用于治疗的靶向神经肌肉接头的制作方法
【专利摘要】公开了用于靶向治疗剂至神经肌肉接头的组合物和方法。还公开了用于治疗影响神经肌肉接头的疾病和病况的方法。组合物包括与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽。组合物还可包括接头肽。用于靶向治疗剂至神经肌肉接头和治疗影响神经肌肉接头的疾病和病况的方法包括施用包含与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽的组合物。
【专利说明】用于治疗的靶向神经肌肉接头
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月20日提交的临时专利申请号61/498，707的优先权，其通过引用以其整体并入到本文中。
[0003]关于研发或研究的联邦赞助的声明
[0004]本发明是在由国立健康研究院国立眼科研究所提供的基金编号EY14837的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权力。
[0005]糖合序列表
[0006]本文提供了纸质序列表和含有文件名“31065_30_ST25.txt”的计算机可读形式，后者的大小为32，205字节(在MS-DOS中测算)，其通过引用整合到本文中。该序列表由SEQ ID NO:1-35 组成。
_7] 发明背景
[0008]本公开内容一般涉及用于靶向治疗剂的组合物和方法。更特别的是，本公开内容涉及使用神经肌肉接头靶向肽，用于将治疗剂靶向神经肌肉接头的组合物和方法。
[0009]神经肌肉接头是神经向肌肉传递收缩信号的点。更特别的是，神经肌肉接头是突触或神经元的轴突末端与肌纤维细胞膜的连接处。
[0010]一些疾病涉及神经肌肉接头作为主要的损伤位点。例如，重症肌无力是由主要针对骨骼肌的神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体导致的自身免疫病症。抗体结合神经肌肉接头的突触后表面，产生AchR数减少和损坏肌肉终板，导致了产生肌肉虚弱的神经肌肉传递失效。另一类肌无力是由针对神经肌肉接头处的肌肉特异性激酶(MuSK)的抗体导致的。Lambert-Eaton综合征则是另一种病症,其特征是抗体对神经肌肉接头的电压门控型钙通道的攻击。Miller Fischer综合征是另一类涉及抗体攻击神经末梢的病症。
[0011]补体系统可能是抗体介导免疫力的一个效应子机制的基础，所述免疫力始于与细胞表面抗原结合的抗体以及膜攻击复合物的形成。膜攻击复合物是产生细胞裂解的多聚蛋白质复合物，在重症肌无力的情况下，破坏神经肌肉接头。在抗体引发的补体级联系统的活化作用中，新生的C4b和C3b片段与生物膜上的游离羟基和氨基凝聚。一旦结合，这些片段就作为用于级联的关键扩增酶一C4b2a和C3bBb装配的位点。为了保护宿主组织免受自体补体介导的损伤，通过与细胞相关的和血清调控型蛋白的系统来控制其活性。
[0012]补体抑制剂是一类表现出治疗神经肌肉疾病的前景的药物。补体抑制剂可以终止机体的免疫应答系统对自身的攻击。例如，依库珠单抗(Eculizumab)是获得批准用于阵发性夜间血红蛋白尿中和处于重症肌无力治疗的2期临床试验中的抗C5抗体。依库珠单抗通过抑制补体发挥功能。由于通过输注施用，该物质可抑制全身的补体。
[0013]另一种补体抑制剂是rEV576(0mCI或Conversin)。rEV576是源自蜱(Ornithodoros moubata)的唾液的18.5kDa的重组生产的蛋白质,其特异性抑制C5补体。rEV576似乎直接结合C5，阻止与C5转变酶的相互作用。施用rEV576表现出降低血清的补体活性，减少C9在神经肌肉接头处的沉积，和降低来自治疗动物的血清的细胞毒性。
[0014]重症肌无力的治疗一般关注于通过使用活性剂(如吡啶斯的明)抑制胆碱酯酶，来增强神经肌肉传导。其他治疗则是针对阻遏或调控免疫系统的，如皮质类固醇、硫唑嘌呤、他克莫司和麦考酚酯。可以用血浆去除法或静脉内的免疫球蛋白治疗虚弱的急性恶化。虽然有效，但是这些治疗是昂贵的，并可能产生影响除神经肌肉接头以外的器官系统的副作用。这些治疗还可导致系统性的副作用，因为其施用发生在全身。免疫疗法不是特异性针对重症肌无力的，而一般是通过阻遏B细胞和T细胞活性直接或间接的降低自身抗体的水平，来调控免疫应答。
[0015]虽然对神经肌肉接头损伤导致的病况的治疗是可获得的，但其效果、副作用和/或成本方面仍然存在顾虑。此外，补体抑制剂对策依赖于对补体的系统性抑制。因此，仍然对于研发用于治疗由神经肌肉接头损伤导致的病况的备选治疗和方法有持续的需要。
[0016]发明概沭
[0017]本公开内容一般涉及用于靶向治疗剂的组合物和方法。更特别的是，本公开内容涉及使用神经肌肉接头靶向肽，将治疗剂靶向至神经肌肉接头的组合物和方法。
[0018]在一个方面，本公开内容涉及包含与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽的组合物。
[0019]在另一个方面，本公开内容涉及递送治疗剂至神经肌肉接头的方法。方法包括施用包含与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽的组合物。
