从藻类中生产4-氨基丁酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种生产4-氨基丁酸-也称作γ-氨基丁酸-简称GABA的方法，涉及一种生产包含4-氨基丁酸的提取物的方法，涉及包含4-氨基丁酸的化妆品配制品的制备方法，及涉及Cyanidium?caldarium细胞或细胞成分在化妆品中的应用。
【专利说明】从藻类中生产4-氨基丁酸的方法
发明领域
[0001]本发明涉及一种生产4-氨基丁酸-也称作Y -氨基丁酸-简称GABA的方法，涉及一种生产包含4-氨基丁酸的提取物的方法，涉及包含4-氨基丁酸的化妆品配制品的制备方法，及涉及Cyanidium caldarium细胞或细胞成分在化妆品中的应用。
现有技术
[0002]GABA对皮肤的积极作用首先由Ito等在Biochim BiophysActa.2007Feb; 1770 (2): 291-6中描述，其证实GAD67在人皮肤成纤维细胞中表达，而此前GAD67仅被描述为定位于神经兀并且催化GABA合成。
[0003]已经证实GABA能上调成纤维细胞中的透明质酸合成，并且GAD67对胶原蛋白合成具有积极作用。
[0004]包含GABA(INC1:氨基丁酸)的化妆品见于装饰性化妆品、除臭剂、湿巾、皮肤护理和淋浴用品。在此，GABA被描述为是皮肤中恒定的物质，具有松弛肌肉活性、提亮皮肤活性、保湿活性，并且是对胶原蛋白和Matrikin合成具有刺激活性的物质。应用领域是例如抗衰老、抗皱、紧致和平滑唇线、减少表情纹，减少细纹和鱼尾纹的应用。使用的GABA的来源是植物的微生物发酵。在此，例如将水稻胚芽在37°C发酵几年。
[0005]迄今为止，已经描述的GABA的合成几乎毫无例外地仅在高等生物体中发生。
[0006]在藻类中，迄今为止仅仅是由Morse and Morse在Hydrobiologia, 116-117(1): 155-158 描述了在例如 Porphyra 中的 GABA 模拟物。
[0007]本发明的一个目的是提供一种包含GABA的化妆品配制品，其中所述GABA的来源基于可易于培养的快速生长的微生物。
[0008]发明描述
[0009]令人惊奇地，已经发现藻类Cyanidium caldarium包含大量GABA,其可出色地用于产生GABA以及用于生产化妆品。
[0010]特别惊奇的是因为先前被认为不可能发现能合成GABA的藻类。
[0011]本发明的目的因此是使用Cyanidium caldarium细胞生产GABA及生产含有GABA的化妆品的方法。
[0012]本发明另一目的是通过所述方法可获得的化妆品,及Cyanidium caldarium细胞或细胞成分在化妆品配制品中的应用。
[0013]本发明的一个优势是由于使用可再生原材料的可持续性。
[0014]另一优势是由于Cyanidium caldarium细胞可易于加工的事实而便于提供GABA。
[0015]本发明的再一优势是Cyanidium caldarium细胞不包含干扰化妆品的任何二级成分。
[0016]本发明的另一优势是Cyanidium caldarium细胞包含对化妆品有利的进一步的二级成分，例如营养素、矿物质、非必需氨基酸和必需氨基酸、鸟氨酸和多酚。
[0017] 本发明的再一优势是本发明的化妆品能上调细胞外基质的标记基因。[0018]特别是，弹性纤维的最重要结构成分原纤维蛋白和弹性蛋白，以均一的方式被有利地上调。
[0019]再一优势是本发明的化妆品具有抗氧化活性及对皮肤有营养作用。
[0020]另一优势是本发明的化妆品证实对各种皮肤类型、特别是对衰老皮肤有效，并且具有抗炎和舒缓皮肤的活性。
[0021]本发明的目的因此是生产4-氨基丁酸的方法，包括如下步骤:
[0022]A)在水性培养基中培养Cyanidium caldarium细胞，
[0023]B)如果需要，破坏 Cyanidium caldarium 细胞，
[0024]C)除去固体细胞成分以获得提取物，及如果需要，
[0025]D)进一步纯化4-氨基丁酸。
[0026]在本发明中，用语“Cyanidium caldarium”应理解为是指在Cyanidiaceae科中分类为 Cyanidium caldarium (Ti lden) Geitler 的藻类。
[0027]用语“水性 ”应理解为是指水含量基于总组合物重量为至少50%，在本发明中“水性”特别用于描述培养基。
