胰腺β-细胞增殖的调节的制作方法
【专利摘要】在一种实施方式中，本文描述的工作提供了一种用于增加需要的对象中胰腺β-细胞的增殖或复制的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的提高肝细胞癌相关蛋白TD26（TD26）的水平或活性的药剂，由此增加胰腺β-细胞的增殖或复制。这样的药剂可以通过例如提高所述对象中活性TD26的水平或通过提高所述对象中TD26的功能活性来发挥作用。
【专利说明】胰腺β-细胞增殖的调节
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年6月10日提交的美国临时申请系列号61/495，868和2012年3月21日提交的美国临时申请系列号61/613，856的权益，所述申请的教导通过参考以其整体并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本申请利用国立卫生研究院(Nat1nal Institutes of Health)授予的DK090781政府支持做出。美国政府在本发明中具有一定权利。
【背景技术】
[0005]细胞是位于胰岛中的一种类型的胰腺细胞，其制造和分泌胰岛素，胰岛素是一种控制血液中的葡萄糖水平的激素。β-细胞能够通过释放储存的胰岛素对血糖的增加作出快速响应，并在同时产生附加的胰岛素用于将来的需要。β_细胞的功能受损和/或数量减少与代谢疾病相关，所述代谢疾病包括糖尿病、肥胖症和其他疾病。
[0006]糖尿病是源自于 多种致病因素并以空腹状态下血浆葡萄糖水平升高(高血糖症)为特征的疾病。存在两种主要形式的糖尿病:(I)胰岛素依赖型或I型糖尿病(也称为青少年糖尿病)和(2)非胰岛素依赖型或II型糖尿病(也称为NIDDM)。
[0007]I型糖尿病由胰腺细胞的损失引起的胰岛素缺乏造成，这通常是胰岛的自体免疫破坏的结果。因此，在患有I型糖尿病的患者中，由胰岛细胞产生的胰岛素的量过低，导致血糖水平升高(高血糖症)。患有I型糖尿病的患者一般需要终生胰岛素治疗,但是即使频繁地每日注射胰岛素，也难以充分控制血糖水平。已经开发了能够减少免疫系统介导的胰岛破坏的治疗；然而，由于人类β -细胞的再生相对缓慢，因此单独的这种治疗不是改善糖尿病病症的令人满意的手段。然而，这些疗法可以有利地与能够刺激β-细胞再生的治疗剂相组合。
[0008]在2型糖尿病患者中，肝细胞和肌细胞失去它们对正常血液胰岛素水平作出响应的正常能力(胰岛素抗性)，引起高血糖水平。此外，II型糖尿病患者表现出β-细胞功能受损和β-细胞凋亡增加，引起总β-细胞团随时间的减少。最终，施用外源胰岛素在2型糖尿病患者中变成必需的。
[0009]治疗糖尿病的常规方法包括在I型糖尿病的情形中施用流体和胰岛素，以及在II型糖尿病中施用各种降血糖药剂。不幸的是，许多已知的降血糖药剂表现出不希望的副作用和毒性。因此，对于I型和2型糖尿病两者来说，需要开发能够刺激β-细胞增殖的药剂以用于治疗性方法和制剂。
【发明内容】
[0010]在一种实施方式中，本文描述的工作提供了一种用于增加需要的对象中胰腺β -细胞的增殖或复制的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，由此增加胰腺细胞的增殖或复制。这样的药剂可以通过例如提高所述对象中活性TD26的水平或通过提高所述对象中TD26的功能活性来发挥作用。
[0011]在一种实施方式中，本文描述了一种用于治疗或预防对象中与内源胰岛素水平降低相关的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的提高肝细胞癌相关蛋白TD26(TD26)的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增加胰腺β -细胞增殖并提高内源胰岛素水平。在一种实施方式中，所述药剂是TD26蛋白或其功能性部分或者编码TD26或其功能性部分的核苷酸序列。
[0012]还描述了一种用于治疗或预防对象中与内源胰岛素抗性相关的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增加胰腺β_细胞增殖并提高内源胰岛素水平。在一种实施方式中，所述药剂是TD26蛋白或其功能性部分或者编码TD26或其功能性部分的核苷酸序列。
[0013]在特定实施方式中，所施用的药剂提高所述对象中内源TD26的水平。在一种情况下，所述药剂提高TD26的表达。在另一种情况下，所述药剂增加TD26的分泌。在另一种情况下，所述药剂提高TD26的稳定性，或者防止或以其他方式减缓TD26的降解。应该认识到，本发明设想了能够提高所述对象中TD26的水平或增加TD26半衰期的任何药剂。 [0014]在某些实施方式中，所述药剂是TD26蛋白或其功能性部分(例如卷曲螺旋结构域或缺少天然信号序列的TD26蛋白)。在某些实施方式中，TD26蛋白包含SEQ ID NO: 1、SEQID NO:2,SEQ IDN0:3或SEQ IDN0:4。在某些实施方式中，功能性部分例如可以是比完整的TD26氨基酸序列小、缺少天然信号序列并包含SEQ ID NO:1的第22-76位、第48-76位或第77-135位氨基酸的氨基酸序列的多肽。
[0015]在其他实施方式中，所述药剂是编码TD26蛋白或TD26的功能性部分的核酸。在某些实施方式中，所述核酸包含SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15的全部或一部分。
[0016]在其他实施方式中，所述药剂是胰岛素受体拮抗剂。例如，所述药剂可以选自S661、S661的功能性部分、S961、S961的功能性部分、RB537和RB537的功能性部分。在某些情况下，所述药剂包含SEQ ID NO: 16的全部或功能性部分。
[0017]在某些实施方式中，所述胰岛素受体拮抗剂以优选地引起很少或不引起血糖水平升高或仅引起血糖水平暂时升高的剂量施用。在所述剂量引起血糖水平升高的情况下，它可以与针对所述血糖水平的其他治疗剂联合使用。作为非限制性实例，所述胰岛素受体拮抗剂在某些情况下可以以低于约10 μ Mol/Kg/周(例如低于约9 μ Mol/Kg/周、约8 μ Mol/Kg/ 周、约 7 μ Mol/Kg/ 周、约 6 μ Mol/Kg/ 周、约 5 μ Mol/Kg/ 周、约 4 μ Mol/Kg/ 周、约3 μ Mol/Kg/ 周、约 2 μ Mol/Kg/ 周、约 I μ Mol/Kg/ 周、约 0.90 μ Mol/Kg/ 周、约 0.80 μ Mol/Kg/ 周、约 0.70 μ Mol/Kg/ 周、约 0.60 μ Mol/Kg/ 周、约 0.50 μ Mol/Kg/ 周、约 0.40 μ Mol/Kg/周、约 0.30 μ Mol/Kg/周、约 0.20 μ Mol/Kg/周、约 0.10 μ Mol/Kg/周)的剂量施用于所述对象。在特定实施方式中，所述胰岛素受体拮抗剂以约ΙμΜοΙ/Kg/周的剂量施用于所述对象。
[0018]在某些所描述的实施方式中，所述疾病选自糖尿病(例如I型糖尿病或II型糖尿病)、代谢综合征、葡萄糖耐受不良和肥胖症。
[0019]还公开了一种鉴定用于治疗与内源胰岛素水平降低相关的疾病的候选治疗剂(例如胰岛素受体拮抗剂)的方法，所述方法包括将适合的细胞与受试药剂相接触；以及测定所述受试药剂对TD26的水平或活性的影响，其中提高TD26水平或活性的受试药剂是用于治疗与内源胰岛素水平降低相关的疾病的候选治疗剂。在某些情况下，通过将所述受试药剂的影响与已知提高TD26水平或活性的治疗剂的影响进行比较，来评估所述受试药剂对TD26的水平或活性的影响。通过本文描述的工作鉴定到的一种这样的治疗剂是例如S961。在某些情况下，通过测定所述受试药剂对TD26的基因表达水平的影响来评估所述受试药剂对TD26的水平或活性的影响。