[0020]在另一个方面，本公开内容涉及用于治疗神经肌肉接头相关性疾病或病况的方法。方法包括向有需要的对象施用包含与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽的组合物。
[0021]在另一个方面，本公开内容涉及重组的核酸构建体，其编码与编码治疗性多肽的异源核酸序列有效连接的神经肌肉接头靶向肽。
附图简介`
[0022]当参考下列详细说明时，将更好的理解本公开内容，且除上述特征、方面和优点以外的其他特征、方面和优点也将是显而易见的。这类详细的描述参考了下列附图，其中:
[0023]图1是显示实施例1所述的层粘连蛋白-rEV多肽的结构域结构的示意图。
[0024]图2是pET28a表达载体的图。
[0025]图3是显示实施例1所述的层粘连蛋白-rEV多肽在BL21中表达的SDS-凝胶。
[0026]图4是纯化的rEV、自诱导细胞表达的rEV、自诱导细胞表达的层粘连蛋白-rEV(LrEV)和未诱导细胞的Western印迹。
[0027]图5是显示实施例2所述的HIV-rEV多肽的结构域结构的示意图。
[0028]图6是显示实施例3所述的RVG-rEV多肽的结构域结构的示意图。
[0029]图7是显示实施例4所述的pET16b-scFv-DAF表达载体构建的示意图。
[0030]图8是实施例4所述的用IgGsp-VH-VL转染的BHK-21细胞中的GFP表达的显微照片。
[0031 ] 图9是显示实施例4所述的scFv-DAF的表达和纯化的SDS-凝胶。
[0032]图10是显示实施例5所述的scFv-DAF和scFvl956与hAChR α 1-210多肽特异性结合的图。
[0033]图11是显示实施例6所述的用scFv-DAF孵育的绵羊红细胞的补体介导的溶血作用的图。[0034]图12是显示实施例7所述的在小鼠的隔膜中的scFv-35-DAF对神经肌肉接头的定位的显微照片。
[0035]图13显示了免疫荧光显微照片，显示实施例8所述的scFv-DAF降低了 TE671细胞上的C3沉积。
[0036]图14是显示根据本发明的各种神经肌肉接头的靶向构建体的结构域结构的示意图。
[0037]图15是描述了实施例9所述的scFv和scFv-DAF在EAMG小鼠中的治疗效应的图。
[0038]图16是描述了实施例9所述的scFv和scFv_DAF在EAMG Lewis大鼠中的治疗效应的图。
[0039]虽然本公开内容易于存在各种修饰和变化形态，但通过附图中的实例显示了其特定的实施方案，并详细描述在下文中。然而，应该理解，特定实施方案的描述并非意在将本公开内容限制在覆盖由所附权利要求定义的落入本公开内容中的精神和范围内的所有修饰、等价物和替代方案。
[0040]发明详沭
[0041]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然任何与本文所述的方法和材料类似或等价的方法和材料都可用于实践或测试本公开内容，但优选的方法和材料描述如下。
[0042]根据本公开内容 ，已发现了允许用于靶向神经肌肉接头的组合物和方法。组合物和方法具有显著的影响，因为其允许将治疗剂靶向递送至神经肌肉接头。组合物和方法还允许治疗神经肌肉接头相关性疾病和病况，例如重症肌无力、实验获得的重症肌无力(experimentally acquired myasthenia gravis)、Lambert-Eaton 综合征和 MillerFischer综合征,其中神经肌肉接头是受影响的。
[0043]鉬合物
[0044]在一个方面，本公开内容涉及包含与治疗剂(“TA”)偶联的神经肌肉接头靶向肽(“NMJTP”)的组合物(参见例如图14)。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换的使用，指任何长度的氨基酸残基的聚合物，除非另外指出。
[0045]如本文中使用的，“与......偶联”指组合物中，神经肌肉接头靶向肽与治疗剂直
接或间接的连接(attach)、融合(fuse)、联结(ioin)和/或相连(link)。例如，如果使用已知的重组蛋白质表达方法制备组合物，则可以将编码神经肌肉接头靶向肽的核酸序列与编码治疗剂的核酸序列联结。在这样的例子中，神经肌肉接头靶向肽将与治疗剂直接偶联。在另一个例子中，通过在神经肌肉接头靶向肽和治疗剂之间包括至少一个接头，编码神经肌肉接头靶向肽的核酸序列可与编码治疗剂的核酸序列间接联结。
[0046]本公开内容的组合物可作为较大构建体的一部分被制备，所述构建体经过进一步加工产生具有与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽的最终组合物。图14中示例了较大构建体的结构域结构。在一个实施方案中，例如，构建体可包含ATG起始位点，与亲和力标签偶联，后者与蛋白酶切割位点(蛋白酶位点)偶联，所述蛋白酶切割位点偶联神经肌肉接头靶向肽(“NMJTP”)，后者与接头偶联，所述接头与治疗剂(“TA”)偶联(参见图14)。在另一个实施方案中，结构域结构可包括ATG起始位点，其与亲和力标签偶联，后者与蛋白酶切割位点偶联，所述位点与NMJTP偶联、所述NMJTP与接头偶联、所述接头与NMJTP偶联、所述NMJTP与接头偶联，所述接头与TA偶联(参见图14)。表1概括了图14所示的神经肌肉接头靶向肽及其特异性(结合靶)。