[0028]用语“破坏细胞”应理解为是指破坏细胞膜，特别是外部细胞膜。
[0029]用语“提取物”应理解为是指各种成分的液体混合组合物，其可以是分离自Cyanidium caldarium细胞的这些混合组合物。
[0030]用语“细胞成分”应理解为是指各种成分的混合组合物，其可分离自Cyanidiumcaldarium 细胞。
[0031]除非特别指出，则所有标示的百分比(%)均是重量百分比。
[0032]本发明优选的Cyanidium caldarium细胞是株系SAG16.91的细胞。
[0033]根据本发明,优选Cyanidium caldarium细胞在步骤A)中在升高的温度下培养，因此优选的温度范围是20°C _60°C，特别是35°C _45°C。优选在升高温度下培养是在7-192天期间进行，特别是28-56天。这样使得可以提供这样的提取物或化妆品，其除了 GABA之外还包含多胺，如精胺、亚精胺和去甲精胺。
[0034]步骤A)中的水性培养基优选在25°C的pH为1.5_6，优选2_3。
[0035]在步骤B)中，破坏细胞可以通过超声处理藻类培养物的悬浮液，通过应用渗透压休克，通过高压均质化(例如French press,Manton-Gaulin均质器)，通过热水提取,通过应用高剪切力(例如Ultra-Turrax, Potter-Elvehjem方法)，通过在搅拌式球磨机中湿磨，通过减压(letting down)，借助于酶例如多糖酶如葡聚糖酶、半纤维素酶、纤维素酶或者商购的酶如SP-311 (novo)，或者通过这些上述方法的任意希望的组合方式进行。
[0036]在步骤B)中，细胞优选在水性培养基中被破坏，以更好地获得水性提取物。特别优选步骤B)的水性培养基相应于步骤A)中的培养基，特别是采取相同培养基形式。
[0037]在步骤B)中特别优选通过热水组合酶促细胞破坏进行细胞破坏。
[0038]在步骤C)中除去固体细胞成分可以例如通过离心、沉降或者过滤进行。
[0039]GABA 的进一步纯化可例如 Carmona et al., Acta Pharmacol Toxicol(Copenh).1980Mar; 46 (3): 235-40 所述进行。
[0040]本发明另一目的是提供生产包含4-氨基丁酸的提取物的方法，包括如下步骤:
[0041]A)在水性培养基中培养Cyanidium caldarium细胞，[0042]B)如果需要，破坏 Cyanidium caldarium 细胞，
[0043]C)除去固体细胞成分以获得提取物，
[0044]步骤A)_C)相应于本发明第一个提及的方法及相应优选的实施方案也类似地是优选的。
[0045]优选地，本发明的生产提取物的方法由步骤A)、B)和C)组成。
[0046]因此，通过上述方法可获得的提取物也是本发明的一部分。
[0047]所述提取物优选是水性提取物。
[0048]根据本发明优选的提取物特征在于其包含另外的成分-多胺，如精胺、亚精胺和去甲精胺。[0049]由于所述提取物可有利地用于制备化妆品配制品，因此优选提供具有防腐剂的提取物。在这方面，优选的防腐剂选自安息香酸盐和山梨酸盐。
[0050]本发明优选的一种提取物特征在于其包含0.01%-10%重量、优选0.5%-5%及特别优选1%_3%重量的Cyanidium caldarium细胞成分干物质,其中重量百分比是基于总提取
物重量。
[0051]本发明优选的一种提取物特征在于其包含0.01%-7%重量、优选0.25%-3%重量及特别优选0.5%-1.5%重量的防腐剂，其中重量百分比是基于总提取物重量。
[0052]本发明另一目的是提供一种制备包含4-氨基丁酸的化妆品配制品的方法，包括如下步骤:
[0053]A)在水性培养基中培养Cyanidium caldarium细胞，
[0054]B)如果需要，破坏 Cyanidium caldarium 细胞，
[0055]C)除去固体细胞成分以获得提取物，及
[0056]E)将来自步骤B)的破坏的Cyanidium caldarium细胞和/或来自步骤C)的提取物掺入化妆品配制品中，
[0057]步骤A)_C)相应于本发明第一个提及的方法，且相应优选的实施方案也类似地是优选的。优选地，本发明的制备化妆品配制品的方法由步骤A)、B)、C)和E)组成。