[0020]在其他情况下，本发明设想了通过施用一种或多种胰岛素受体拮抗剂来增加β-细胞复制或增殖的方法。适合的拮抗剂例如可以干扰胰岛素与胰岛素受体相互作用的能力，或可以中和胰岛素的生物学效应。胰岛素受体拮抗剂例如可以提高TD26的水平或活性，优选地不显著提高血糖水平或仅暂时提高血糖水平。在某些实施方式中，本文描述了通过施用一种或多种胰岛素受体拮抗剂来治疗糖尿病的方法。
[0021]应该理解，本发明的所有情况可以与本文中描述的其他情况相组合，并且仅仅出于简洁的目的，没有穷举性地列出所有可能的组合和排列。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属【技术领域】的普通技术人员通常理解的具有相同含义。尽管在本发明的实践中可以使用与本文中所描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但在下面出于示例的目的描述了适合的方法和材料。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，以其全文明确地通过参考并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。本文中描述的材料、方法和实施例仅仅是说明性的而不打算是限制性的。本发明的其他特征和优点从下面的详细描述和权利要求书将变得显而易见并被其所涵盖。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1A-1D显示 了胰岛素受体拮抗剂S961诱导β-细胞复制。图1A示出了使用对照处理10天，图1B示出了使用S961处理10天(三重免疫荧光染色，使用DAPI作为细胞核的标志物，为蓝色，抗胰岛素抗体染色作为β -细胞的标志物，为绿色，抗Ki67抗体(复制和细胞增殖的标志物)将增殖细胞的细胞核标记为红色)。白色箭头指向复制的细胞。图1C是条形图，示出了使用剂量逐渐增加(从0.125 μ Mol/Kg/周至I μ Mol/Kg/周)的S961处理7天后的Ki67+/胰岛素+%。图1D是条形图，示出了在用剂量逐渐增加(从0.125 μ Mol/Kg/周至I μ Mol/Kg/周)的S961处理7天后β -细胞面积/胰腺面积的显著增加。这些实验中的对照是不含S961的介质。为了计算Ki67+/胰岛素+百分率和β-细胞面积/胰腺面积，将整个胰腺冷冻切片并免疫染色，并使用标准的图形分析工具例如Metamorph和Photoshop进行定量。
[0023]图2A-2F显示了受胰岛素受体拮抗剂S961诱导的基因TD26在肝脏中高表达，并且是分泌蛋白。图2A示出了在用S961处理7天后肝脏组织的基因表达微阵列分析。接近于对角线的基因在处理和未处理的肝脏中显示出相似的表达值。在标为“3倍”的红色细线之间的区域之外的点，表示在处理条件下显著上调或下调的基因。用黑色箭头标出的一个上调基因是EG624219(TD26的小鼠直系同源物)。图2B示出了在用胰岛素受体拮抗剂S961处理7天的小鼠中TD26mRNA的相对表达。在S961处理后，肝脏和脂肪中的TD26表达提高。图2C示出了 TD26的小鼠直系同源物的预测的外显子结构。图2D示出了 TD26蛋白与小鼠和大鼠直系同源物的序列比对(人类(Homo sapiens, SEQ ID NO:1),小鼠(Mus musculus, SEQID NO: 2)和大鼠(Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 3))以及共有序列(SEQ ID NO: 4)。在 N-端包含推定的信号肽。图2E示出了带有Myc标签的EG624219 (TD26的小鼠直系同源物)和TD26在!fepal-6细胞(小鼠肝细胞瘤细胞)中的表达。！fepal-6细胞已转染有携带与Myc标签融合的TD26的基因的质粒。用myc抗体对细胞进行染色。图2F是western印迹,其示出了在293T细胞中，带有myc标签的小鼠EG624219 (小鼠TD26蛋白)和带有myc标签的TD26在48小时后分泌到上清液中，表明TD26的小鼠直系同源物和人类TD26两者都是分泌蛋白。
[0024]图3A和3B根据来自于B1GPS在线数据库(http://b1gps.gnf.0rg)的组织微阵列数据显示了 TD26在人类(图3A)和小鼠(图3B)组织中的表达，其示出了高且特异性的基因表达。图3A示出了在人类肝脏中的高表达，而图3B示出了在小鼠褐色脂肪组织、肝脏和胰腺中的高表达。
[0025]图4A-4C示出了通过在第I天注射到尾静脉中，EG624219(小鼠TD26直系同源物)DNA的体内施用增加β -细胞复制。图4Α (对照(绿色荧光蛋白(GFP)))和4Β (EG624219)示出了第9天的结果；Ki67是复制的标志物。胰岛素的绿色染色示出了嵌套在胰腺外分泌部分中的胰岛。胰岛中的红色点示出了复制的细胞。图4C是条形图，其示出了对照(GFP)与EG624219相比的Ki67+/胰岛素+%。与对照注射的动物相比，EG624219注射的动物表现出β -细胞复制增加26倍(即EG624219注射的动物的平均值为5.76%，对照注射的动物的平均值为0.22%)。
[0026]图5示出了 TD26在各种不同物种中的预测的序列同源性，所述物种包括小鼠(Mus musculus)、狗(Canis familiaris)、鸡(Gallus gallus)、娃(Xenopus (Silurana)tropical is)、斑马鱼(Dan1 rer1)、负鼠(Monodelphis domestica)、猴(Macaca mulatta)和人类(Homo sapiens)。从该分析看出，TD26似乎是哺乳动物特有的基因，因为它没有在鸡、蛙或鱼中发现。
[0027]图6示出了人类TD26 (“查询”，包括预测的信号序列部分)与人类血管生成素相关蛋白3前体(“sbjet”)的序列同源性。TD26 (SEQ ID NO:5)与血管生成素相关蛋白3前体(SEQ ID NO:6)显示出22%的同一性和49%的同源性。
[0028]图7示出了小鼠TD26直系同源物(“查询”，EG624219 ；SEQ ID N0:7，其包括预测的信号序列部分)与小鼠血管生成素相关蛋白3前体(“sbjet”，SEQ ID N0:8)的序列同源性。
[0029]图8示出了血管生成素相关蛋白3前体(人类，被称为“angptl_3Hs”)(SEQ IDNO:9)、血管生成素相关蛋白3前体(小鼠，被称为“angptl-3Mm”)(SEQ ID NO: 10)、血管生成素相关蛋白4前体(人类，被称为“angptl-4Hs”)(SEQ ID NO: 11)、血管生成素相关蛋白4前体(小鼠，被称为 “angptl-4Mm”)(SEQ ID NO: 12)、TD26 直系同源物(小鼠，EG624219) (SEQ10勵:2)和人类了026 (SEQ ID NO:1)的序列同源性。
[0030]图9显不了小鼠和人类TD26蛋白两者都被预测为具有/[目号序列。
[0031]图10显示了人类TD26被预测为具有卷曲螺旋结构。
[0032]图11是示出了在施用各种浓度的S961后血糖水平(mg/dL)随时间变化的图，表明在施用S961后，β -细胞复制增加而不显著影响血糖水平。
[0033]图12是条形图，示出了在S661重复给药后，正常小鼠胰腺中的β-细胞复制。复制的增加被显示为与介质速率相比的增加倍数。通过免疫组织化学来分析复制。这些实验中的对照是不含S661的介质。
[0034]图13是条形图，其示出了在S661重复给药后，正常小鼠中的β-细胞复制。使用S661处理的细胞复制的增加被显示为复制的百分率。通过流式细胞术来分析复制。这些实验中的对照是不含S661的介质。(***p〈0.001 ;Student’ s T检验)
