形成金黄色葡萄球菌表位结合位点的肽或肽的组合的制作方法
【专利摘要】本发明关注形成金黄色葡萄球菌表位结合位点的肽或肽的组合，所述结合位点包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中，所述第一氨基酸序列与序列SEQ?ID?NO:1至少88%一致；并且其中，所述第二氨基酸序列与序列SEQ?ID?NO:2至少88%一致。
【专利说明】形成金黄色葡萄球菌表位结合位点的肽或肽的组合
【技术领域】
[0001]本发明关注形成金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus=S.aureus)表位结合位点的肽或肽的组合(arrangement of peptides)、含有该肽或肽的组合的试剂盒、该肽或肽的组合的用途、生产包含该肽或肽的组合的抗体的细胞系、以及治疗方法。
【背景技术】
[0002]从W02010/133600A1中知晓了针对金黄色葡萄球菌IsaA表位的抗体或其片段。这些抗体具有由具有第一可变区的重链和具有第二可变区的轻链所形成的结合位点，其中，所述第一可变区的序列可为SEQ ID NO: 13，所述第二可变区的序列可为SEQ IDNO: 14。在哺乳动物中针对(vis-0-vis)金黄色葡萄球菌的抗体的效力取决于由吞噬血细胞(phagocytizing blood cells)通过吞曬对金黄色葡萄球菌的杀灭。由W02010/133600A1中已知的抗体促进了吞噬过程。相比非特异性的对照抗体，在有IsaA表位特异性抗体存在的情况下孵育30分钟后，由人中性粒细胞造成的金黄色葡萄球菌的杀灭增强了约25%-30%。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供金黄色葡萄球菌表位结合位点，所述金黄色葡萄球菌表位结合位点在关于由吞噬血细胞杀灭金黄色葡萄球菌的抗体或抗体片段中非常有效，因此非常适于由金黄色葡萄球菌所引起的感染的治疗。此外，所述结合位点应该非常适于金黄色葡萄球菌的检测。本发明的另一目的为提供含有所述结合位点的试剂盒，所述结合位点的用途,分泌包含所述结合位点的抗体、抗体片段、ScFv或ScFvFc的细胞系，以及治疗方法。
·[0004]该目的由权利要求1、9、16、17、18和19的主题解决。本发明的实施方式公开于权利要求2-8、10-15和20-24中。
[0005]根据本发明，提供了形成金黄色葡萄球菌表位结合位点的肽或肽的组合，所述结合位点包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列。所述第一氨基酸序列与序列SEQ ID NO:1至少88% —致；所述第二氨基酸序列与序列SEQ ID NO:2至少88% —致。
[0006]在实施方式中，所述第一氨基酸序列与序列SEQ ID NO:1至少90%—致，特别是至少92.5% 一致、特别是至少95% —致、特别是至少97.5% 一致、特别是100% —致。所述第二氨基酸序列与序列SEQ ID NO: 2至少90% —致，特别是至少92.5% 一致、特别是至少95% —致、特别是至少97.5% 一致、特别是100% —致。
[0007]所述第一氨基酸序列可为抗体或抗体片段的重链的一部分；和/或所述第二氨基酸序列可为抗体或抗体片段的轻链的一部分。在这种情况下，所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列形成所述抗体或抗体片段的可变区。所述结合位点也可由单链可变片段(single chain variable fragment)形成。在这种情况下,所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列由单链可变片段(scFv)构成，或由含有抗体的Fe片段的单链可变片段(scFvFc)构成。Fe片段增强了 scFvFc所结合的金黄色葡萄球菌的吞噬。
[0008]本发明人改进了出自W02010/133600A1的抗体之一的结合区域，由此开发出了相比该已知抗体而言在肝素化人全血中更有效支持由吞噬血细胞通过吞噬来杀灭金黄色葡萄球菌的结合位点。从下述比对可以看出，序列SEQ ID NO:1与出自W02010/133600A1的相应序列SEQ ID NO: 13在118个氨基酸中有17个氨基酸不同；序列SEQ ID NO:2与出自W02010/133600A1的相应序列SEQ ID NO: 14在113个氨基酸中有8个氨基酸不同:
[0009]SEQ ID NO:I EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLENVSDINGNGGSTYY 60
[0010]V L ESGGGLV GGSL LSC ASGFTFSNYYMSffVRQ P K LE V DINGNGGSTYY