[0058]优选地，仅将步骤C)的提取物掺入步骤E)中。
[0059]本发明的再一目的是提供包含可通过本发明方法获得的GABA的化妆品配制品，包含GABA及Cyanidium caldarium细胞和/或细胞成分的化妆品配制品，以及包含本发明的提取物的化妆品配制品。
[0060]本发明的配制品可可以是任何化妆品配制品形式，特别是皮肤配制品、指甲配制品和毛发配制品，特别优选皮肤配制品。
[0061]Cyanidium caldarium细胞和/或细胞成分的特征性质如在皮肤和/或毛发之上和之内形成残余物的适度倾向具有对皮肤和/或毛发的结构的促进作用，因此增强，特别是增强毛发的稳定性、抗性、色度和强度，特别是抗张强度。
[0062]本发明的毛发配制品不限于免洗(leave-on)应用(护发素，毛发护理)。本发明的毛发配制品也有利地是漂洗产品形式(例如香波，皮肤清洁产品)。
[0063]适用于皮肤及根据本发明优选的配制品特别包含:须后乳液，男人护肤品，防晒霜，晒后修复产品，护唇产品，抗皱护理产品，增强皮肤屏障的产品，抗衰老产品，颈部去皱产品，抗皮下脂肪团产品，塑形产品，保湿产品，防止有害环境影响的产品，皮肤舒缓产品和降低皮肤刺激产品。
[0064]本发明的配制品可以如乳液、悬浮液、溶液、乳霜、软膏、膏剂、凝胶、油剂、粉末、喷雾剂、条状物(stick)、喷雾或泡沫形式应用。
[0065]本发明的化妆品配制品可包含例如选自如下一组的至少一种其它成分:
[0066]润肤剂，
[0067]乳化剂，
[0068]增稠剂/粘性调节剂/稳定剂，
[0069]抗氧化剂，
[0070]增溶剂(或者多元醇)，
[0071]固体和充填剂，
[0072]珠光光泽彩料添加剂，
[0073]除臭剂和止汗活性物质
[0074]驱虫剂，
[0075]自晒黑剂(self-tanningagents),
[0076]防腐剂，
[0077]柔顺剂，
[0078]香料，
[0079]着色剂，
[0080]化妆活性物质，
[0081]护理添加剂，
[0082]超脂剂(superfattingagents),
[0083]溶剂，
[0084]UV 防护剂(filter)。
[0085]可被采用为各种代表性物质为本领域技术人员已知，可见例如德国专利申请DE102008001788.4中所述。这个专利申请并入本文并因此组成本发明的一部分。
[0086] 关于应用这些成分中的进一步的任意成分和量，可以参考本领域技术人员已知的专业手册，例如 K.Schrader, 〃Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika〃，2ndEdition,page329to341, Hiithig Buch Verlag Heidelberg。
[0087]各添加剂的量根据具体应用确定。
[0088]针对各种应用的典型构架配方本领域已知，可例如见于各个赋形剂和活性物质的厂商的指导手册。因此，可以使用这些现有的配制品而不用修改。然而，如果需要，可以无问题的方式进行希望的修改，通过简便的实验以调整及优化配制品。
[0089]根据本发明优选的化妆品配制品特征在于其包含另外的成分-多胺，例如精胺、亚精胺和去甲精胺和/或防腐剂。在这方面，优选的防腐剂选自安息香酸盐和山梨酸盐。
[0090]根据本发明的一个优选化妆品配制品特征在于其包含0.00125-1.5%重量、优选0.0025-0.625% 重量及特别优选 0.0125-0.0625% 重量的 Cyanidium caldarium细胞和 / 或细胞成分干物质，其中重量百分比是针对总配制品重量的百分比。
[0091]本发明的化妆品配制品具有高抗炎活性，因此本发明的另一目的是抗炎症的化妆品配制品，特别是对抗皮肤炎症如痤疮。[0092]本发明的再一目的是Cyanidium caldarium细胞或细胞成分及根据本发明的提取物在化妆品配制品中的应用。
[0093]本发明的化妆品配制品证实了对于非常广泛的皮肤类型、特别是衰老皮肤(年龄相关的衰老皮肤，光老化皮肤，松垂的皮肤，松弛的皮肤)的效力。
[0094]本发明的化妆品配制品通常导致改良的皮肤结构，从而本发明的化妆品配制品可有效作为通用的抗衰老活性物质。特别地，本发明的化妆品配制品可用于塑形治疗，例如对下颌、胸部、臀部和腹部塑形。
[0095]本发明的化妆品配制品的另一积极作用包括降低皮肤粗糙性，减少皮肤鳞屑，减轻皱纹深度，及增加皮肤弹性、皮肤紧实性和皮肤厚度。