[0035]图14A-14C显示出在饮食诱导的肥胖症(D1)小鼠中，S661的体内施用增加β-细胞复制。图14 (A)示出了在S661重复给药后，在患有饮食诱导的肥胖症的小鼠的胰腺中，β-细胞的复制增加，图14 (B)示出了非β_细胞的复制。使用S661处理的β-细胞复制的增加被显示为复制百分率；对非细胞的复制没有影响。图14(C)证实S661处理引起相对于胰腺总面积而言胰岛面积增加。进行免疫组织化学来分析复制和胰岛面积。(*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;Student，s T 检验)
[0036]图15示出了通过注射到尾静脉中来体内施用编码小鼠TD26多肽片段的质粒，诱导β_细胞复制。这些实验中的对照是编码GFP的质粒。【具体实施方式】
[0037]本文描述的本发明的实施方式源自于肝细胞癌相关蛋白TD26 (在本文中称为“TD26”)诱导胰腺β -细胞增殖这一观察结果，以及胰岛素受体拮抗剂S961在低剂量下也诱导胰腺β_细胞增殖这一观察结果。调节、特别是提高β_细胞功能和细胞团并由此增加胰岛素分泌的能力，提供了用于治疗例如糖尿病的方式。因此，本文描述的工作提供了调节胰腺β -细胞增殖、血清胰岛素水平、脂肪酸水平和血糖水平的方法，以及用于治疗和/或预防包括糖尿病、肥胖症和代谢综合征的疾病的方法。
[0038]当在本文中使用时，术语细胞”或“胰腺细胞”包括原代胰腺细胞，源自于去分化细胞例如诱导 的多能干细胞(iPSC)的胰腺β-样细胞，或从另一种来源的细胞(例如肝细胞、成纤维细胞或胰腺外分泌细胞)直接重编程的胰腺β-样细胞。在一种实施方式中，β-细胞不是永生化细胞系(即β-细胞在培养中不无限期地增殖)。在一种实施方式中，β-细胞不是转化的细胞(即β-细胞不表现出转化性质，例如在软琼脂中生长或不存在接触抑制，这仅仅是两个实例)。
[0039]当在本文中使用时，术语“内源胰腺β -细胞”或“原代胰腺β -细胞”是指哺乳动物胰腺的胰岛素产生细胞或哺乳动物的胰腺β -细胞(β -细胞)表型的细胞。胰腺β -细胞的表型对于本领域普通技术人员来说是公知的，并且包括例如对葡萄糖水平的增加做出响应分泌胰岛素，表达诸如C-肽、PDX-1多肽和Glut2的标志物，以及独特的形态学特征，例如但不必定在体内在胰腺的胰岛中有序化，并且通常具有直径约9-15 μ m的小的纺锤样细胞。内源胰腺细胞可以在胰岛中发现。在本发明的方法中，原代胰腺细胞可以在体外作为胰岛的一部分而被接触。
[0040]当在本文中使用时，术语“胰岛素产生细胞”包括本文中描述的术语原代细胞以及本文中描述的术语胰腺β_样细胞，其以组成性或诱导性方式合成(即，转录胰岛素基因，翻译胰岛素原mRNA，以及将胰岛素原mRNA修饰成胰岛素蛋白)、表达(即，显现由胰岛素基因携带的表型特征)或分泌(将胰岛素释放到细胞外空间中)胰岛素。
[0041]在一种情况下，所述方法包括将细胞与调节TD26蛋白的水平或活性的化合物或药剂相接触，或向对象施用所述化合物或药剂。术语“调节蛋白水平或活性”是指上调(激活或提高活性)或下调(抑制)蛋白水平、活性或功能。在一种实施方式中，调节通过直接提高或抑制蛋白的活性、即通过与蛋白的直接物理相互作用来进行。在一种实施方式中，例如在信号转导中，通过激活或抑制蛋白活性的上游效应子，来间接调节蛋白的活性。
[0042]在特定情况下，所需化合物或药剂提高TD26的水平或活性(例如通过增加表达和/或分泌)。适合的化合物/药剂包括但不限于化学化合物和化学化合物的混合物，例如小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，生物大分子例如肽、蛋白和肽类似物及衍生物，肽模拟物，核酸，核酸类似物和衍生物，从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物的细胞或组织制得的提取物，天然存在或合成的组合物，肽，适体，以及抗体或其片段。化合物/药剂可以是核酸RNA或DNA，并且可以是单链或双链的。示例性核酸化合物包括但不限于编码蛋白质激活剂或抑制剂(例如转录激活剂或抑制剂)的核酸、寡核苷酸、核酸类似物(例如肽核酸(PNA)、假互补PNA (pc-PNA)、锁核酸(LNA)等)、反义分子、核酶、小的抑制性或激活性核酸序列(例如RNA1、shRNA1、siRNA、micro RNAi (mRNAi)、反义寡核苷酸等)。蛋白和/或肽类药剂可以是调苄基因表达或蛋白活性的任何蛋白。非限制性实例包括突变的蛋白、治疗性蛋白和截短的蛋白，例如其中所述蛋白在靶细胞中通常不存在或以较低水平表达。蛋白也可以选自遗传工程改造的蛋白、肽、合成肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体(例如干扰胰岛素与胰岛素受体之间的相互作用并提高TD26的水平或活性，从而导致β -细胞复制增加的抗体)、midibodies、微抗体(minibody )、三功能抗体(triabody)、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、修饰的蛋白及其片段。提高基因表达或提高基因所编码的蛋白的水平或活性的化合物或药剂，也被称为激活剂或激活性化合物。降低基因表达或降低基因所编码的蛋白的水平或活性的化合物或药剂，也被称为抑制剂或抑制性化合物。 [0043]在某些实施方式中，提高TD26水平或活性的药剂包括但不限于TD26蛋白或多肽(包括人类TD26及其同源物，以及来自于非人类物种例如小鼠的直系同源多肽和蛋白)及其功能性片段，编码TD26蛋白和多肽及其功能性片段的核酸分子，以及胰岛素受体拮抗剂。
[0044]本发明的方法设想了使用任何胰岛素受体拮抗剂。例如，胰岛素受体拮抗剂可以是干扰胰岛素与胰岛素受体相互作用的能力的药剂，以及能够中和胰岛素的生物学效应并优选地不显著提高血糖水平或仅暂时提高血糖水平的药剂。本领域技术人员将会理解，适合的胰岛素受体拮抗剂是与胰岛素信号转导相互作用并能增加β_细胞复制的拮抗剂。在某些实施方式中，这样的胰岛素受体拮抗剂提高TD26的水平或活性，并优选地不显著提高血糖水平或仅暂时提高血糖水平。应该理解，适合的胰岛素受体拮抗剂包括但不限于上面描述的任何适合的化合物/药剂，其在施用于个体时能够提高TD26的水平或活性并增加β -细胞复制，并且优选地不引起显著的、非暂时性的血糖水平升高。
[0045]在某些情况下，增加细胞复制的胰岛素受体拮抗剂可以是蛋白或肽。在某些实施方式中，蛋白或肽类胰岛素受体拮抗剂提高TD26的水平或活性。本领域技术人员将会理解，本发明的肽类胰岛素受体拮抗剂可以以它们的肽形式或作为编码所述肽并能够在体内翻译以产生具有所需生物活性的肽的核酸来施用。
[0046]在某些情况下，肽类胰岛素受体拮抗剂包含第一功能性部分、第二功能性部分和它们之间的连接物，所述连接物优选被工程化改造以具有柔性和/或溶解性。
[0047]第一和第二功能性部分可以包含例如表现出的对胰岛素受体的亲和性大于或等于胰岛素对胰岛素受体的亲和性的氨基酸序列(例如亲和性优化的位点)。
[0048]在某些实施方式中，第一功能性部分包含具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的肽。在某些实施方式中，第一功能性部分包含具有与SEQ ID NO: 18的同一性为至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。
[0049]在某些实施方式中，连接物包含柔性连接物。在某些实施方式中，连接物包含可溶的连接物。在某些实施方式中，连接物包含氨基酸连接物。在某些实施方式中，氨基酸连接物具有一个或多个氨基酸残基。在其他实施方式中，氨基酸连接物具有多达7个氨基酸残基。在某些实施方式中，连接物包含一个或多个甘氨酸残基和一个或多个丝氨酸残基。在某些实施方式中，连接物包含一个或多个GGS重复序列(例如GGS、GGSGGS, GGSGGSGGS等)。在一种实施方式中，柔性连接物包含SEQ ID NO: 19。在某些实施方式中，柔性连接物包含如Schaffer等(Schaffer等，PNAS100 (8):4435-4439 (2003)，其全部内容通过参考并入本文)中所描述的基于乙二醇的连接物。在一种实施方式中，连接物包含基于三乙二醇的连接物。