[0047]表1.神经肌肉接头靶向肽
[0048]
【权利要求】
1.组合物，其含有与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽。
2.权利要求1的组合物，其中神经肌肉接头靶向肽包含层粘连蛋白肽、人免疫缺陷病毒的核壳锌指结构域、狂犬病病毒糖蛋白肽、α -银环蛇毒素肽、聚集蛋白肽、特异性结合乙酰胆碱酯酶的单链抗体肽和特异性结合乙酰胆碱受体的单链抗体肽。
3.权利要求1的组合物，其中神经肌肉接头靶向肽包含选自SEQID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO ID NO:9 的氨基酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中治疗剂选自补体抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、营养剂和麻痹剂。
5.权利要求1的组合物，其中补体抑制剂是衰变加速因子、rEV、rEV576、膜辅助因子蛋白、compstatin、compstatin衍生物、P0T_4、C1抑制剂、C4b结合蛋白、因子H、补体受体Ig、CD59、簇蛋白、C3-抑制剂、肽 2J、人 β -防卫素 2、CRIT-H17、Ac-SHLGLAR-H、Ac-RLLLAR-H、Cls-1NH-248、S-蛋白、Crry、circumin、W-54011、NDT9520492、N⑶2000-1、CP-447, 697、NDT9513727、SB290157、SB290157(A)、SB290157(B)、BCX1470、PMX53、PMX205、C089 和JPE1375。
6.权利要求1的组合物，其还包含接头。
7.权利要求6的组合物，其中接头选自谷氨酰胺-丝氨酸接头、SEQID NO:19,SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO ID NO:33。
8.向神经肌肉接头递送治疗剂的方法，所述方法包括: 施用含有与治疗剂偶联的神经肌肉接`头靶向肽的组合物。
9.权利要求8的方法，其中神经肌肉接头靶向肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO IDNO:9。
10.权利要求8的方法，其中治疗剂选自补体抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、营养剂和麻痹剂。
11.权利要求8的方法，其中组合物还包含接头。
12.权利要求11的方法，其中接头选自谷氨酰胺-丝氨酸接头、SEQID NO: 19,SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO ID NO:33。
13.用于在有需要的对象中治疗神经肌肉接头相关性疾病或病况的方法，所述方法包括: 向对象施用治疗有效量的含有与治疗剂偶联的神经肌肉接头靶向肽的组合物。
14.权利要求13的方法，其中神经肌肉接头相关性疾病或病况选自重症肌无力、实验获得的重症肌无力、Lambert-Eaton综合征、MiIler Fischer综合征、先天性肌无力综合征、肉毒中毒和有机磷中毒。
15.权利要求13的方法，其中神经肌肉接头靶向肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NOID NO:9。
16.权利要求13的方法，其中治疗剂选自补体抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、营养剂和麻痹剂。
17.权利要求16的方法，其中补体抑制剂选自DAF、rEV、rEV576、膜辅助因子蛋白、compstatin、compstatin衍生物、P0T-4、Cl抑制剂、C4b结合蛋白、因子H、补体受体Ig、CD59、簇蛋白、C3-抑制剂、肽 2J、人 β -防卫素 2、CRIT-H17、Ac-SHLGLAR-H、Ac-RLLLAR-H、Cls-1NH-248、S-蛋白、Crry、circumin、W-54011、NDT9520492、N⑶2000-1、CP-447, 697、NDT9513727、SB290157、SB290157(A)、SB290157(B)、BCX1470、PMX53、PMX205、C089 和JPE1375。
18.权利要求13的方法，其中施用步骤通过输注、注射、口服、经鼻、局部和皮下。
19.权利要求13的方法，其中治疗有效量具有从约0.001 μ g/ml至约40 μ g/ml的半最大抑制浓度。
20.权利O求13的方法，其中组合物`具有从约0.5nM至约50 μ M的结合亲和力。
【文档编号】A61K31/00GK103826659SQ201280040244
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年6月19日 优先权日:2011年6月20日
【发明者】H·凯明斯基, L·库斯纳, N·沙提亚 申请人:圣路易斯大学