[0096]本发明的化妆品配制品在皮肤上的局部应用导致受刺激的、发痒的、发红和发炎的皮肤迹象减轻。这样使得本发明的化妆品配制品特别适于镇静发痒的皮肤、敏感性皮肤的化妆品。本发明的化妆品配制品的抗炎和舒缓皮肤的活性也有利地用于舒缓皮肤的须后乳液。
[0097]本发明的化妆品配制品具有保护活性，免于有害的内部和外部因素(环境的不利影响)的侵犯，从而可以防止对细胞大分子及表皮脂质屏障的破坏。
[0098]本发明化妆品配制品的舒缓皮肤的活性也可以在发红的皮肤上观测到，发红的皮肤示出由于日光照射引起的晒伤或红斑症状。在这方面，本发明的化妆品配制品也可以用作防晒及晒后修复的活性物质。
[0099]此外，本发明的化妆品配制品适于皮肤的护理和防护，特别是其表皮屏障功能由于某些皮肤疾病的结果而被降低及因此的经皮水丢失增加和/或其皮肤水合作用降低的皮肤。这种皮肤疾病包括干燥症、特应性皮炎、接触性皮炎、银屑病、鱼鳞癣、棘皮症、头屑、光照性皮炎、红斑，及角化损害和/或缺失。本发明的化妆品配制品也适用于皮肤以减轻某些作用，如干燥、发痒和脱屑皮肤，例如由于自身免疫疾病引起(例如银屑病)。
[0100]在下文提及的实施例中，本发明通过实施例形式描述；然而，所述实施例不限制本发明范围于实施例中提及的实施方案，其范围从所有描述和权利要求书中可见。
[0101]下图是实施例的一部分。
[0102]图1:在应用 IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干重的浓度)或者纯培养基(运载体)之后24小时，相对于GAPDH基因表达的COLlAl基因在人皮肤成纤维细胞中的表达。
[0103]图2:在应用纯培养基(运载体)、TGF-β (10ng/ml,阳性对照)或者IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的浓度)之后24小时，相对于GAPDH基因表达的各个基因在人皮肤成纤维细胞中的表达。
[0104]图3:在应用纯培养基(运载体)、IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干重的浓度)或者TGF-β (10ng/ml,阳性对照)之后24小时，相对于总细胞蛋白质含量的弹性蛋白在人皮肤成纤维细胞中的含量。
[0105]图4:在应用纯培养基(运载体)、IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干重的浓度)或者TGF-β (10ng/ml,阳性对照)之后24小时，相对于总细胞蛋白质含量的基膜聚糖(Lumican)蛋白在人皮肤成纤维细胞中的含量。[0106]图5:在应用纯培养基(运载体)或者 IOOppm(=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的浓度)之后24小时，相对于总细胞蛋白质含量的前胶原蛋白在人皮肤成纤维细胞中的含量。
[0107]图6:在UVA照射及在应用 750ρρηι(=750μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的浓度)或者水(运载体)之后24小时，相对于GAPDH基因表达的ILl-α在SkinEthic皮肤模型中的基因表达。
[0108]图7:在 UVA 照射及在应用 750ppm (=750 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的浓度)或者水(运载体)之后24小时，相对于GAPDH基因表达的TNF- α在SkinEthic皮肤模型中的基因表达。
[0109]图8:在UVA照射及在应用 750ρρηι(=750μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的浓度)或者水(运载体)之后24小时，相对于GAPDH基因表达的NF- κ B在SkinEthic皮肤模型中的基因表达。[0110]图9:在UVA照射及在应用 750ρρηι(=750μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的浓度)或者水(运载体)之后24小时，相对于总细胞蛋白质含量的白细胞介素l-α蛋白在SkinEthic皮肤模型中的含量。