[0050]在某些实施方式中，第二功能性部分包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的肽。在某些实施方式中，第二功能性部分包含具有与SEQ ID NO:20的同一性为至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。在某些实施方式中，第二功能性部分包含具有氨基酸序列SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (SEQ ID N0:23)的肽。在某些实施方式中，第二功能性部分包含具有与SEQ ID NO: 23的同一性为至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。在某些实施方式中，第二功能性部分包含具有氨基酸序列L-Xaa-Xaa-EWA-Xaa-Xaa-QCEV-Xaa-GRGCPS (SEQ ID NO:24)的肽，其中Xaa是任何氨基酸。在某些实施方式中，第二功能性部分包含具有与SEQ ID NO:24的同一性为至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。 [0051]在某些实施方式中，增加细胞复制的肽类胰岛素受体拮抗剂包含肽S961(SEQID NO: 16，具有酸C-端)。在某些实施方式中，肽S961提高TD26的水平或活性，并优选地不显著提高血糖水平，或仅暂时提高血糖水平。
[0052]在某些情况下，肽S961 (或其功能性部分)或编码肽S961的核酸包含变体序列。变体序列可以包括一种或多种序列变体，只要这样的变体不消除增加β -细胞复制的效应即可。在某些实施方式中，序列变体包含保守变体。在优选实施方式中，本发明的编码S961肽的核酸包含与编码S961的核酸的同一'丨生为至少80%的核苷酸序列。
[0053]在某些实施方式中，本发明的S961肽包含与S961肽的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述S961肽包含与SEQ ID NO: 16的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述肽包含与SEQ ID NO: 18的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肽包含与SEQ ID NO:23的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肽包含以从N-端到C-的次序与SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:23的同一性为至少80%并具有酸C-端的氨基酸序列。
[0054]在某些实施方式中，增加细胞复制的肽类胰岛素受体拮抗剂包含肽S661(SEQID NO: 16，具有酰胺C-端)。在某些实施方式中，肽S661提高TD26的水平或活性，并优选地不显著提高血糖水平，或仅暂时提高血糖水平。在某些情况下，肽S661 (或其功能性部分)或编码肽S661的核酸包含变体序列，只要这样的变体不消除增加细胞复制的效应即可。在某些实施方式中，序列变体包含保守变体。在优选实施方式中，本发明的编码S661肽的核酸包含与编码S661的核酸的同一'丨生为至少80%的核苷酸序列。
[0055]在某些实施方式中，本发明的S661肽包含与S661肽的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述S661肽包含与SEQ ID NO: 16的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述肽包含与SEQ ID NO: 18的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肽包含与SEQ ID NO:23的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肽包含以从N-端到C-的次序与SEQ ID NO: 18、19和23的同一性为至少80%并具有酰胺C-端的氨基酸序列。
[0056]在某些实施方式中，增加细胞复制的肽类胰岛素受体拮抗剂包含肽RB537(SEQ ID NO: 17)。在某些实施方式中，肽RB537提高TD26的水平或活性，并优选地不显著提高血糖水平，或仅暂时提高血糖水平。在某些情况下，肽RB537 (或其功能性部分)或编码肽RB537的核酸包含变体序列，只要这样的变体不消除增加β-细胞复制的效应即可。在某些实施方式中，序列变体包含保守变体。在优选实施方式中，本发明的编码RB537肽的核酸包含与编码RB537的核酸的同一性为至少80%的核苷酸序列。
[0057]在某些实施方式中，本发明的RB537肽包含与RB537肽的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述RB537肽包含与SEQ ID NO: 17的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述RB537肽包含与SEQ ID NO: 18的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述RB537肽包含与SEQ ID NO: 20的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述RB537肽包含以从N-端到C-的次序与SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20的同一性为至少80%的氨基酸序列。
[0058]在某些实施方式中，增加细胞复制的胰岛素受体拮抗剂包含抗体。在某些实施方式中，增加β_细胞复制的胰岛素受体拮抗剂包含与胰岛素受体结合的抗体。在某些实施方式中，胰岛素受体拮抗剂抗体提高TD26的水平或活性，并优选地不显著提高血糖水平，或仅暂时提高血糖水平。当在本文中使用时，“抗体”以最宽泛的含义使用，并包括完全组装的抗体、四聚体抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、能够结合抗原的抗体片段(例如Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双功能抗体(diabody)),以及包含任何上述物质 的重组肽，只要它们表现出所需生物活性即可。“免疫球蛋白”或“四聚体抗体”是四聚体糖蛋白，其由两条重链和两条轻链构成，每条链包含可变区和恒定区。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶切割或化学切割来产生。抗体片段或抗原结合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体(dAb)、互补决定区(⑶R)片段、CDR移植抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体(triabody)、四功能抗体(tetrabody)、微抗体(minibody)、线性抗体、螯合重组抗体、tribody或bibody、胞内抗体(intrabody)、纳米抗体、小模块化免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼源化抗体、含VHH抗体、或其变体或衍生物，以及含有足以提供对多肽的特异性抗原结合的至少一部分免疫球蛋白例如1、2、3、4、5或6个CDR序列的多肽，只要抗体保留所需生物活性即可。“抗体变体”是指在天然抗体可变区结构域的可变区中含有至少一个氨基酸置换、缺失或插入的抗体多肽序列。变体可以与未修饰的抗体基本上同源或基本上一致。“嵌合抗体”是指含有源自于两种不同抗体的序列的抗体(参见例如美国专利号4，816，567)，所述两种不同抗体通常源自于不同物种。最通常情况下，嵌合抗体包含人类和啮齿类抗体片段，一般为人类恒定区和小鼠可变区。