[0011]SEQ ID NO: 13 MADV^VESGGGLVKLGGSLKLSCSASGFTFSNYYMSWVRQTPEKRLELVADINGNGGSTYY 62
[0012]SEQ ID NO:I PDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRRGGYYALDYWGQGTTVTVSS 118
[0013]PDTVKGRFTISRDN KNTLYLQM SL EDTA YYCVRRGGYYALDYffGQGTTVTVSS
[0014]SEQ ID NO: 13 PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCVRRGGYYALDYWGQGTTVTVSS 120
[0015]SEQ ID NO:2 DWMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRF 60
[0016]DVVMTQTPLSL V G ASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSP LLIYRVSNRF
[0017]SEQ ID NO:14 DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRF
[0018]iEQ ID NO:2 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKLELKR 113
[0019]SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISFVEAED GVY CSQSTHVPffTFGGGTKLELKR·[0020]SEQ ID NO:14 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLELKR 113[0021 ] 一致的氨基酸在序列间的空隙中显示出。
[0022]含有包含所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列的可变区的抗体对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌中的免疫显性(immunodominant)结构IsaA表现出高亲和力，并对于与这一结构的结合显示出高特异性。
[0023]所述抗体可为单克隆抗体,特别是IgG型的抗体,特别是IgGl型、IgG2型或IgG4型的抗体。所述片段可为Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab’片段、或F(ab’)2片段。这些片段对金黄色葡萄球菌的检测尤其有用，因为金黄色葡萄球菌的细胞壁含有蛋白A，该蛋白A经由免疫球蛋白的Fe部分非特异性地结合免疫球蛋白。
[0024]在本发明的实施方式中，所述抗体是在细胞系、特别是昆虫细胞系或哺乳动物细胞系、特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或杂交瘤细胞系的细胞中生产的重组抗体。所述抗体中不是由所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列形成的部分与人抗体的相应部分至少85% —致，特别是至少90% —致、特别是至少92.5% 一致、特别是至少95% —致、特别是至少97.5%—致、特别是100%—致。所述抗体的轻链可包含序列SEQ ID NO:6、特别是序列SEQ ID NO:7 ;重链可包含序列SEQ ID NO:4、特别是序列SEQ ID N0:5，序列SEQ ID N0:9、特别是序列SEQ ID NO: 10，或序列SEQ ID NO: 11、特别是序列SEQ ID NO: 12。序列SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 12 包含前导序列(leader sequence) SEQID勵:8，所述前导序列来自皿^063 (KV3A9_小鼠的IgK链V-1II)。这一前导序列使得能够在哺乳动物细胞中得以良好表达。序列SEQ ID N0:4包含序列SEQ ID NO:1和IgGl重链(人Y I同种异型Gml, 17)。序列SEQ ID N0:6包含序列SEQ ID N0:2和IgG轻链K。序列SEQ ID N0:9包含序列SEQ ID NO:1和IgG2重链(同种异型G2m(23))。序列SEQ IDNO: 11包含序列SEQ ID NO:1和IgG4重链。