[0111]图10:Cyanidium caldarium提取物对于表皮祖细胞的集落形成的作用。在应用IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的浓度)或者纯培养基(运载体)之后的CFE。
[0112]图11:在应用 IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干
重的浓度)或者纯培养基(运载体)之后，相对于B2M基因表达的各个基因在表皮祖细胞中的基因表达。
[0113]图12:在用免洗(leave-on)护发素处理毛发之前和之后参数E模块的平均值。
[0114]图13:皮肤弹性参数R1。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物处理之后8周基于运载体配制品的相对改变。
[0115]图14:皮肤弹性参数R4。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物处理之后8周基于运载体配制品的相对改变。
[0116]图15:皮肤结构参数。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物处理之后8周基于运载体配制品的相对改变。
[0117]图16:皮肤表面和体积参数。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物处理之后8周基于运载体配制品的相对改变。
实施例
[0118]实施例1:培养 Cyanidium caldarium
[0119]如DE4411486、DE29607285、TO9105849、W02010/149154 或者 DE102009028474A1 (W02011/018082A2)详细描述，在密闭的光生物反应器中进行制备性Cyanidium caldarium生物量生产以获得提取物。调整培养方法以适合红藻Cyanidium caldarium(SAG16.91)的特定生长条件。通过选择合适的泵结构使剪切力最小化，在培养期间通过可变的光照设计方案调试持续光照，从50至2000 μ ΕΦπι?并将pH调节为〈3，使得实现较高的生长速度及较高的可再生生物量质量。
[0120]使用的培养基由如下成分组成(/L蒸馏水):[0121]4.5g (NH4)2SO4,0.6g MgS04x7H20,0.6g KH2PO4,0.03g CaCl2x2H20, 0.01g FeSO4,0.018g 乙二胺四乙酸二钠二水合物，0.005g H3BO3,0.004MnCl2，0.00068g ZnS04x7H20,0.00052g Na2Mo04x2H20，0.00008g CuS04x5H20,0.00008g NaV03x4H20,0.00064g CoC12x6H20。培养基的pH通过加入IN H2SO4和/或通过调整CO2浓度而保持在pH2-3。
[0122]对于预培养，在5L Erlenmeyer培养瓶中充填IL培养基，并用Cyanidiumcaldarium(SAG16.91)原种培养物接种。将该培养物在30°C在荧光管下以140 μ E*m_2s_1轻轻摇动保温。通过在550nm吸光度监测该藻类培养物的生长状况。一旦生长达到指数生长期(0D1.0)，通过在5000rpm离心10分钟收获细胞，用蒸馏水洗涤细胞沉淀。将净生物量贮存在_20°C直至进一步使用。
[0123]实施例2:Cyanidium caldarium 的水性提取
[0124]如在DE10136645(EP 1277831)或W09105849中所述从光生物反应器中进行收获。
[0125]使用超声破坏微藻类细胞的方法已经描述并可再现，参见例如US2009069213的实施例3及US2008299147的实施例3所述。不溶的成分通过用200 μ m袋式过滤器过滤而分离。在水性提取物中加入1.0%的Rokonsal BS以防腐。通过Sartorius MA30湿度分析仪确定的水性Cyanidium caldarium提取物的干物质重(105°C )为2.5%。
[0126]实施例3:检测 Cyanidium caldarium 中 GABA