[0059]在某些实施方式中，可能适合用于本发明的胰岛素受体拮抗剂的实例可以包括文献中报道的表现出所需生物活性的抗胰岛素受体抗体(参见例如Roth等，J B1l Chem.19830ct25; 258 (20): 12094-7 ；Morgan 等，Proc Natl Acad Sci U SA.1986Jan;83 (2):328-32 ；Taylor 等，B1chem J.1987Febl5;242 (I):123-9 ；Nagy等，Endocrinology.1990Jan;126 (I):45-52 ；和 Fujita 等,Acta Diabetol.2002Dec;39
(4):221-7).在某些实施方式中，抗胰岛素受体抗体可以提高TD26的水平或活性，并优选地不显著提高血糖水平，或仅暂时提高血糖水平。
[0060]在某些实施方式中，本发明设想了编码本发明的抗体和肽的多核苷酸。本发明还设想了包含这样的多核苷酸的载体、包含这样的多核苷酸或载体的宿主细胞以及生产本发明的抗体和多肽的方法，所述方法包括将这样的宿主细胞在培养基中在适合的条件下生长，并任选地从所述宿主细胞或培养基分离编码的抗体或多肽，任选地随后进一步纯化所述抗体或多肽。抗体的分离和纯化方法完全在本领域普通技术人员的水平范围之内。
[0061]在某些实施方式中，能够增加细胞复制的胰岛素受体拮抗剂包含化学化合物，例如低分子量有机分子。在某些实施方式中，所述化学化合物提高TD26的水平或活性。
[0062]术语“增加”、“提高”、“增强”或“激活”在本文中都用于一般性地表示显著量的增加。在本发明的这种和其他情况的某些实施方式中，与对照相比，TD26蛋白的水平或活性被提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少I倍、至少1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或更多。在本发明的这种和其他情况的某些实施方式中，蛋白活性的激活剂具有低于或等于500ηΜ、低于或等于250ηΜ、低于或等于100ηΜ、低于或等于50nM、低于或等于10nM、低于或等于InM、低于或等于0.1nM、低于或等于0.01nM或者低于或等于0.0OlnM的EC50。蛋白活性可以通过本领域技术人员公知的手段来测定，并且可以根据情况通过不同方法或测定法来测定。
[0063]在其他情况下，所述化合物或药剂降低TD26的水平或活性(例如通过降低表达和/或分泌)。降低TD26的表达和/或分泌对于治疗以胰岛素水平过高为特征的疾病来说可能是理想的，所述疾病可能因TD26水平或活性增加而加重，例如胰岛素瘤。
[0064]术语“减小”、“降低”、“减少”或“抑制”在本文中都用于一般性地表示显著量的降低。在本发明的这种和其他情况的某些实施方式中，与对照相比，基因所编码的蛋白的水平或活性被抑制或降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100% (例如活性完全丧失)。在本发明的这种和其他情况的某些实施方式中，抑制剂具有低于或等于500nM、低于或等于250nM、低于或等于100ηΜ、低于或等于50nM、低于或等于10nM、低于或等于InM、低于或等于0.1nM、低于或等于0.01nM或者低于或等于0.0OlnM的IC50。降低TD26水平或活性的化合物包括例如抗TD26抗体、靶向TD26的反义分子和靶向TD26的siRNA分子。
[0065]适合用于本发明的TD26蛋白和多肽包括例如人类TD26蛋白和多肽。人类TD26蛋白序列已被保存在GENBANK?，登记号为NP_061157.3。人类TD26蛋白的氨基酸序列为:
[0066]MPVPALCLLffALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA (SEQ ID NO:1 ;带下划线的为预测的信号序列)。
[0067]因此，在某些实施方式中，本文描述的方法包括将细胞或培养基与SEQ ID NO:1的多肽或其片段例如功能性部分(或编码所述多肽或片段的核酸)相接触，或者将它们施用到对象。当在本文中使用时，TD26的功能性部分或片段是在例如施用到哺乳动物后或在受试动物中增加细胞复制的功能性部分或片段。适合的片段包括例如缺少天然信号序列的SEQ ID NO:1的多肽和包含卷曲螺旋结构域(CXD)的SEQ ID NO:1的多肽部分。
[0068]在某些实施方式中，可用于在体内提高TD26的水平或活性和/或增加β-细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分，缺少一个或多个结构域(例如参考SEQ ID NO:1)。
[0069]在某些实施方式中，TD26的功能性部分缺少LPL结构域。在某些实施方式中，TD26的功能性部分缺少一个或多个CCD (例如缺少第一和/或第二 CCD)。在某些情况下，多肽可能缺少整个结构域，而在其他情况下，多肽可能缺少完整(完全)结构域(即可能含有一部分结构域)。在某些情况下，多肽可能缺少功能性结构域(例如功能性LPL结构域或功能性CCD )。
[0070]或者，可用于在体内提高TD26的水平或活性和/或增加β -细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分，包含TD26蛋白的一个或多个结构域(例如完整结构域或功能性结构域)。在某些实施方式中，TD26的功能性部分包含LPL结构域。在某些实施方式中，TD26的功能性部分包含一个或多个CXD (例如第一 CXD和/或第二 (XD)。在某些实施方式中，TD26的功能性部分包含TD26的第一和第二C⑶之间的一些或所有氨基酸序列(“间插序列”或 “IVS，，)。
[0071]在某些实施方式中，TD26的功能性部分不包含TD26的天然信号序列或完整的氨基酸序列或核苷酸序列，或者所述功能性部分不包括缺少信号肽的TD26的完整氨基酸序列或编码缺少信 号肽的TD26的完整氨基酸序列的核酸。应该理解，在许多分泌蛋白中，信号序列被切割掉，并且不是最终蛋白的多肽序列的一部分。
[0072]在一种实施方式中，可用于在体内增加细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第22至76位氨基酸的肽。在某些实施方式中，TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第22至76位氨基酸的肽，其包含一个或多个保守氨基酸置换，只要所述肽保留增加细胞复制的能力即可。
[0073]在一种实施方式中，可用于在体内增加细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含LPL结构域，但是缺少CCDUIVS和CCD2。在一种实施方式中，可用于在体内增加β -细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含预测的LPL结构域，但是缺少预测的CXDl、预测的IVS和预测的(XD2。
[0074]在一种实施方式中，可用于在体内增加细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第48至76位氨基酸的肽。在某些实施方式中，TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第48至76位氨基酸的肽，其包含一个或多个保守氨基酸置换，只要所述肽保留增加细胞复制的能力即可。