[0025]根据本发明的肽或肽的组合可用作药物。特别是，它们可用作用于治疗如下人类或动物的药物:具有金黄色葡萄球菌感染、特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染的人类或动物；或处于受到此类感染的风险中的人类或动物。就本发明而言，所述治疗包括预防(prophylaxis)。所述动物可为哺乳动物。所述人类或动物可具有乳腺炎(mastitis);金黄色葡萄球菌菌血症(bacteremia)、特别是原发性菌血症或继发性菌血症；血流感染(blood stream infection)、特别是原发性血流感染或继发性血流感染；假体感染(prosthetic infection);移植物感染(graft infection);软组织感染；手术相关的感染；婴儿或新生儿感染；透析相关的感染；肺炎；骨感染；或由感染引起的脓毒症(sepsis)。所述乳腺炎可为牛乳腺炎。如果奶牛具有牛乳腺炎，该奶牛生产不出可用的牛奶；而如果根据通常情况用抗生素对该奶牛进行治疗，该奶牛所生产的牛奶必须被丢弃，直至在该奶牛的牛奶中不含有抗生素。常规治疗的这一缺点可通过将根据本发明的肽或肽的组合作为用于治疗牛乳腺炎的药物得以避免。
[0026]所述肽或肽的组合可以与针对金黄色葡萄球菌的至少一种另一表位的至少一种其它肽或肽的组合一起存在于混合物中。该另一表位可位于表位(即IsaA)所处的抗原上，或位于另一抗原上。相比使用仅含有根据本发明的肽或肽的组合的药物，使用此类混合物作为药物可能更高效。这可归因于金黄色葡萄球菌的高变异性引起不同菌株上抗原不同程度的表达，因此，相比仅由抗体或片段识别的细菌，更多细菌被抗体或片段的混合物识别出。
[0027]所述肽或肽的组合可以与至少一种抗生素一起存在于混合物中。在待用所述药物治疗的人类或动物中，除普通的金黄色葡萄球菌外，可能还存在突变的金黄色葡萄球菌。所述突变的金黄色葡萄球菌可能具有不能被根据本发明的肽或肽的组合识别的突变IsaA。在这种情况下，所述抗生素可有效地对抗该突变的金黄色葡萄球菌。
[0028]根据本发明的肽或肽的组合可以与哺乳动物、特别是人类的血浆或血液一起存在于混合物中。本发明人发现，相比包含于盐溶液中的根据本发明的肽或肽的组合，与血浆混合的根据本发明的肽或 肽的组合可有效得多。
[0029]所述药物可以是被制备用于全身应用和/或局部应用的药物。本发明人认识到，用根据本发明的肽或肽的组合治疗严重金黄色葡萄球菌感染使得死亡率和被治疗的人类或动物器官中的金黄色葡萄球菌数显著减少。
[0030]本发明还关注含有根据本发明的肽或肽的组合的用于金黄色葡萄球菌的检测、特别是高特异性检测的试剂盒。
[0031]本发明进一步关注根据本发明的肽或肽的组合在金黄色葡萄球菌的检测、特别是高特异性检测中的用途。
[0032]另外，本发明关注生产上面详述的抗体、抗体片段、ScFv或ScFvFc的细胞系，特别是昆虫细胞系或哺乳动物细胞系、特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或杂交瘤细胞系。
[0033]本发明进一步关注治疗人类或动物的方法，所述人类或动物具有金黄色葡萄球菌感染、特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染；或者处于受到此类感染的风险中，其中，将根据本发明的肽或肽的组合给予所述人类或动物。将所述肽或肽的组合以如下剂量给予:足以减少所述人类或动物中的金黄色葡萄球菌的量；或者足以清除所述人类或动物中的金黄色葡萄球菌。可将所述肽或肽的组合与合适的载体进行混合。
[0034]所述人类或动物可患有乳腺炎；金黄色葡萄球菌菌血症、特别是原发性菌血症或继发性菌血症；血流感染、特别是原发性血流感染或继发性血流感染；假体感染；移植物感染；软组织感染；手术相关的感染；婴儿或新生儿感染；透析相关的感染；肺炎；骨感染；或由感染引起的脓毒症。
[0035]所述肽或肽的组合可以与针对金黄色葡萄球菌的至少一种另一表位的至少一种其它肽或肽的组合一起存在于混合物中。在给予之前，所述肽或肽的组合可以与哺乳动物、特别是人类的血浆或血液混合。所述肽或肽的组合可局部给予或全身给予，特别是静脉内给予、肺内给予、腹膜内给予、经鼻给予或舌下给予。它们也可与至少一种抗生素一起给予。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1示出测定不同抗IsaA抗体与IsaA抗原结合的竞争ELISA结果。
[0037]图2示出测定不同抗IsaA抗体与不同金黄色葡萄球菌菌株结合的细菌细胞ELISA。
[0038]图3示出对在肝素化人全血中由吞噬血细胞通过吞噬所杀灭的金黄色葡萄球菌菌株Newman的定量。
[0039]图4示出对来自健康血液供体(n=15)的肝素化人全血中由吞噬血细胞通过吞噬所杀灭的金黄色葡萄球菌菌株Newman的定量。
[0040]图5示出对来自透析患者的肝素化人全血中由吞噬血细胞通过吞噬所杀灭的金黄色葡萄球菌菌株Newman的定量。