[0127]通过高效液相层析(HPLC)及随后的邻苯二甲醛(OPA)衍生化检测GABA。所述 HPLC 仪器由 Jasco PU2080Plus 泵、JascoAS2055Plus 自动取样器、JascoFP-2020Plus 突光检测仪和 Jasco ChromPassl.8.6.1integrator(Jasco GermanyGmbH, Gross-Umstadt, Germany)组成。使用的固定相是 Zorbax Eclipse XDB-C18,4.6 X 150mm, 3.5 μ m 柱(Agilent Technologies, Inc.),温度为 40。。。如下梯度用作流动相(A:2%乙腈，2%四氢呋喃，96%50mM磷酸，用NaOH将pH调节为pH7.5) ；B:65%乙腈，35%水):0-2分钟20%B恒定，2-8分钟20-40%B线性，8_11分钟40_100%B线性，11-38分钟100%B恒定。流速为1.5ml/分钟。注射5 μ L的分析物及15 μ L的OPA试剂(ImL邻苯二醛试剂，Solution Complete, Sigma-Aldrich P0532 及 0.5 μ L 疏基乙醇)。吸收波长为 340nm,发射波长为455nm。使用的内部标准是1，6-二氨基己烷。分析物是通过用水将Iml的水性Cyanidium caldarium提取物稀释为100mL而制备。
[0128]Cyanidium caldarium提取物中GABA的典型值为0.090%。这个值相应于基于Cyanidium caldarium 干物质的 3.3% 的 GABA。
[0129]实施例4:通过基因芯片研究Cyanidium caldarium提取物在人皮肤成纤维细胞上的基因表达分析
[0130]方法:
[0131]在本实施例中,研究了 Cyanidium caldarium提取物对成纤维细胞(正常人皮肤成纤维细胞，NHDF)中基因表达的作用。
[0132]为此，将原代人皮肤成纤维细胞(衍生自新生儿皮肤的人皮肤成纤维细胞(HDF)，
低温保存， Lifeline Cell Technology,得自 CeIISystems^ Biotechnologie Vertrieb
GmbH, St.Katharinenj Germany)首先在最低必需培养基(MEM)中在37i5C和条件下生长，所述培养基中补加了 Earle’s 盐(EMEM) (PAA Laboratories GmbH, Paschingj Austria)并且加入了 10%胎牛血清(FBS-胎牛血清(InvitiOgen Ltd, UK)、1%非必需氨基酸(NEAA (IOOx)-非必需氨基酸，PAA, Pasching, Austria)、1%L-谷氨酸胺(IOOx) (InvitrogenLtd, UK)和1%青霉素/链霉素(5000U/ml青霉素和5000 μ g/ml链霉素，InvitrogenLtd，UK)。对于基因表达研究，将细胞接种在6-孔平板中并生长至亚铺满(最大60%)。
[0133]之后，从细胞中抽出培养基,用具有Cyanidium caldarium提取物的新鲜培养基置换。培养基中Cyanidium caldarium提取物的终浓度为IOOppm(=100 μ g/ml,基于Cyanidium caldarium提取物干物质重)。作为对照,将培养物在无活性物质的仅具有培养基(运载体)的条件下生长。所有培养均一式三份进行(3个生物学复制样品)。
[0134]在细胞已经培养24小时后，抽出培养基，通过加入RNeasy裂解缓冲液(Qiagen, Hilden, Germany)使细胞裂解。根据厂商指导分离总RNA。简而言之,利用RNeasyMini试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)分离总RNA。所述RNA质量通过Agilent2100生物分析仪和Agilent RNA6000Nano试剂盒(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)确定。集合三个生物学复制样品，集合的样品的浓度通过在260/280nm的光度测量确定。
[0135]基因表达通过利用Affymetrix GeneChip表达分析包括标准数据评估，根据厂商指导进行分析(Human Genel.0ST Array, Expression ConsoleSoftware, AFFYMETRIX, INC.，Santa Clara, CA, USA)。