[0075]在一种实施方式中，可用于在体内增加细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分缺少完整的LPL结构域以及(XD1、IVS和(XD2。在一种实施方式中，可用于在体内增加β -细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含缺少完整的LPL结构域、(XD1、IVS和(XD2的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一种实施方式中，可用于在体内增加β _细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分缺少完整的预测的LPL结构域以及预测的CCD1、预测的IVS和预测的CCD2。
[0076]在一种实施方式中，可用于在体内增加细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第77至135位氨基酸的肽。在某些实施方式中，TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第77至135位氨基酸的肽，其包含一个或多个保守氨基酸置换，只要所述肽保留增加β -细胞复制的能力即可。
[0077]在一种实施方式中，可用于在体内增加细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含CCD1，但是缺少CCD2、IVS和LPL结构域。在一种实施方式中，可用于在体内增加β -细胞复制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含预测的CCD1，但是缺少预测的CCD2、预测的IVS和预测的LPL结构域。
[0078]本领域技术人员将会理解，上面针对SEQ ID NO:1所描述的TD26的功能性部分的描述仅仅是示例性的。例如，这样的描述同样适用于SEQ ID Ν02-4。
[0079]在某些实施方式中，SEQ ID NO:1的功能性多肽包含其中信号序列被能够指导多肽分泌的序列例如人生长激素信号肽代替的蛋白序列。在其他实施方式中，适用于本发明的多肽和蛋白包括SEQ ID NO:2, SEQ ID Ν0:3和SEQ ID NO:4的多肽及其功能性片段。其他适合的多肽和蛋白可以通过与人类TD26的氨基酸序列进行比较来鉴定，以鉴定与人类TD26具有显著的序列同一性或同源性的多肽和蛋白。同一性或同源性可以存在于整个蛋白或多肽上，或者可以仅仅或主要存在于蛋白或多肽的特定结构域(例如CCD结构域或其他功能性结构域)上。用于进行这样的序列比较的计算机化算法在本领域中是已知的，并且示例性的方法已被用在本文描述的工作中。例如，氨基酸序列(和核酸序列)同源性的计算机算法分析可以包括利用任意数量的可用的软件包，例如BLAST、DOMAIN、BEAUTY (BLAST增强的比对实用程序)、GENPEPT和TREMBL软件包。
[0080]有用的核酸分子及其编码的多肽是指相应基因的核酸的所有形式(例如基因、mRNA前体、mRNA)或蛋白，它们的多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物(适用于核酸或蛋白)，其:(I)氨基酸序列与本文描述的多肽优选地在至少约20、25、30、35、40、45、50、75个或更多个氨基酸的区域内，具有高于约80%的氨基酸序列同一性或高于约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%或更高的氨基酸序列同一性；(2)特异性结合于抗体例如多克隆抗体，所述抗体针对包含参比氨基酸序列的免疫原、其免疫原性片段及其保守修饰的变体而产生；(3)在严紧杂交条件下与编码参比氨基酸序列及其保守修饰的变体的核酸特异性杂交；(4)核酸序列与本文描述的参比核苷酸序列优选地在至少约20、25、30、35、40、45、50、75、100、200个或更多个核苷酸的区域内，具有高于约80%，优选地高于约85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列同一性。在某些实施方式中，参比核苷酸序列缺少编码信号序列的部分。
[0081]在某些情况下，TD26核酸(即编码TD26多肽或其功能性部分的核酸)或TD26蛋白序列包含变体序列。变体序列可以包括一种或多种天然存在的序列变体。天然存在的序列变体的非限制性实例包括下面表1中鉴定的一个或多个单核苷酸多态性或氨基酸变体。因此，本发明的TD26序列可以包含天然存在的(以及非天然存在的)变体，只要这样的变体不消除TD26序列的β-细胞增殖效应即可。在某些实施方式中，序列变体包含保守变体。在优选实施方式中，本发明的编码TD26蛋白的核酸包含与TD26核酸的同一性为至少80%的核苷酸序列。在某些情况下，所述核酸包含与SEQ ID NO: 14的同一性为至少80%的核苷酸序列。在某些情况下，所述核酸包含与SEQ ID NO: 15的同一性为至少80%的核苷酸序列。在某些情况下，所述核酸包含一个或多个天然存在的单核苷酸多态性。[0082]在某些实施方式中，本发明的TD26蛋白包含与TD26蛋白的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明的TD26蛋白包含与TD26蛋白的分泌部分(即不包含信号序列的部分)的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述蛋白包含与SEQ ID NO:1的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述蛋白包含与SEQ IDNO:2的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述蛋白包含与SEQ ID NO:3的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述蛋白包含与SEQ ID N0:4的同一性为至少80%的氨基酸序列。在某些情况下，所述蛋白序列包含一个或多个天然存在的氨基酸变体。
[0083]表1:TD26单核苷酸多态性
【权利要求】
1.一种用于增加需要的对象中的胰腺β-细胞增殖的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，由此增加胰腺β-细胞的增殖。
2.一种用于治疗或预防对象中与内源胰岛素水平降低相关的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增加胰腺β-细胞的增殖并提高内源胰岛素的水平。
3.一种用于治疗或预防对象中与内源胰岛素抗性相关的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增加胰腺β-细胞的增殖并提高内源胰岛素的水平。
4.一种用于增加对象中的胰腺细胞的增殖或者治疗或预防对象中的糖尿病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的药剂，由此提高所述对象中的内源胰岛素的水平，所述药剂是肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)或其功能性部分或者编码TD26或其功能性部分的核酸。
5.权利要求1、2或3任一项的方法，其中所述药剂提高所述对象中内源TD26的水平或活性。
6.权利要求1、2或3任一项的方法，其中所述药剂提高TD26的表达。
7.权利要求1、2或3任一项的方法，其中所述药剂增加TD26的分泌。
8.权利要求1、2、3或4任一项的方法，其中所述药剂是TD26蛋白或其功能性部分。
9.权利要求8的方法，其中所述功能性部分不包含TD26的完整氨基酸序列或天然信号肽序列。
10.权利要求8或9任一项的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的一个或多个功能性结构域或完整结构域的肽。
