品的紫檀芪水平。GC升温程序为:初始190°C，以20°C /min的速率升至240°C，以2.5°C /min的速率升至280°C，最后以30°C /min的速率升至300°C，然后保持在该温度下0.5分钟。载气为超高纯氦气，流速为lmL/min。进样口、GC-MS接口和电离室分别保持在250°C、230°C和230°C。进样量为2yL (不分流进样)。质谱以正、选择离子监测模式(m/z328、313和297)采集；电子轰击70eV。GC-MS分析一式两份地进行。紫檀芪的保留时间为10.2分钟。使用之前已表征了结构和纯度的紫檀芪合成样品作为外标，对紫檀芪进行了定量。
[0082]据发现，lmg/kg剂量下的紫檀芪血浆水平为10.08±6.67ng/mL,并随着剂量相应地升高，在10mg/kg下达到130.26±40.25ng/mL (表1)。在lmg/kg剂量下，能够检测到海马体组织中的紫檀芪水平，但低于定量限(0.0840ng)。在2、5和10mg/kg剂量下，水平可以定量，并在0.2627-1.1217ng/海马体的范围内(表2)。对于所有施用剂量，在前额皮质组织中仅发现了痕量的紫檀芪(无法定量)。
[0083]表1.紫檀芪在血浆中 的水平。
[0084]
【权利要求】
1.一种治疗、缓解或预防对其有需要的受试者的焦虑的方法，包括向所述受试者施用包含治疗有效量的紫檀芪的药物或营养组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是患有因诸如灾难性事件、环境变化或旅行的情况导致的焦虑的哺乳动物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是患有因诸如睡眠障碍、肥胖症或抑郁的病状导致的焦虑的人。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是患有作为诸如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈病、糖尿病和癌症的疾病的副作用的焦虑的人。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述量是基于所述哺乳动物的体重和体表面积的总量。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述量是约IOmg/天至约IOOmg/天的总量。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养组合物是食物或饮料或者食物或饮料的补充组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述量以约IOmg/天至约IOOmg/天的量存在。
9.一种治疗、缓解或预防焦虑的试剂盒，其中所述试剂盒包含: 根据权利要求1的含有有效量`紫檀芪的组合物；以及容纳所述组合物的容器。
【文档编号】A61K31/05GK103561729SQ201280022178
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月10日 优先权日:2011年5月11日
【发明者】阿格尼斯·M·里曼多, 阿比尔·厄尔-阿勒菲, 穆德·阿尔·拉希姆 申请人:美国农业部, 密西西比大学