[0136]结果示于表1。
[0137]表1:在应用 IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干
物质重的浓度)之后24小时在人皮肤成纤维细胞中至少2倍上调或下调的基因概述
[0138]
【权利要求】
1.生产4-氨基丁酸的方法，包括如下步骤: A)在水性培养基中培养Cyanidiumcaldarium细胞， B)如果需要,破坏Cyanidiumcaldarium细胞， C)除去固体细胞成分以获得提取物，及如果需要， D)进一步纯化所述4-氨基丁酸。
2.生产包含4-氨基丁酸的提取物的方法，包括如下步骤: A)在水性培养基中培养Cyanidiumcaldarium细胞， B)如果需要,破坏Cyanidiumcaldarium细胞， C)除去固体细胞成分，以获得提取物。
3.制备包含4-氨基丁酸的化妆品配制品的方法，包括如下步骤: A)在水性培养基中培养Cyanidiumcaldarium细胞， B)如果需要,破坏Cyanidiumcaldarium细胞， C)除去固体细胞成分，以获得提取物，及 E)将破坏的Cyanidiumcaldarium细胞和/或提取物掺入化妆品配制品中。
4.前述权利要求中至少一项的方法，特征在于步骤C)中的提取物是水性提取物。
5.前述权利要求中至少一项的方法,特征在于步骤A)中的Cyanidiumcaldarium细胞在升高的温度下培养。
6.前述权利要求中至少一项的方法，特征在于步骤A)中的水性培养基在25°C的pH为1.5-6ο
7.前述权利要求中至少一项的方法，特征在于步骤B)中的细胞破坏是在水性培养基中进行的。
8.前述权利要求中至少一项的方法，特征在于步骤B)中的细胞破坏是热水破坏组合酶促细胞破坏。
9.前述权利要求中至少一项的方法，特征在于在步骤C)中除去固体细胞成分是通过离心、沉降或过滤方法进行的。
10.通过权利要求2及4-9中至少一项的方法可获得的提取物，特别是水性提取物。
11.权利要求10的提取物，特征在于其包含0.01%-10%重量的Cyanidium caldarium细胞成分干物质，及如果需要则包含0.01%-7%重量的防腐剂。
12.包含GABA的化妆品配制品， 其可通过权利要求3-9的至少一项的方法获得， 其包含权利要求10或11的提取物，或者 其包含 Cyanidium caldarium 细胞和 / 或 Cyanidium caldarium 细胞成分。
13.权利要求12的化妆品配制品，其具有抗炎作用。
14.Cyanidium caldarium细胞或Cyanidium caldarium细胞成分或者权利要求10或11的提取物在制备化妆品配制品中的应用。
15.Cyanidium caldarium细胞或Cyanidium caldarium细胞成分或者权利要求10或11的提取物在用于敏感性、干性、发痒和/或脱屑皮肤的化妆品配制品中的化妆应用。
16.Cyanidium caldarium细胞或Cyanidium caldarium细胞成分或者权利要求10或11的提取物在减轻皮肤粗糙、 减少皮肤鳞屑、减少深皱纹及增强皮肤弹性、皮肤紧实性及皮肤厚度的化妆品配制品中的化妆应用。
17.Cyanidium caldarium细胞或Cyanidium caldarium细胞成分或者权利要求10或11的提取物在用于对下颌、胸部、臀部和腹部的修型化妆处理的化妆品配制品中的化妆应用。
18.Cyanidium caldarium细胞或Cyanidium caldarium细胞成分或者权利要求10或11的提取物在用于增加毛发稳定性、强度、色度和抗性的化妆品配制品中的化妆应用。
19.Cyanidium caldarium细胞或Cyanidium caldarium细胞成分或者权利要求10或11的提取物在 用于维持皮肤干细胞功能的化妆品配制品中的化妆应用。
【文档编号】A61K8/97GK103930560SQ201280040256
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2011年8月18日
【发明者】T·克勒, J·席尔德, M·门特尔, P·莱尔施, M·法尔维克, C·魏特迈尔 申请人:赢创德固赛有限公司