11.权利要求8、9或10任一项的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性LPL结构域或完整的LPL结构域的肽。
12.权利要求8、9、10或11任一项的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性CCD结构域或完整的CCD结构域的肽。
13.权利要求8、9、10、11或12任一项的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性IVS或完整的IVS的肽。
14.权利要求8或9任一项的方法，其中所述功能性部分包含选自下列的肽:SEQIDNO:1的第22至76位氨基酸的肽，SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽，和SEQ ID NO:1的第77至135位氨基酸的肽。
15.权利要求1、2、3或4任一项的方法，其中所述药剂是编码TD26蛋白或TD26的功能性部分的核酸。
16.权利要求15的方法，其中所述核酸编码TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分不包含TD26的完整氨基酸序列或天然信号肽。
17.权利要求15或16任一项的方法，其中所述核酸编码TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的一个或多个功能性结构域或完整结构域。
18.权利要求15、16或17任一项的方法，其中所述核酸编码TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的功能性LPL结构域或完整的LPL结构域。
19.权利要求15、16、17或18任一项的方法，其中所述核酸编码TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的功能性CCD结构域或完整的CCD结构域。
20.权利要求15、16、17、18或19任一项的方法，其中所述核酸编码TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的功能性IVS或完整的IVS。
21.权利要求15或16任一项的方法，其中所述功能性部分包含编码选自下列的肽的核酸:SEQ ID NO:1的第22至76位氨基酸的肽，SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽，和SEQ ID NO:1的第77至135位氨基酸的肽。
22.权利要求8或15任一项的方法,其中所述TD26蛋白缺少信号序列。
23.权利要求8、15或22任一项的方法，其中所述功能性部分包含TD26蛋白的卷曲螺旋结构域。
24.权利要求8、15、22或23任一项的方法，其中所述TD26蛋白包含SEQID NO: 1、SEQID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 的全部或一部分。
25.权利要求8或15任一项的方法，其中所述TD26蛋白包含一个或多个天然存在的氨基酸变体。
26.权利要求8或15任一项的方法，其中所述TD26蛋白包含与SEQID NO: 1、SEQ IDNO:1的第22-198位氨基酸、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的同一性为至少80%的氨基酸序列。
27.权利要求15的方法，其中所述核酸包含SEQID NO: 14或SEQID NO: 15的全部或一部分。
28.权利要求15的方法,其中所述核酸包含一个或多个单核苷酸多态性。
29.权利要求15的方法，其中所述核酸包含与SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 15的同一性为至少80%的核苷酸序列。
30.权利要求1、2或3任一项的方法，其中所述药剂是胰岛素受体拮抗剂。
31.权利要求1、2、3或30任一项的方法，其中所述药剂选自S661、S661的功能性部分、S961、S961的功能性部分、RB537和RB537的功能性部分。
32.权利要求31的方法，其中所述药剂以足以引起β_细胞增殖的剂量施用于所述对象，并且选自S961、S961的功能性部分、S661和S661的功能性部分。
33.权利要求1、2、3或30任一项的方法，其中所述药剂以足以引起β-细胞增殖的剂量施用于所述对象，并且选自SEQ ID NO: 16,SEQID NO: 16的功能性部分、SEQ ID NO: 17和SEQID NO: 17的功能性部分。
34.权利要求1、2、3或18任一项的方法，其中所述药剂是选自下列的肽:具有与SEQIDNO: 16的同一性为至少80%的氨基酸序列的肽，和具有与SEQ ID NO: 17的同一性为至少80%的氨基酸序列的肽。
35.权利要求2或3任一项的方法，其中所述疾病选自糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐受不良和肥胖症。
36.权利要求2或3任一项的方法，其中所述疾病是I型糖尿病或II型糖尿病。
37.权利要求4的方法，其中所述糖尿病是I型糖尿病或2型糖尿病。
38.权利要求1的方法，其中增加细胞的增殖引起所述对象中细胞团增加。
39.一种用于增加需要的对象中的胰腺β_细胞增殖的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的胰岛素受体拮抗剂。
40.胰岛素受体拮抗剂在增加需要的对象中的胰腺细胞的增殖中的应用。
41.胰岛素受体拮抗剂在制造用于增加需要的对象中的胰腺β_细胞增殖的药物中的应用。
42.权利要求39、40或41任一项的应用，用于治疗糖尿病。
43.一种鉴定能够增加胰腺β_细胞增殖的候选药剂的方法，所述方法包括评估所述候选药剂拮抗胰岛素受体的能力。
44.一种鉴定用于增加胰腺β_细胞增殖的候选治疗剂的方法，所述方法包括: 将适合的细胞与受试药剂相接触；以及 测定所述受试药剂对TD26的水平或活性的影响， 其中提高TD26水平或活性的受试药剂是用于增加胰腺β -细胞增殖的候选治疗剂。
45.一种鉴定用于治疗与内源胰岛素水平降低相关的疾病的候选治疗剂的方法，所述方法包括: 将适合的细胞与受试药剂相接触；以及 测定所述受试药剂对TD26的水平或活性的影响， 其中提高TD26水平或活性的受试药剂是用于治疗与内源胰岛素水平降低相关的疾病的候选治疗剂。
46.一种鉴定用于治疗或预防与内源胰岛素抗性相关的疾病的候选治疗剂的方法，所述方法包括: 将适合的细胞与受试药剂相接触；以及 测定所述受试药剂对TD26的水平或活性的影响， 其中提高TD26水平或活性的受试药剂是用于治疗或预防与内源胰岛素抗性相关的疾病的候选治疗剂。
47.权利要求44、45或46任一项的方法，其中测定所述受试药剂对TD26的水平或活性的影响通过测定所述受试药剂对TD26的基因表达水平的影响来评估。
48.一种提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，其用于增加需要的对象中的胰腺细胞的增殖。
49.一种提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，其用于治疗或预防对象中与内源胰岛素水平降低相关的疾病。
50.一种提高肝细胞癌相关蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的药剂，其用于治疗或预防对象中与内源胰岛素抗性相关的疾病。
51.一种药剂，其是TD26蛋白或其功能性部分或者编码TD26蛋白或TD26的功能性部分的核酸，所述药剂用于增加β -细胞增殖或者治疗或预防糖尿病，特别是I型糖尿病或2型糖尿病。
52.权利要求48、49、50或51任一项的药剂，其中所述药剂包含TD26蛋白或其功能性部分。