[0041]图6示出在HL-60细胞中，在有两种浓度的抗IsaA抗体UK66-2以及同种型对照存在的情况下，对生物发光的金黄色葡萄球菌菌株Newman (Newlux)的调理吞卩遼杀灭。
【具体实施方式】
`[0042]在大肠杆菌(E.coli)中表达含有序列 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3以及其它序列的ScFv分子，并在ELISA和竞争ELISA中测试其结合和亲和力。结果显示，含有序列SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的ScFv分子的亲和力比含有序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3的ScFv分子的亲和力高约10倍。
[0043]将用于表达完整抗体的载体构建体转染进CHO细胞。表达带有Igk前导序列SEQID NO:8的根据序列SEQ ID NO:4 (包含序列SEQ ID NO:1)的IgGl重链(人Y I同种异型Gml, 17)(产生序列SEQ ID N0:5)以及带有Igk前导序列SEQ ID NO:8的根据序列SEQ IDNO:6 (包含序列SEQ ID N0:2)的IgG轻链K (产生序列SEQ ID NO:7)来形成抗体UK66-2。为了研究同种型对功能活性的影响，合成IgG2和IgG4同种型。为此，将IgGl重链用带有Igk前导序列SEQ ID NO:8的根据序列SEQ ID NO:9的IgG2重链(同种异型G2m(23))(产生SEQ ID NO: 10)替代；或者用带有Igk前导序列SEQ ID NO:8的根据序列SEQ ID NO: 11的IgG4重链(产生SEQ ID NO: 12)替代。
[0044]在表达后，通过蛋白A柱将IgGl抗体从CHO细胞的上清液中纯化出。在ELISA、竞争ELISA、蛋白印迹以及免疫荧光中测试纯化抗体的结合动力学以及结合，并在吞噬分析中用人吞噬血细胞测试纯化抗体的功能。在功能分析中，含有序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2的抗体(UK66-2)增强了氧化粹发(oxidative burst);并且,相比已知抗体UK66,其对金黄色葡萄球菌的杀灭显著更强。[0045]使用麗ACOREi^OOO 系统(GE Healthcare Europe GmbH, MunzingerStrasse5, 79111Freiburg, Germany),借助于无标记的表面等离子体共振对IsaA与固定化抗体UK66-2的结合动力学进行测定。使用抗Fab抗体实施抗体UK66-2的可逆固定。相互作用分析使用 HBS-EP 缓冲液(IOmM HEPES pH7.4,150mM NaCl,3.4mM EDTA,0.005%Tween20)进行。记录25°C流速为30 μ 1/min时的传感图(sensorgrams)。
[0046]使用BIAevaluation软件4.0.1将获得的传感图拟合为1:1Langmuir结合模型，计算缔合(km)和解离(I^ff)的速率常数以及亲和力。以这样的方式，在两个独立测量中测定出解离常数Kd为4.8nM。测定出UK66-2和IsaA间相互作用的缔合和解离速率常数分别为 3.7 X IO5MY1 (kQn)和 1.8Χ10? (koff)。
[0047]图1显示测定不同抗IsaA抗体与可溶性重组IsaA抗原结合的竞争ELISA结果。450nm处的光密度表示所述抗体与IsaA的结合。加入不同浓度的可溶性IsaA。三条线表示用下列抗IsaA抗体获得的结果:
[0048]-0.01 μ M可溶性IsaA处上面的线:UK66 (出自W02010/133600A1的参比抗体)；
[0049]-0.01 μ M可溶性IsaA处中间的线:UK66_2(具有包含序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的结合位点的抗体)；
[0050]-0.01 μ M可溶性IsaA处下面的线:UK66_3(具有包含序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:3的结合位点的抗体)。
[0051]方法说明:
[0052]将Nunc-Maxisorp96 孔板用 50 μ I/ 孔的 IsaA (处于 I XPBS 中，0.5 μ g/ 孔)进行涂覆，并在4°C孵育过 夜。第二天，将板用含有0.05%Tween20的PBS pH7.4 (PBST)洗涤3次。洗涤后，通过添加200 μ 15%脱脂奶粉/PBS进行封闭，并在室温孵育lh。将孔用PBST(0.05%)洗涤2次，以0.4 μ Μ-0.01 μ M的系列浓度添加抗IsaA —抗。将抗IsaA-1gGl —抗稀释于2.5%脱脂奶粉/PBS中，并在37°C孵育lh。然后将孔用PBST (0.05%)洗涤3次，加入50 μ I以1:5000稀释于2.5%脱脂奶粉/PBS中的连接辣根过氧化物酶的二抗，并在37°C孵育 lh。将孔用 PBST (0.05%)洗涤 4 次，加入 50 μ I TMB (Thermo Scientific PierceELISA底物)，并在37 °C孵育15min。用100 μ I的IN H2SO4终止反应，用ELISA读板器对0D450nm处的底物反应的光密度进行分析。
[0053]图2示出测定不同抗IsaA抗体与金黄色葡萄球菌菌株USA300、SH1000、RN4220、E、MA12以及MA12isaA-的结合的细菌细胞ELISA。在MA12isaA_中，免疫显性结构IsaA被删除。在450nm处的光密度表明抗体与细菌细胞的结合。3个柱表示用下列抗IsaA抗体得到的结果:
[0054]-左柱:抗体UK66(参比抗体)；
[0055]-中柱:抗体UK66-2 ；
[0056]-右柱:抗体UK66-3。
[0057]方法说明:
[0058]在LB培养基中将金黄色葡萄球菌菌株在37°C培养过夜。通过在13000rpm离心Imin使细菌沉淀，并用PBS (磷酸盐缓冲盐水)进行洗涤。在离心步骤后，将沉淀重悬于Iml PBS中。制备含有5X IO7细菌/50 μ I的细菌悬浮液。用50 μ I/孔的细菌悬浮液涂覆Nunc-Maxisorp96孔板，并在4°C孵育过夜。第二天,用含有0.05%Tween20的PBS ρΗ7.4(PBST)将板洗涤3次。洗涤后，通过添加200 μ 15%脱脂奶粉/PBS进行封闭，并在室温孵育lh。将孔用PBST (0.05%)洗涤2次，添加抗IsaA —抗。将抗IsaA-1gGl —抗以1:2000稀释于2.5%脱脂奶粉/PBS中，以50 μ I/孔添加，并在37°C孵育lh。然后将孔用PBST(0.05%)洗涤3次，加入50 μ I以1:5000稀释于2.5%脱脂奶粉/PBS中的连接辣根过氧化物酶的二抗，并在37°C孵育lh。将孔用PBST (0.05%)洗涤4次，加入50 μ I TMB (ThermoScientific Pierce ELISA 底物)，并在 37°C孵育 15min。用 100 μ I 的 IN H2SO4 终止反应，用ELISA读板器对0D450nm处的底物反应的光密度进行分析。
[0059]图3显示对肝素化人全血中由吞噬血细胞通过吞噬所杀灭的金黄色葡萄球菌菌株Newman的定量。将细菌与肝素化人全血孵育30min。将在无抗体溶液的情况下孵育后所得的活细菌数设置为100% (左柱)。相比同种型对照抗体(中柱)，在有UK66-2存在(右柱)的情况下，杀灭显著增强。
[0060]方法说明:
[0061]在LB培养基中将金黄色葡萄球菌菌株Newman在37 °C培养过夜。通过在13000rpm离心Imin使细菌沉淀，并用PBS进行洗涤。重复离心步骤，并将沉淀重悬于Iml PBS中。制备5X IO7细菌/20 μ I的细菌溶液。将100 μ I肝素化血液加入1.5ml管中，在冰上保存。除含有细菌但不含有抗体的阴性对照样品外，加入20μ I细菌悬浮液和抗体溶液。将样品在杂交炉中于37°C孵育30min，伴随持续的旋转混合。通过将样品放置于冰上使吞噬停止。用0.1%新制备的Saponin裂解血细胞(在冰上20min)。制备两系列的样品稀释液。分别将20 μ IlO-2UO-3和10_4稀释液铺于LB板上，每种2份，并在37°C孵育24h。对克隆进行计数并计算杀灭，将无抗体溶液的血液中的活细菌数设置为100%。
[0062]图4示出对来自健康血液供体(n=15)的肝素化人全血中由吞噬血细胞通过吞噬所杀灭的金黄色葡萄球菌菌株Newman的定量。图5示出对来自透析患者(n=7)的肝素化人全血中由吞曬血细胞通过吞卩遼·所杀灭的金黄色葡萄球菌菌株Newman的定量。在两种情况下，将细菌与肝素化血液孵育60min。将在无抗体溶液的情况下孵育后所得到的活细菌数设置为100% (左散点“空白对照(placebo)”)。相比同种型对照抗体(第二散点“同种型对照[90(^8/!111]”)，在有皿66-2存在的情况下，杀灭显著增强(第三散点和第四散点“UK66-2[75y g/ml] ”和 “UK66-2 [900 μ g/ml])。
[0063]方法说明:
[0064]在LB培养基中将金黄色葡萄球菌菌株Newman在37 °C培养过夜。通过在13000rpm离心Imin使细菌沉淀，并用PBS进行洗涤。重复离心步骤，并将沉淀重悬于Iml PBS中。制备5X IO7细菌/20 μ I的细菌溶液。将100 μ I肝素化血液加入1.5ml管中，在冰上保存。除含有细菌但不含有抗体的阴性对照样品外，加入20μ I细菌悬浮液和抗体溶液。将样品在杂交炉中于37°C孵育60min，伴随持续的旋转混合。通过将样品放置于冰上使吞噬停止。用0.1%新制备的Saponin裂解血细胞(在冰上20min)。制备两系列的样品稀释液。分别将20 μ IlO-2UO-3和10_4稀释液铺于LB板上，每种2份，并在37°C孵育24h。对克隆进行计数并计算杀灭。将无抗体溶液的血液中的活细菌数设置为100%。
[0065]图6显示在HL-60细胞中，在有两种浓度的抗IsaA抗体UK66-2 (20μg/ml和200 μ g/ml)以及同种型对照(200 μ g/ml)存在的情况下，对生物发光的金黄色葡萄球菌(S.a.)菌株Newman (Newlux)的杀灭。通过测量生物发光来对存活细菌的相对数量进行测定。存活细菌表示为发光(RLU=相对光单位)。细菌杀灭与UK66-2是浓度依赖的，并且在同种型匹配的人IgGl对照抗体中并未观察到细菌杀灭。
[0066]方法说明:
[0067]使用怀有luxABCED操纵子的金黄色葡萄球菌菌株Newman的单个菌落，将其接种至5ml的LB培养基中。因为luxABCED操纵子在活细菌中引起发光，但在死细菌中不引起发光，因此发光与活细菌数相关。将细菌培养过夜，并将50 μ I该培养物用于接种至5ml补充有30 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中。将所述培养物在旋转摇荡器上以200rpm在37°C培养 4_6h。使用 Lumat LB9501 光度计(Berthold Technologies, Bad ffildbad, Germany)测定细菌的生物发光。当100 μ I的培养物所生成的生物发光信号在16000-24000相对光单位(RLU)之间时，所述培养物适于进行分析。培养后，将细菌在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中
洗涤2次，并将其以lX109/ml的终浓度重悬于Opt1-MEIVT培养基(Life Technologies,
Darmstadt，Germany)中。用0.8%DMF使吞噬性HL-60细胞分化5天，并在Opt1-MEM?中重悬至 I X IO8 细胞/ml,并在 96 孔组织培养板(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)中以50 μ I每孔进行接种。加入抗体溶液(50 μ 1)，随后加入100 μ I金黄色葡萄球菌(lX109/ml)。将HL-60细胞、抗体和细菌在37°C进行孵育，并以15min的间隔对生物发光持续测量240min,以测定最佳的信噪比(signal-noise ratio)。所有分析一式三份进行,并重复至少 3 次。使用多模式读板器 Infinite200Pro (TECAN，Mannedorf, Switzerland)测定生物发光。`
【权利要求】
1.形成金黄色葡萄球菌表位结合位点的肽或肽的组合，所述结合位点包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中，所述第一氨基酸序列与序列SEQ ID NO:1至少88%—致；并且其中，所述第二氨基酸序列与序列SEQ ID N0:2至少88%—致。
2.如权利要求1所述的肽或肽的组合，其中，所述第一氨基酸序列与序列SEQID NO:1至少90% —致，特别是至少92.5% 一致、特别是至少95% —致、特别是至少97.5% 一致、特别是100% —致；和/或其中，所述第二氨基酸序列与序列SEQ ID NO: 2至少90% —致，特别是至少92.5% 一致、特别是至少95% —致、特别是至少97.5% 一致、特别是100% —致。
3.如前述权利要求中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述第一氨基酸序列为抗体或抗体片段的重链的一部分，和/或所述第二氨基酸序列为抗体或抗体片段的轻链的一部分；或者其中，所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列由单链可变片段(scFv)构成，或由含有抗体的Fe片段的单链可变片段(scFvFc)构成。
4.如权利要求3所述的肽或肽的组合，其中，所述抗体为单克隆抗体，特别是IgG型的抗体，特别是IgGl型、IgG2型或IgG4型的抗体。
5.如权利要求3或4所述的肽或肽的组合，其中，所述片段为Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab’片段、或F(ab’)2片段。