53.权利要求48、49、50或51任一项的药剂，其中所述药剂是编码TD26蛋白或其功能性部分的核酸。
54.权利要求52或53任一项的药剂，其中所述TD26蛋白缺少信号序列。
55.权利要求52、53或54任一项的药剂，其中所述功能性部分包含TD26蛋白的卷曲螺旋结构域。
56.权利要求52、53、54或55任一项的药剂，其中所述TD26蛋白包含SEQID NO: 1、SEQID NO:1 的第 22-198 位氨基酸、SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 的全部或一部分。
57.权利要求52或53任一项的药剂，其中所述TD26蛋白包含一个或多个天然存在的氨基酸变体。
58.权利要求52或53任一项的药剂，其中所述TD26蛋白包含与SEQID NO: 1、SEQ IDNO:1的第22-198位氨基酸、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的同一性为至少80%的氨基酸序列。
59.权利要求53的药剂，其中所述核酸包含SEQID NO: 14或SEQID NO: 15的全部或一部分。
60.权利要求53的药剂,其中所述核酸包含一个或多个单核苷酸多态性。
61.权利要 求53的药剂，其中所述核酸包含与SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 15的同一性为至少80%的核苷酸序列。
62.权利要求48、49或50任一项的药剂，其中所述药剂是胰岛素受体拮抗剂。
63.权利要求48、49、50或62任一项的药剂，其中所述药剂选自S661、S661的功能性部分、S961、S961的功能性部分、RB537和RB537的功能性部分。
64.权利要求63的药剂，其中所述药剂以引起β-细胞增殖的剂量施用于所述对象，并且选自S961、S961的功能性部分、S661和S661的功能性部分。
65.权利要求48、49、50、62或63任一项的药剂，其中所述药剂以引起β-细胞的增殖的剂量施用于所述对象，并且选自SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 16的功能性部分、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 17的功能性部分。
66.权利要求48、49、50、62或63任一项的药剂，其中所述药剂是选自下列的肽:具有与SEQ ID NO: 16的同一性为至少80%的氨基酸序列的肽，和具有与SEQ ID NO: 17的同一性为至少80%的氨基酸序列的肽。
67.TD26蛋白或其功能性部分或者编码TD26蛋白或其功能性部分的核酸在制造用于增加胰腺β_细胞的增殖、或用于治疗或预防与内源胰岛素水平降低相关的疾病、或用于治疗或预防对象中与内源胰岛素抗性相关的疾病、或用于治疗I型糖尿病或2型糖尿病的药物中的应用。
68.S961或其功能性部分在制造用于优选地通过提高TD26的水平或活性来增加胰腺β-细胞的增殖并且优选地不显著提高血糖水平或仅暂时提高血糖水平的药物中的应用。
69.S661或其功能性部分在制造用于优选地通过提高TD26的水平或活性来增加胰腺β-细胞的增殖并且优选地不显著提高血糖水平或仅暂时提高血糖水平的药物中的应用。
70.RB537或其功能性部分用于优选地通过提高TD26的水平或活性来增加胰腺β -细胞的增殖并且优选地不显著提高血糖水平或仅暂时提高血糖水平的应用。
71.—种诊断受试个体中的TD26相关疾病的方法，所述方法包括: 测定从所述受试个体获得的样品中的TD26水平，其中与正常个体中的TD26水平相比，所述受试个体中提高或降低的TD26水平指示TD26相关的疾病。
72.—种诊断个体中的TD26相关疾病的方法，所述方法包括:检测来自于所述个体的样品中的TD26水平，其中与所述个体中以前的TD26水平相比，提高或降低的TD26水平指示TD26相关的疾病。
73.权利要求71或72任一项的方法，其中所述TD26水平降低，并且其中所述TD26相关疾病的特征在于以下一种或多种:β -细胞增殖减少、内源胰岛素水平降低和对内源胰岛素的敏感性降低。
74.权利要求71至73任一项的方法，其中所述TD26水平降低，并且其中所述TD-26相关疾病是I型糖尿病或2型糖尿病。
75.一种组合物，其包含由S961的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分构成的药剂，所述功能性部分增加细胞的增殖。
76.一种组合物，其包含由S661的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分构成的药剂，所述功能性部分增加细胞的增殖。
77.一种组合物，其包含由RB537的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分构成的药剂，所述功能性部分增加细胞的增殖。
78.一种组合物，其包含由TD26的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分构成的药剂，所述功能性部分不包含缺少信号肽的TD26的完整氨基酸序列，并且增加β -细胞的增殖。
79.—种组合物，其包含TD26肽的功能性部分或编码所述功能性部分的核酸，其中所述功能性部分能够增加细胞的增殖。
80.权利要求79 的组合物，其中所述功能性部分不包括TD26的天然信号肽序列或完整的氨基酸序列或核苷酸序列，或者所述功能性部分不包括缺少信号肽的TD26的完整氨基酸序列或编码缺少信号肽的TD26的完整氨基酸序列的核酸。
81.权利要求79或80任一项的组合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的一个或多个功能性结构域或完整结构域的肽或者编码所述肽的核酸。
82.权利要求79、80或81任一项的组合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性LPL结构域或完整的LPL结构域的肽或者编码所述肽的核酸。
83.权利要求79、80、81或82任一项的组合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性CCD结构域或完整的CCD结构域的肽或者编码所述肽的核酸。
84.权利要求79、80、81、82或83任一项的组合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性IVS或完整的IVS的肽或者编码所述肽的核酸。
85.权利要求79的组合物，其中所述功能性部分包含选自下列的肽:SEQID NO:1的第22至76位氨基酸的肽、SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽、和SEQ ID NO:1的第77至135位氨基酸的肽，或者所述功能性部分包含编码任一种所述肽的核酸。
86.—种组合物，其包含TD26多肽的一个或多个功能性结构域，其中TD26多肽的一个或多个功能性结构域增加细胞的增殖。
87.—种组合物，其包含编码TD26多肽的一个或多个功能性结构域的一种或多种核酸，其中TD26的一个或多个功能性结构域增加β -细胞的增殖。
88.—种组合物，其包含增加细胞增殖的肽或编码任一种所述肽的核酸，所述肽选自SEQ ID NO:1的第22至76位氨基酸的肽、SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽、SEQID NO:1的第77至135位氨基酸的肽及其组合。
【文档编号】A61K48/00GK104039357SQ201280036842
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年6月10日 优先权日:2011年6月10日
【发明者】道格拉斯·A·梅尔顿, 伊鹏 申请人:哈佛学院校长同事会