6.如权利要求3-5中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述抗体是在细胞系、特别是昆虫细胞系或哺乳动物细胞系、特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或杂交瘤细胞系的细胞中生产的重组抗体。
7.如权利要求3-6中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述抗体中不是由所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列形成的部分与人抗体的相应部分至少85% —致，特别是至少90% —致、特别是至少·92.5% 一致、特别是至少95% —致、特别是至少97.5% 一致、特别是100%—致。
8.如权利要求3-7中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述轻链包含序列SEQIDN0:6、特别是序列SEQ ID NO: 7 ;以及所述重链包含序列SEQ ID NO:4、特别是序列SEQ IDN0:5，序列 SEQ ID N0:9、特别是序列 SEQ ID N0:10，或序列 SEQ ID N0:11、特别是 SEQ IDNO:12。
9.如前述权利要求中任一项所述的肽或肽的组合作为药物的用途。
10.如权利要求9所述的肽或肽的组合，其中，所述药物为治疗如下人类或动物的药物:具有金黄色葡萄球菌感染、特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染的人类或动物；或处于受到此类感染的风险中的人类或动物。
11.如权利要求10所述的肽或肽的组合，其中，所述人类或动物患有乳腺炎、金黄色葡萄球菌菌血症、血流感染、假体感染、移植物感染、软组织感染、手术相关的感染、婴儿或新生儿感染、透析相关的感染、肺炎、骨感染、或由感染引起的脓毒症。
12.如权利要求9-11中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述肽或肽的组合与针对金黄色葡萄球菌的至少一种另一表位的至少一种其它肽或肽的组合一起存在于混合物中。
13.如权利要求9-12中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述肽或肽的组合与至少一种抗生素一起存在于混合物中。
14.如权利要求9-13中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述肽或肽的组合与哺乳动物、特别是人类的血浆或血液一起存在于混合物中。
15.如权利要求9-14中任一项所述的肽或肽的组合，其中，所述药物为用于全身应用和/或局部应用的药物。
16.含有如权利要求1-8中任一项所述的肽或肽的组合的用于金黄色葡萄球菌的检测的试剂盒。
17.如权利要求1-8中任一项所述的肽或肽的组合在金黄色葡萄球菌的检测中的用途。
18.生产如权利要求3-8中任一项所述的抗体、抗体片段、ScFv或ScFvFc的细胞系。
19.治疗人类或动物的方法，所述人类或动物具有金黄色葡萄球菌感染、特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染，或者处于受到此类感染的风险中，其中，将如权利要求1-8中任一项所述的肽或肽的组合给予所述人类或动物。
20.根据权利要求19的方法，其中，所述人类或动物患有乳腺炎、金黄色葡萄球菌菌血症、血流感染、假体感染、移植物感染、软组织感染、手术相关的感染、婴儿或新生儿感染、透析相关的感染、肺炎、骨感染、或由感染引起的脓毒症。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中，所述肽或肽的组合与针对金黄色葡萄球菌的至少一种另一表位的至少一种其它肽或肽的组合一起存在于混合物中。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，在给予之前，将所述肽或肽的组合与哺乳动物、特别是人类的血浆或血液混合。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，所述肽或肽的组合局部给予或全身给予，特别是静脉内给予、肺内给予、腹膜内给予、经鼻给予或舌下给予。`
24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中，所述肽或肽的组合与至少一种抗生素一起给予。
【文档编号】A61P31/04GK103857697SQ201280046452
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年9月21日 优先权日:2011年9月23日
【发明者】克努特·奥尔森, 尤多·洛伦茨, 罗兰·E·孔特尔曼 申请人:伍兹堡尤利乌斯－马克西米利安斯大学